Summary
Pogingen om de cystische fibrose transmembraan geleidingsregulator (CFTR) drukken in
Abstract
De cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is een chloride kanaal, dat wanneer gemuteerd, kan aanleiding geven tot cystische fibrose in humans.There is dan ook grote belangstelling voor dit eiwit, maar de inspanningen om de structuur en de activiteit te bestuderen werden gehinderd door de moeilijkheid te drukken en zuiveren voldoende hoeveelheden van het eiwit 1-3. Net als veel andere 'moeilijke' eukaryote membraaneiwitten, expressie in een snel groeiende organisme is wenselijk, maar uitdagend, en in de gist S. cerevisiae, voorzover geringe hoeveelheden werden verkregen en een snelle afbraak van het recombinante eiwit werd waargenomen 4-9. Eiwitten die bij de verwerking van recombinante CFTR in gist zijn beschreven 6-9. In dit verslag een methode beschreven voor de expressie van CFTR in gist en zuivering in significante hoeveelheden. Het protocol beschrijft hoe de eerdere proteolyse problemen kunnen worden opgelost en hoe expressie vanCFTR kan sterk worden verbeterd door aanpassing van de celgroei voorwaarden en het regelen van de inductie omstandigheden, met name de periode vóór cel oogsten. De reagentia in verband met dit protocol (muizen CFTR tot expressie gistcellen of gist plasmiden) zal verdeeld worden via de Amerikaanse Cystic Fibrosis Foundation, die sponsor van het onderzoek. Een artikel beschrijft het ontwerp en de synthese van het CFTR-construct die in dit rapport worden afzonderlijk gepubliceerd (Urbatsch, I.;. Thibodeau, P. et al., niet gepubliceerd). In dit artikel leggen we uit onze methode begint met de transformatie van de gistcellen met de CFTR te bouwen - bevattende gist plasmide (afb. 1). Het construct is een groen fluorescerend eiwit (GFP) sequentie gefuseerd aan CFTR op de C-terminus en volgt ontwikkeld door Drew et al.. (2008) 10. Het GFP kan de expressie en zuivering van CFTR relatief gemakkelijk worden gevolgd. De Jupiter gevisualiseerd protocolol is beëindigd na de bereiding van microsomen van de gistcellen, ook al nemen we een aantal suggesties voor de zuivering van het eiwit uit de microsomen. Lezer wenst eigen wijzigingen aan de microsoom zuiveringsprocedure, afhankelijk van de uiteindelijke experimenten uitgevoerd met het eiwit en de lokale materiaal ter beschikking. De gist-uitgedrukt CFTR eiwit kan gedeeltelijk worden gezuiverd met behulp van metaal-ion affiniteitschromatografie, met behulp van een intrinsieke polyhistidine zuivering tag. Na grootte-exclusie chromatografie levert een eiwit dat lijkt> 90% zuiver zoals beoordeeld door SDS-PAGE en Coomassie-kleuren van de gel.
Protocol
1. Voorbereiding van de media en buffers
- YNB: Voor een liter, 6,9 g gist basis van stikstof op te schorten zonder aminozuren en 0,77 g complete aanvulling mengsel zonder uracil in 1 l water. Autoclaaf. Bewaar bij 4 ° C.
- YNBA: Voor 400 ml, 2,76 g gist basis van stikstof op te schorten zonder aminozuren, 0,38 g complete aanvulling mengsel zonder uracil en 8g bacteriologische agar-agar in 350 ml water. Autoclaaf. Mix 8 g glucose met 50 ml water en licht verhitten totdat het is opgelost. Steriliseren door een 0,2 pm filter en aan de YNBA terwijl de agar wordt gesmolten. Bewaar bij kamertemperatuur.
- 20% glucose medium: Voor 500 ml, 100 g glucose voorzichtig mengen met 500 ml YNB en verwarm totdat het is opgelost. Met behulp van een 0,2 uM filter in een steriele Duran fles. Bewaar bij kamertemperatuur.
- 20% galactose medium: Voor 2 liter, meng 400 g galactose met 2l YNB en licht verhitten totdat het is opgelost. Met behulp van een 0,2 pm filter in een steriele Duran fles. Bewaren bij kamertemperatuur humeurARD.
- Proteaseremmer voorraden: CFTR is zeer gevoelig voor proteolyse 4. De auteurs vonden de volgende remmers effectief te zijn in het beperken van proteolyse, maar lezers kunnen wensen af te stemmen deze lijst aan hun eigen eisen te voldoen. Winkel in 100 ul fracties bij -20 ° C vries-dooi te verminderen. Alle remmers moeten verdund worden uit de voorraad oplossingen voor de werkende concentratie, zoals hieronder:
| Inhibitor | Stock Concentratie | Stock Voorbereiding | Werken Concentratie |
| AEBSF | 200 mM | Los 48mg in 1 ml gedestilleerd water | 0,2 mM |
| Benzamidine | 300 mM | Los 36mg in 1 ml gedestilleerd water | 0,3 mM |
| Chymostatin | 4 mM | Los 2,5 mg in 1 ml droge DMSO | 4 pM |
| E-64 | 7 mM | Los 2,5 mg in 1 ml gedestilleerd water | 7 urn |
| Leupeptine | 20 mM | Los 10 mg in 1 ml gedestilleerd water | 20 uM |
| Pepstatine A | 15 mM | Los 10 mg in 1 ml droge DMSO | 15 uM |
| PMSF | 1 M | Los 174mg in 1 ml droge DMSO | 1 mM |
- DTT (1 M): los 154 mg dithiotreïtol in 1 ml gedestilleerd water. Bewaren bij -20 ° C. Gebruik in 1:1000 verdunning in buffers aangegeven.
- EDTA (0,5 M): Mix 29,22 g ethyleendiaminetetraazijnzuur met 100 ml water. Voeg 10 N NaOH toegedruppeld totdat alle EDTA is opgelost en de pH bereikt 8. Vul aan tot 200 ml met water en passeren door een 0,2 um filter in een steriele Duran fles. Bewaar bij kamertemperatuur.
- CRB (300 mM Tris-HCl,pH 7,4, 0,56 M sorbitol, 1 mM EDTA) Los 18,17 g Tris-base in 350 ml water en de pH op 7,4 door toevoeging van HCl. Voeg 51,35 g sorbitol en maak het volume tot 500 ml met water. Autoclaaf. Voeg 1 ml EDTA stockoplossing en bewaar bij 4 ° C.
- CFTR buffer (50 mM Tris, pH 8,0, 10% v / v glycerol) opgelost 6,06 g Tris-base in 500 ml water. Pas de pH op 8 met HCl, voeg 100 ml glycerol en vul aan tot 1 L met water. Autoclaaf en bewaar bij 4 ° C.
- 2x belasting kleurstof: 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 5% glycerol, 5 mM EDTA (pH 8,0), 0,02% broomfenolblauw, 4% SDS, 0,05 M DTT. Maak 10 ml, hoeveelheid en bewaar bij -20 ° C.
2. Screening Transformanten
Dit protocol wordt aangenomen dat de CFTR-GFP-8His fusiegen werd ingebracht in een gistplasmide stroomafwaarts een GAL1 galactose promoter (Fig. 1) en de plasmide werd getransformeerd in FGY217 cellen, PEP4 deletiemutant van S. cerevisiae 10 et al.. (2008) 10.
- Pick 5-10 goed gescheiden kolonies is van een omzetting plaat. Breng elke kolonie aan een aparte steriele 50 ml Falcon buis met 9 ml YNB en 1 ml 20% glucose medium. Voor deze stap is het belangrijk om een eindconcentratie van 2% glucose (g / v) in de cultuur celgroei te handhaven. Groei overnacht 16 uur bij 250 rpm, 30 ° C in een orbitale schudincubator.
- Merk glycerol voorraden voor elk van de gescreende kolonies. Aseptische wijze 0,8 ml van de 's nachts culturen tot 0,2 ml steriele glycerol in het label schroef-top flacons, vortex kort en bewaar bij -80 ° C.
- Verdun de resterende nacht culturen tot een eindvolume van 50 ml in YNB, waaronder 250 pi 20% glucose medium.Voor deze stap is het belangrijk om de glucose concentratie te verdunnen tot ongeveer 0,1% (w / w) in de kweek omdat hoge glucose onderdrukken de GAL1 promoter 10. Grow culturen in het label 250 ml Erlenmeyer kolven verbijsterd aan een OD 600 van 0,7-0,8 bij 250 rpm, 30 ° C in een orbitale schudden incubator.
- Induceren de culturen door toevoeging van 5 ml 20% galactose medium aan elke kolf en groeien op 16 uur.
- Bevestig de uitdrukking van CFTR met behulp van fluorescentie microscopie. Neem 100 ul van cultuur en voeg 100 ul glycerol naar cel mobiliteit te beperken in oplossing. Analyseer cellen op een Delta Vision RT restauratie microscoop (of vergelijkbaar), met behulp van een blauwe laser onder een FITC-filter (excitatie golflengte van 490 nm en emissie golflengte van 528-538 nm). Positieve expressie van het CFTR-GFP-eiwit moet zichtbaar als een ring van fluorescentie in de plasmamembraan van de gistcellen. Getransformeerde gistcellen kan worden gebruikt als een controle.
- Breng deculturen in 50 ml Falcon buis. Oogst de cellen door centrifugeren bij 3500 xg, 4 ° C gedurende 10 minuten in een tafelmodel centrifuge. Terwijl de centrifuge draait, voor te bereiden 2 ml microfugebuisje buizen met schroefdoppen met ongeveer 500 pi met zuur gewassen glasparels en leg ze op ijs. Gooi de supernatanten en resuspendeer elke pellet in 500-800 ul ijskoude CRB met proteaseremmers. Breng de schorsingen van de microfugebuizen buizen met de kralen en blijf op ijs.
- Lyseren van de cellen door krachtig schudden / vortexen elk microfugebuis 10 periode van 30 seconden, rusten op ijs tussen perioden. Een beadbeater kan worden gebruikt als een alternatief, bijvoorbeeld een BioSpec mini beadbeater bediend gedurende 3 minuten.
- Plaats de buizen in een microcentrifuge benchtop en centrifuge bij 3500 xg, 4 ° C gedurende 5 minuten. Breng de supernatanten met de ruwe membraan bevolking microcentrifuge buizen en plaats schoon te maken op het ijs. Voeg 500 ul vers ijs-cold CRB met protease-remmers aan elke buis en herhaal het proces om de membranen te accumuleren.
- Verzamelt de ruwe membranen door spinnen bij maximale snelheid, 4 ° C in een microcentrifuge benchtop gedurende 2 uur. Verwijder het supernatant en resuspendeer elke pellet in 50 ul ijskoud CFTR buffer.
- In schoon microcentrifuge buizen mix 15 pi van elke suspensie met 15 pi 2x belasting kleurstof door en neer te pipetteren. Incuberen bij kamertemperatuur 10 minuten. Niet laten koken de monsters, aangezien hierdoor CFTR en andere membraaneiwitten aan SDS-onoplosbare aggregaten te vormen en ook denaturatie van de GFP-tag.
- Plaats de monsters met PageRuler Plus prestained eiwit standaarden (Fermentas) op een 4-20% Tris / Glycine gradiënt gel (NuSep) en uitgevoerd op 150 V gedurende 40 minuten tot de kleurstof-front is aan de onderzijde van de gel.
- Bepaal de hoogste expresserende cellen door in-gel fluorescentie. Plaats een fluorescentie beeldvorming zoals een Typhoon scanner. Scan de gel uzing blauwe laser bij een golflengte van 488 nm en een emissiegolflengte van 526 nm. De CFTR-GFP fusie moet zichtbaar ongeveer 220 kDa. Ook zal een zwak fluorescerende band zichtbaar 70 kDa die waarschijnlijk een intrinsieke gist FAD bevattende membraaneiwit (zoals succinaat dehydrogenase subunit A) 11,12.
- Vlekken op de gel met Coomassie, destain en scan de gel ter vergelijking met de fluorescentie scan met behulp van een handige beelden te bekijken softwarepakket. De Coomassie-gekleurde gel zorgt voor een relatieve beoordeling van de CFTR-GFP expressie niveaus in verschillende klonale lijnen na normalisatie voor een bedrag van totaal eiwit geladen op elke track van de gel.
- Streak uit de hoogste uitdrukking cellijn uit zijn glycerol voorraad (2.2) op een verse YNBA plaat en incuberen bij 30 ° C gedurende 2-3 dagen. Deze plaat kan vervolgens worden opgeslagen tot 2 weken bij 4 ° C.
3. Grootschalige fermentatievat Culture
- Bereid pre-culturen voor de vergister. Schraap een 1 cm 2-gebied van de cellen van de YNBA plaat (2,13) met een steriele lus aan 45 ml YNB en 5 ml 20% glucose medium, zodat de OD 600 is ongeveer 0,1. Groei in 250 ml Erlenmeyer kolven verbijsterd bij 250 rpm, 30 ° C in een orbitale schudden incubator tot de OD 600 bereikt 1.
- Splits de cultuur tussen de twee 2 verbijsterd l erlenmeyers met elk 450 ml YNB en 25 ml 20% glucose medium. Groei op deze bij 250 rpm, 30 ° C in een orbitale schudincubator tot OD 600 bereikt 1.2.
- Hoewel deze pre-culturen groeien, het opzetten van de vergister. Merk 11.2l van YNB zoals beschreven in 1.1, maar los van een extra 8,28 g YNB en 0,95 g uitval supplement te compenseren voor de toevoeging van glycerol bij inductie. Voeg aseptisch de 11,2 l YNB en 75 ml 20% glucose medium om een steriele 20l vergister schip en pas de bedrijfstemperatuur30 ° C.
- Aseptisch de precultures de fermentor en zet de roersnelheid tot ongeveer 800 rpm en de temperatuur op 30 ° C. Perslucht moet de stroming tegen ongeveer 15 dm 3 min -1. Als de vergister cultuur op een OD 600 van 1.2, leiden door het aseptisch toevoegen van 1,5 liter YNB 20% galactose-oplossing en 1,2 l glycerol. De temperatuur tot 25 ° C en groeien de cultuur 16 uur.
- Breng de vergister inhoud in gekoelde 1l centrifuge potten op het ijs met behulp van een peristaltische pomp. Oogst de cellen door centrifugeren bij 3500 xg, 4 ° C gedurende 30 minuten in een grote capaciteit rotor (bijvoorbeeld 6 liter). Resuspendeer de cellen in 150 ml ijskoud CRB met proteaseremmers. Vanaf hier moeten alle werkzaamheden worden uitgevoerd bij 4 ° C.
- Lyseren van de cellen door passage door een constante Systems cel disrupter in vier doorgangen bij 25, 30, 32 en 35 kPa, verzamelen lysaat op ijs in elk geval. U kunt ook een kraal Beater (Biospec) met een gelijk volume zuur gewassen 0,5 mm glasparels en roeren gedurende 3 minuten op volle snelheid. Breng het lysaat bij 50 ml Falcon buis en de pellet celresten door centrifugatie bij 3500 xg, 4 ° C gedurende 15 minuten in een tafelmodel centrifuge.
- Breng de bovenstaande om gekoelde centrifuge buizen. Centrifugeer bij 14.000 xg, 4 ° C gedurende 30 minuten in een centrifuge voor verwijderen mitochondria.
- Overdracht supernatant gekoeld ultracentrifuge buizen. Centrifugeer bij 200.000 x g, 4 ° C gedurende 90 minuten in een ultracentrifuge met microsomen verzamelen.
- Decanteer zorgvuldig Verwijder de bovenstaande vloeistof en voeg 2 ml ijskoud CFTR buffer met protease remmers en 1 mM DTT aan elke buis. Voorzichtig mengen de pellets met behulp van een penseel, vul elke buis met CFTR buffer en meng met behulp van een vortex-mixer.
- Centrifugeer de schorsing op 200.000 xg, 4 ° C gedurende 60 minuten in een ultracentrifuge, Giet de bovenstaande vloeistof Resuspendeer pellets in 2 ml ijskoude CFTR buffer wet proteaseremmers (Geen DTT) met behulp van een penseel.
- Zwembad de geresuspendeerde microsomen, pas het uiteindelijke volume tot 50 ml met CFTR buffer en meng goed. Reserve een 1 ml aliquot van SDS-PAGE gel analyse, zoals beschreven in 2,9 tot 2,11. De microsomen kan nu flash bevroren in vloeibare stikstof en vervolgens bij -80 ° C tot nodig.
- CFTR kan worden gewonnen uit microsomen met behulp van een van de volgende schoonmaakmiddelen: lithium perfluorooctonoate zuur (LiPFO), tetradecanoly-lyso-fosfatidylglycerol (LPG14), n-dodecyl-β-D-maltoside (DDM). Meng de microsomen met CFTR buffer, proteaseremmers en 5% reinigingsmiddel (w / w). Als DDM wordt gebruikt, ook toevoegen 300 mM NaCl de buffer. Roer bij 4 ° C gedurende 15 minuten op een buis rotator.
- Centrifugeer de monsters op 100.000 xg, 4 ° C gedurende 1 uur in een ultracentrifuge. Bewaar het supernatant af en neem een kleine hoeveelheid voor SDS-PAGE gel analyse. CFTR kan nu worden gezuiverd uit het solublised materiaal door geïmmobiliseerde metaalcomplexenaffiniteitschromatografie gevolgd door gelpermeatiechromatografie.
4. Representatieve resultaten
Transformatie van gist met het CFTR-bevattende plasmide niet 100% efficiënt. Een representatieve kleinschalige scherm van CFTR uitdrukking in de geselecteerde kolonies is van een omzetting experiment levert ongeveer 1 op de 4 kolonies de uiting van de proteïne. Een typisch gevolg van een scherm van 5 kolonies gekozen uit een plaat getoond in paneel A van Fig. 3. Een van de kolonies toont een hoog niveau van expressie van het CFTR-GFP-eiwit dat gewoonlijk loopt tussen de 250 en 130 kDa kDa markers, zoals weergegeven. Het CFTR-GFP-fluorescentie niveaus zal aanzienlijk verschillen tussen de experimenten, met kolonie 4 in Fig. 3 waarin ten minste 10x groter is dan de intrinsieke fluorescentie TL-band bij ongeveer 70kDa. Als expressie van CFTR-GFP lijken te geven minder fluorescentie dan de 70 kDa band, dan is het waarschijnlijk de moeite waard opnieuw te transformeren en het kiezen van een koloniemet hogere niveaus van CFTR-GFP expressie. Zoals getoond in Fig. 3A, is het onwaarschijnlijk, zelfs met een hoge expressie van CFTR-GFP, dat het CFTR-GFP band zal duidelijk uit het celextract van Coomassie kleuring.
Wanneer gekozen kolonies gekweekt in grotere schaal experimenten microsomen en geïsoleerd, de aanwezigheid van CFTR-GFP in de microsomen moeten worden gemeten zoals aangegeven in Fig. 3B. De resultaten van dit experiment zijn belangrijk, niet alleen om de efficiëntie van de inductie van expressie te beoordelen, maar ook om na de microsomen zorgvuldig opgesteld en dat proteolyse is geminimaliseerd. De resultaten weergegeven in Fig. 3B betekent dat in dit experiment het CFTR-GFP expressie enigszins lager (zoals bepaald ten opzichte van de intrinsieke 70kDa band) dan in de kleine experiment getoond in paneel A. echter deze indruk wordt beïnvloed door de belichte fluorescentiedetector deze meting. Dit was omdat de experimentator was checking op de aanwezigheid van proteolytische fragmenten van het CFTR te bouwen. Er is enig bewijs in dit experiment voor een aantal TL-proteolytische fragmenten tussen de 130 kDa en 100 kDa markers, maar deze zijn zeer zwak in vergelijking met de volledige lengte CFTR-GFP band. Met de proteaseremmers hier beschreven, vinden we weinig bewijs voor proteolytische afbraak van CFTR na breken van de cellen. Indien er zich belangrijke proteolyse wordt waargenomen, raden wij aan het maken van verse proteaseremmer voorraad oplossingen. We hebben ook gevonden dat commerciële protease inhibitor cocktail tabletten niet zo doeltreffend voor dit systeem. Groei van cellen die 16 uur (na inductie) zal leiden tot een verminderde CFTR expressie zoals weergegeven in figuur 4. Dit is waarschijnlijk te wijten aan de omzet van het eiwit, misschien te wijten aan opregulatie van de gist-eiwit kwaliteitscontrole machines 6-9,13. Het is daarom raadzaam om toezicht te houden CFTR-expressie na inductie met galactose, indien mogelijk, als de ideale tijd om te oogsten van de cellen may variëren van laboratorium tot het andere.
Figuur 1. De CFTR construct bevattende gistplasmide. De CFTR-GFP-8His fusie wordt in de 2μ p424GAL1 expressievector onder besturing van galactose (GAL1) promoter. De vector bevat een uracil selectiemerker (URA) en een ampicillineresistentie gen (Amp).
Figuur 2. Een flowchart een samenvatting van de gevisualiseerde protocol.
Figuur 3. Vertegenwoordiger SDS-PAGE gels van CFTR expressie en zuivering. Paneel A toont vijf willekeurige transformant kolonies (lanen 1-5) die werden gescreend op CFTR expressie geplukt. Paneel B toont microsomen die werden geïsoleerd uit een 15L fermin te voeren cultuur. Paneel C toont gezuiverd muizen CFTR verkregen na twee-traps zuivering met behulp van affiniteitschromatografie gevolgd door size exclusion chromatografie. Alle gels worden getoond bij verlichting voorwaarden spannend fluorescentie van het GFP-domein (links) en na Coomassie vlek (rechts). De relatieve plaatsen van moleculair gewicht standaarden staan links (kDa).
Figuur 4. Representatieve gegevens voor de expressie van CFTR in gist. Paneel A toont een tijdsverloop van CFTR expressie na inductie met galactose. Celextracten werden geanalyseerd door SDS-PAGE en GFP voor het CFTR-GFP-eiwit band geïntegreerd. Paneel B toont typische resultaten fluorescentiemicroscopie van GFP-expresserende cellen 16 uur na inductie. Gewoonlijk slechts een fractie van de cellen brengen CFTR hoog.
Discussion
Dit document verschaft een werkwijze voor de expressie van muizen CFTR-eiwit in gistcellen, die onderzoek te vergemakkelijken cystic fibrosis. Het doel is om dit papier te verbinden met de release van de muis CFTR DNA-constructie, die beschikbaar zijn via de Cystic Fibrosis Foundation ( http://www.cff.org/research/CFFT/ ). Andere orthologen moet later beschikbaar komen. Transformatie van de gistcellen met het CFTR-bevattende vector is eenvoudig, maar het is belangrijk om te screenen op kolonies die hoge niveaus van CFTR. Variabele expressie kunnen voortvloeien uit verschillende factoren, maar het aantal kopieën van het plasmide per cel waarschijnlijk goed voor een belangrijke mate van variatie. Kritische stappen die hier beschreven moet het mogelijk maken de productie van CFTR tot expressie gistcellen en CFTR-bevattende microsomale membranen. Na de transformatie, groei, oogst en lysis van gistcellen zijn knie, Purificatie van het eiwit mogelijk moet zijn en in figuur 3 hebben we een voorbeeld gegeven van de zuiverheid die moeten kunnen worden gehaald in dit geval een nuttig referentie. Het is niet onze bedoeling in dit manuscript aan gedetailleerde methodologie voor zuivering van het eiwit. Er zijn echter enkele kritische downstream zuivering stappen die specifiek zijn voor de S.cerevisae expressiesysteem, zoals mobiele lysis en microsoompreparaten zuivering, en deze zijn opgenomen in detail in dit manuscript. Opgemerkt zij echter dat afgezien van de beide methoden is gebruik kunnen alternatieve gistcel verstoring methoden worden toegepast, zoals het gebruik van een Franse drukcel. Het recombinant eiwit een TEV-splitsbare C-terminale domein GFP waarmee het eiwit te traceren na inductie (Fig. 4). Gist een intrinsieke 70kDa eiwit (waarschijnlijk succinaat dehydrogenase 12) dat fluoresceert onder dezelfde omstandigheden 11 en kan een nuttige onder voorzieninterne standaard voor de kalibratie relatieve expressieniveaus van CFTR geheel celextracten of microsomen (Fig. 3). Uit de gegevens weergegeven in figuur 4 dat het tijdstip van cellen geoogst na inductie met galactose cruciaal. Opbrengsten van CFTR druppel steil na ongeveer 16 uur van inductie, zodat er nauwelijks waarneembaar CFTR in gistcellen na 24 uur van inductie.
De opbrengst van het gezuiverde eiwit is over 1-2mg CFTR eiwit per 15 liter fermentor cultuur. Herstel kan worden geraamd ongeveer 70% van de totale CFTR-eiwit GFP tot microsoom fase en ongeveer 25% terugwinning van gezuiverd eiwit. Karakterisering van de S. cerevisiae-uitdrukking CFTR is aan de gang. Zoals in Fig. 4 kan het eiwit in de cel gelegen gecontroleerd door fluorescentiemicroscopie. Hoewel veel van de fluorescentie in de omgeving van de omtrek van de cel als verwachte 10 enkele eiwit geeft een gestippelde lokalisatie, in ofnet binnen de plasmamembraan die zou kunnen te wijten zijn aan recycling CFTR door middel van een late Golgi / endosomale route 14 of misschien wel een compartiment stroomafwaarts van het ontluiken van het vervoer blaasjes uit het ER 4. Behandeling met PNGaseF, een enzym dat proteïnen deglycosylates toonde minimale verandering in de migratie van het CFTR-eiwit band op SDS-PAGE, hetgeen inhoudt dat het unglycosylated of een minimale glycosylering 15. Experimenten op de fosforylatie toestand van het eiwit zijn aan de gang. In sommige wasmiddelen geteste dusver het gezuiverde eiwit wordt ATPase activiteit (die wordt geremd door een CFTR-specifieke remmer 16) met een snelheid die gelijk zijn aan die als eerder gepubliceerd 2,15. Meting van CFTR kanaal activiteit vereist oplossen van het gezuiverde eiwit dat een laatste zuiveringsstap in een wasmiddel, dat een relatief hoge kritische micelconcentratie (CMC) 17 heeft zou betekenen. Gist microsomen containing CFTR te solublised met verschillende gewoonlijk toegepast wasmiddelen 18 met detergenten, zoals dodecyl maltoside 2, die algemeen beschouwd als "licht". Maar de meeste hoge cmc wasmiddelen blijken te zijn inefficiënt voor solubilsation, tot nu toe, wat erop wijst dat de uitwisseling in deze wasmiddelen moet worden beschouwd in een laat stadium in een zuivering regeling.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Wij danken de Cystic Fibrosis Foundation (CFF) voor de financiering van dit werk door middel van haar CFTR 3D-structuur Consortium (licentienummer FORD08XX0). Wij erkennen de enorme bijdrage van al onze collega's binnen het Consortium om dit werk, met name in het ontwerp van het CFTR-genen. We erkennen ook de waardevolle bijdragen van Drs. James Birtley (NCRO Demokritos, Griekenland), Mark Young (Universiteit van Cardiff, Verenigd Koninkrijk) en David Drew (Imperial College, Londen, VK) in de vroege stadia van het werk. We zijn vooral dank Dr Ina Urbatsch (Texas Tech. University, Lubbock) voor het kritisch lezen van het manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FGY217 S.cerevisiae strain, with pep4 deletion 10 | |||
| Yeast nitrogen base without amino acids | Formedium | CYN0410 | |
| Complete supplement mixture without uracil | Formedium | DCS0169 | |
| Bacteriological agar | Sigma-Aldrich | A5306 | |
| D-galactose | Fisher | BP656-500 | |
| D-glucose | Fisher | D16-500 | |
| Pepstatin A | Sigma-Aldrich | P4265 | |
| Leupeptin | Merck | 108975 | |
| Chymostatin | Sigma-Aldrich | C7268 | |
| Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| Epoxysuccinyl-leucylamido-butane (E-64) | Sigma-Aldrich | E3132 | |
| Amin–thylbenzenesulfonyl fluoride (AEBSF) | Sigma-Aldrich | A8456 | |
| Benzamidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 434760 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher | BP120500 | |
| Tris-base | Formedium | TRIS01 | |
| Tris-HCl | Fisher | P631 | |
| D-sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 | |
| Glycerol | Fisher | 065017 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 | |
| n-dodecyl-β-D-maltopyranoside | Affymetrix | D310S | |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | 114391 | |
| PageRuler Plus prestained protein standards | Fermentas | SM1811 | |
| NuSep tris-gly 4-20% gradient gels | NuSep | NB10-420 | |
| Instant Blue Coomassie Stain | Novexin | ISB1L | |
| Glass beads, acid washed | Sigma | G8772 | |
| 50ml Sterile Falcon Tubes | Sarstedt | 62.547.254 | |
| 2ml Sterile screw-top vials | Sarstedt | 72.694.005 | |
| 250ml Sterile Erlenmeyer baffled flasks | BD Biosciences | 355119 | |
| 2l Sterile Erlenmeyer baffled flasks | BD Biosciences | 355131 | |
| 2ml microfuge tubes | Sarstedt | 72.695 | |
| 0.2μM syringe filter | Sartorius | FC121 | |
| ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 355618 | |
| centrifuge tubes | Beckman Coulter | 357000 | |
| 1l centrifuge pots | Beckman Coulter | 969329 | |
| Orbital shaking incubator with temperature control | New Brunswick Scientific | ||
| Deltavision RT restoration microscope | Applied Vision | ||
| Benchtop centrifuge | HERMLE | Z300 | |
| Benchtop microfuge | Fisher | 13-100-511 | |
| Vortex mixer | Star Labs | ||
| Typhoon Trio Scanner | GE Healthcare | 63-0055-87 | |
| LAS3000 imaging system | Fuji | ||
| 20l fermenter vessel and control unit | Applikon | ||
| Constant systems cell disrupter | Constant systems | ||
| Beadbeater cell disrupter | BioSpec | 1107900 | |
| Mini-beadbeater-16 | BioSpec | 607 | |
| JA-17 rotor | Beckman Coulter | 369691 | |
| Optima L-100 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 392050 | |
| 50.2Ti rotor | Beckman Coulter | 337901 |
References
- Ford, R. C., Birtley, J., Rosenberg, M. F., Zhang, L. CFTR three-dimensional structure. Methods Mol. Biol. 741, 329-346 (2011).
- Rosenberg, M. F., Kamis, A. B., Aleksandrov, L. A., Ford, R. C., Riordan, J. R. Purification and crystallization of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. CFTR). J. Biol. Chem. 279, 39051-39051 (2004).
- Zhang, L., Aleksandrov, L. A., Riordan, J. R., Ford, R. C. Domain location within the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein investigated by electron microscopy and gold labelling. Biochim. Biophys. Acta. 1808, 399-404 (2011).
- Kiser, G. L. Expression and degradation of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in Saccharomyces cerevisiae. Arch. Biochem. Biophys. 390, 195-205 (2001).
- Huang, P., Stroffekova, K., Cuppoletti, J., Mahanty, S. K., Scarborough, G. A. Functional expression of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in yeast. Biochim. Biophys. Acta. 1281, 80-90 (1996).
- Ahner, A., Nakatsukasa, K., Zhang, H., Frizzell, R. A., Brodsky, J. L. Small heat-shock proteins select deltaF508-CFTR for endoplasmic reticulum-associated degradation. Mol. Biol. Cell. 18, 806-814 (2007).
- Fu, L., Sztul, E. ER-associated complexes (ERACs) containing aggregated cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are degraded by autophagy. Eur. J. Cell. Biol. 88, 215-226 (2009).
- Sun, F. Derlin-1 promotes the efficient degradation of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) and CFTR folding mutants. J. Biol. Chem. 281, 36856-36863 (2006).
- Zhang, Y., Michaelis, S., Brodsky, J. L. CFTR expression and ER-associated degradation in yeast. Methods Mol. Med. 70, 257-2565 (2002).
- Drew, D. GFP-based optimization scheme for the overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae. Nat. Protoc. 3, 784-798 (2008).
- Knight, A. W., Billinton, N. Seeing the wood through the trees: A review of techniques for distinguishing green fluorescent protein from endogenous autofluorescence. Anal. Biochem. 291, 175-197 (2001).
- Robinson, K. M., Lemire, B. D. Isolation and nucleotide sequence of the Saccharomyces cerevisiae gene for the succinate dehydrogenase flavoprotein subunit. J. Biol. Chem. 267, 10101-10107 (1992).
- Gnann, A., Riordan, J. R., Wolf, D. H. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator degradation depends on. the lectins Htm1p/EDEM and the Cdc48 protein complex in. 15, 4125-4135 (2004).
- Yoo, J. S. Non-conventional trafficking of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator through the early secretory pathway. J. Biol. Chem. 277, 11401-11409 (2002).
- Zhang, L. Architecture of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein and structural changes associated with phosphorylation and nucleotide binding. Journal of Structural Biology. 167, 242-251 (2009).
- Wellhauser, L. A small-molecule modulator interacts directly with deltaPhe508-CFTR to modify its ATPase activity and conformational stability. Mol. Pharmacol. 75, 1430-148 (2009).
- Ramjeesingh, M. A monomer is the minimum functional unit required for channel and ATPase activity of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Biochemistry. 40, 10700-10706 (2001).
- Huang, P., Liu, Q., Scarborough, G. A. Lysophosphatidylglycerol: a novel effective detergent for solubilizing and purifying the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Anal. Biochem. 259, 89-97 (1998).
