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Biology

Expression et purification de la protéine transmembranaire de la fibrose kystique conductance Regulator dans Saccharomyces cerevisiae

Published: March 10, 2012 doi: 10.3791/3860
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Faculty of Life Sciences, University of Manchester

Summary

Les tentatives pour exprimer le régulateur de la conductance transmembranaire de la mucoviscidose (CFTR) dans

Abstract

Le régulateur de la conductance transmembranaire de la mucoviscidose (CFTR) est un canal chlorure, que lorsqu'il est muté, peut donner lieu à la fibrose kystique dans humans.There est donc un intérêt considérable dans cette protéine, mais les efforts pour étudier sa structure et l'activité ont été entravés par la difficulté d'exprimer et de purification de quantités suffisantes de la protéine 1-3. Comme beaucoup de 'difficiles' protéines membranaires eucaryotes, l'expression dans un organisme en pleine croissance est souhaitable, mais difficile, et dans la levure S. cerevisiae, dans la mesure de faibles quantités ont été obtenues et de la dégradation rapide de la protéine recombinante a été observée 4-9. Les protéines impliquées dans le traitement de la protéine CFTR chez la levure recombinante ont été décrites 6-9. Dans ce rapport, nous décrivons une méthodologie pour l'expression de la protéine CFTR chez la levure et sa purification en quantités importantes. Le protocole décrit comment les problèmes de protéolyse antérieures peuvent être surmontés et les niveaux d'expression de la façon dontCFTR peut être grandement améliorée en modifiant les conditions de croissance des cellules et en contrôlant les conditions d'induction, en particulier la période de temps avant la récolte des cellules. Les reagants associés à ce protocole (CFTR murin exprimant des cellules de levure ou des plasmides de levure) seront distribués par l'intermédiaire de la Fondation de la fibrose kystique aux États-Unis, qui a parrainé la recherche. Un article décrivant la conception et la synthèse de la protéine CFTR Construct employé dans le présent rapport sera publié séparément (Urbatsch, I.;. Thibodeau, P. et al, non publié). Dans cet article nous allons expliquer notre méthode de début de la transformation des cellules de levure avec le CFTR construire - la levure contenant le plasmide (Fig. 1). Le produit de construction a une protéine fluorescente verte (GFP) fusionnée à la séquence CFTR à son extrémité C-terminale et suit le système développé par Drew et al. (2008) 10. La GFP permet l'expression et la purification de la protéine CFTR à suivre relativement facilement. Le protocole JoVE visualiséesfinitions ol après la préparation de microsomes des cellules de levure, bien que nous incluons quelques suggestions pour la purification de la protéine à partir des microsomes. Les lecteurs peuvent ajouter leurs propres modifications à la procédure de purification microsome, en fonction des derniers essais à effectuer avec la protéine et l'équipement local à leur disposition. La levure a exprimé la protéine CFTR peut être partiellement purifié à l'aide d'ions métalliques chromatographie d'affinité, en utilisant un marqueur polyhistidine intrinsèque de purification. Après chromatographie d'exclusion stérique donne une protéine qui semble être> 90% de pureté, à en juger par SDS-PAGE et Coomassie-coloration du gel.

Protocol

1. Préparation des milieux et tampons

  1. YNB: Pour un litre, de suspendre 6,9 ​​g de base azotée de levure sans acides aminés et 0,77 g de mélange supplément complet sans uracile dans 1 l d'eau. Autoclave. Conserver à 4 ° C.
  2. YNBA: Pour 400 ml, 2,76 g de base de suspendre l'azote de levure sans acides aminés, 0,38 g de mélange supplément complet sans uracile et 8g agar bactériologique dans 350 ml d'eau. Autoclave. Mélanger 8 g de glucose avec 50 ml d'eau et faites chauffer doucement jusqu'à dissolution. Stériliser à travers un filtre de 0,2 um et ajouter à la YNBA tandis la gélose est fondu. Stocker à température ambiante.
  3. Moyenne 20% de glucose: Pour 500 ml, mélanger 100 g de glucose par 500 ml YNB et faites chauffer doucement jusqu'à dissolution. Passer à travers un filtre de 0,2 uM dans un flacon stérile Duran. Stocker à température ambiante.
  4. Milieu galactose 20%: Pour 2 litres, mélanger 400 g de galactose avec YNB 2l et faites chauffer doucement jusqu'à dissolution. Passez à travers un filtre de 0,2 um dans un flacon stérile Duran. Entreposer à la colère ambianterature.
  5. Les stocks inhibiteur de protéase: CFTR est très sensible à la protéolyse 4. Les auteurs ont trouvé des inhibiteurs de la suite pour être efficace dans la limitation de la protéolyse, bien que les lecteurs voudront peut-être adapter cette liste pour répondre à leurs exigences propres. Entreposer dans 100 aliquotes à -20 ° C pour réduire les problèmes de gel-dégel. Tous les inhibiteurs doit être dilué à partir des solutions mères à la concentration de travail comme ci-dessous:
Inhibiteur Concentration d'images Préparation de la pâte Concentration de travail
AEBSF 200 mM Dissoudre 48 mg dans 1 ml d'eau distillée 0,2 mM
Benzamidine 300 mM Dissoudre 36 mg dans 1 ml d'eau distillée 0,3 mM
Chymostatine 4 mM Dissoudre 2,5 mg dans 1 ml sèche MSSO 4 uM
E-64 7 mM Dissoudre 2,5 mg dans l'eau distillée 1ml 7 uM
Leupeptine 20 mM Dissolvez 10 mg dans 1 ml d'eau distillée 20 uM
Pepstatine A 15 mM Dissolvez 10 mg dans 1 ml de DMSO sec 15 uM
PMSF M 1 Dissoudre 174mg dans 1 ml de DMSO sec 1 mM
  1. TNT (1 M): dissoudre 154 mg de dithiothréitol dans l'eau distillée 1ml. Conserver à -20 ° C. Utilisez moins 1:1000 dilution dans des tampons indiquées.
  2. EDTA (0,5 M): Mix 29,22 g d'acide éthylènediaminetétraacétique avec 100 ml d'eau. Ajouter goutte à goutte NaOH 10 N jusqu'à ce que tout de l'EDTA a dissous et le pH atteint 8. Compléter à 200 ml avec de l'eau et de passer à travers un filtre de 0,2 um dans un flacon stérile Duran. Stocker à température ambiante.
  3. CRB (300 mM Tris-HCl,pH 7,4, 0,56 M sorbitol, EDTA 1 mM): Dissoudre 18,17 g de Tris-base dans 350 ml d'eau et ajuster le pH à 7,4 par addition de HCl. Ajouter 51,35 g de sorbitol et de faire du volume à 500 ml avec de l'eau. Autoclave. Ajouter 1 ml de solution stock de l'EDTA et conserver à 4 ° C.
  4. CFTR tampon (50 mM Tris, pH 8,0, 10% v / v de glycérol): Dissoudre 6,06 g de Tris-base dans 500 ml d'eau. Ajuster le pH à 8 avec HCl, ajouter 100 ml de glycérol et ajuster à 1 L avec de l'eau. Autoclave et conserver à 4 ° C.
  5. 2x colorant de charge: 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), le glycérol 5%, 5 mM d'EDTA (pH 8,0), 0,02% bleu de bromophénol, 4% SDS, 0,05 M de DTT. Faire 10 ml, aliquote et conserver à -20 ° C.

2. Les transformants de dépistage

Ce protocole suppose que le gène de fusion CFTR-GFP-8His a été inséré dans un plasmide de levure aval à un promoteur du galactose GAL1 (Fig.1) et que le plasmide a été transformé en FGY217 cellules, une délétion mutant de S. cerevisiae PEP4 10 et al. (2008) 10.

  1. Choisissez bien séparés 5-10 colonies à partir d'une plaque de transformation. Transférer chaque colonie dans un tube séparé 50 ml stérile Falcon contenant 9 ml et 1 ml de YNB moyenne 20% de glucose. Pour cette étape, il est important d'avoir une concentration finale de 2% de glucose (p / v) dans la culture pour maintenir la croissance des cellules. Cultiver la nuit pendant 16 heures à 250 rpm, 30 ° C dans un incubateur orbitale secouant.
  2. Faire des stocks de glycérol pour chacune des colonies blindés. Ajouter stérilement 0,8 ml des cultures d'une nuit à 0,2 ml de glycérol stérile dans marquées vis-top flacons, homogénéiser brièvement au vortex et stocker à -80 ° C.
  3. Diluer les cultures restantes nuit à un volume final de 50 ml dans YNB, dont 250 pl de milieu de glucose à 20%.Pour cette étape, il est important de diluer la concentration de glucose à environ 0,1% (w / w) dans la culture parce que le glucose élevé peut réprimer le promoteur GAL1 10. Cultiver des cultures dans étiquetés Erlenmeyer 250 ml dérouté flacons à une DO 600 de 0,7-0,8 à 250 rpm, 30 ° C dans un incubateur orbitale secouant.
  4. Provoquer des cultures par addition de 5 ml de milieu galactose 20% à chaque flacon et se développer pendant 16 heures.
  5. Confirmer l'expression de la protéine CFTR par microscopie à fluorescence. Prenez 100 pi de la culture et ajouter 100 ul de glycérol afin de limiter la mobilité cellulaire dans une solution. Analyser les cellules sur un microscope Delta Vision RT de restauration (ou similaire), en utilisant un laser bleu sous un filtre FITC (longueur d'onde d'excitation de 490 nm de longueur d'onde et l'émission de 528-538 nm). Expression positive de la protéine de fusion GFP-CFTR devrait être visible comme un anneau de fluorescence à la membrane plasmique des cellules de levure. Des cellules de levure non transformées peut être utilisé comme témoin.
  6. Transférer lecultures dans des tubes Falcon 50 ml. Récolter les cellules par centrifugation à 3500 xg, 4 ° C pendant 10 minutes dans une centrifugeuse de paillasse. Alors que la centrifugeuse est en cours d'exécution, de préparer 2 microtubes ml avec bouchon à vis contenant environ 500 ul de billes de verre lavée à l'acide et les placer sur la glace. Jeter les surnageants et remettre chaque culot dans 500 à 800 pi glacée CRB avec inhibiteurs de la protéase. Transfert des suspensions aux microtubes contenant les billes et de garder sur la glace.
  7. Lyse des cellules en secouant vigoureusement / vortex chaque tube de centrifugeuse pendant 10 périodes de 30 secondes, reposant sur de la glace entre les périodes. Un beadbeater peut être utilisé comme une alternative, par exemple, un mini-beadbeater BioSpec exploité pendant 3 min.
  8. Placer les tubes dans une micro-centrifugeuse de paillasse et à 3.500 xg, 4 ° C pendant 5 minutes. Transférer les surnageants contenant la population membranaire brut pour nettoyer des microtubes et les placer sur la glace. Ajouter 500 ul frais glace cold CRB les inhibiteurs de protéase à chaque tube et répétez le processus d'accumuler les membranes.
  9. Recueillir les membranes brut par centrifugation à vitesse maximale, 4 ° C dans une microcentrifugeuse de paillasse pendant 2 heures. Jeter le surnageant et remettre en suspension chaque culot dans 50 ul de tampon de glace CFTR froid.
  10. Dans des microtubes propres, mélanger 15 pi de chaque suspension avec 15 ul de colorant de charge 2x par aspiration et refoulement. Incuber à température ambiante pendant 10 minutes. Ne pas faire bouillir les échantillons, car cela entraînerait des protéines membranaires CFTR et l'autre pour former des agrégats insolubles SDS-et aussi dénaturer le tag GFP.
  11. Charger les échantillons le long d'PageRuler plus normes protéines précolorés (Fermentas) sur un gel de 4-20% Tris / glycine gradient (NuSep) et exécuter à 150 V pendant 40 minutes ou jusqu'à ce que le front de colorant se trouve au fond du gel.
  12. Identifier les plus hautes cellules exprimant par fluorescence dans le gel. Placer dans un système d'imagerie de fluorescence, comme un scanner Typhoon. Scannez le gel de uchanter le laser bleu à une longueur d'onde d'excitation de 488 nm et une longueur d'onde d'émission de 526 nm. La fusion CFTR-GFP devrait être visible à environ 220 kDa. Il y aura aussi une bande faible fluorescente visible à environ 70 kDa qui est probablement une levure intrinsèque DCP contenant des protéines membranaires (comme sous-unité de la succinate déshydrogénase A) 11,12.
  13. Colorer le gel avec de Coomassie, décolorer et de numériser le gel de comparaison pour l'analyse par fluorescence en utilisant un paquet d'image de visualisation pratique logiciel. Le gel teinté au bleu de Coomassie permet une évaluation relative des niveaux d'expression de CFTR-GFP dans les différents lignées clonales après la normalisation de la quantité de protéine totale chargée sur chaque piste du gel.
  14. Streak sur la lignée cellulaire exprimant le plus élevé de son stock de glycérol (2,2) sur une nouvelle YNBA et incuber à 30 ° C pendant 2-3 jours. Cette plaque peut alors être stocké pour un maximum de 2 semaines à 4 ° C.

3. Cult fermenteur à grande échelleure

  1. Préparer les pré-cultures pour le fermenteur. Racler 1cm 2 de surface de cellules de la YNBA Plaque (2,13) ​​en utilisant une boucle stérile et ajouter à 45 ml YNB et 5 ml de milieu de glucose à 20%, de telle sorte que le diamètre extérieur est d'environ 600 à 0,1. Croître dans des erlenmeyers de 250 ml dérouté à 250 rpm, 30 ° C dans un incubateur orbitale secouant jusqu'à ce que la DO 600 atteigne 1.
  2. Séparer la culture entre deux Erlenmeyer de 2 l dérouté flacons contenant chacun 450 ml YNB et 25 ml de milieu glucose à 20%. Cultiver ces sur à 250 rpm, 30 ° C dans un incubateur orbitale secouant jusqu'à ce que la DO 600 atteint 1,2.
  3. Alors que ces cultures sont de plus en plus pré-, mis en place dans le fermenteur. Assurez-11.2l de YNB que visées au point 1.1, mais elles se dissolvent supplémentaires 8,28 g et 0,95 YNB goutte à g supplément pour compenser l'ajout de glycérol à l'induction. Ajouter stérilement le 11,2 l YNB et 75 ml de milieu de glucose à 20% à une cuve de fermentation 20l stérile et ajuster la température de fonctionnement de30 ° C.
  4. Ajouter stérilement les précultures dans le fermenteur et définir la vitesse d'agitation à environ 800 tours par minute et maintenir la température à 30 ° C. L'air comprimé doit couler à environ 15 dm 3 min -1. Une fois que la culture du fermenteur atteint une DO 600 de 1,2, induire en ajoutant aseptiquement 1,5 l YNB solution de galactose à 20% de glycérol et 1,2 l. Réduire la température à 25 ° C et faire croître la culture pendant 16 heures.
  5. Transférer le contenu du fermenteur dans des pots à centrifuger réfrigérés 1l sur la glace à l'aide d'une pompe péristaltique. Récolter les cellules par centrifugation à 3500 xg, 4 ° C pendant 30 minutes dans un rotor de grande capacité (par exemple 6 litres). Remettre en suspension les cellules dans 150 ml de glace CRB froid avec inhibiteurs de la protéase. A partir de là, tout travail doit être effectué à 4 ° C.
  6. Lyse des cellules en passant par un perturbateur des systèmes à pile constante en 4 passages à 25, 30, 32 et 35 kPa, la collecte du lysat sur la glace dans chaque cas. Sinon, utilisez un cordon de Beater (Biospec) avec un volume égal d'acide à la chaux des perles de verre de 0,5 mm et agiter pendant 3 minutes à pleine puissance. Transférer le lysat à 50 ml tubes Falcon et le culot les débris cellulaires par centrifugation à 3500 xg, 4 ° C pendant 15 minutes dans une centrifugeuse de paillasse.
  7. Transférer le surnageant dans des tubes à centrifuger réfrigérés. Centrifuger à 14000 xg, 4 ° C pendant 30 minutes dans une centrifugeuse pour éliminer les mitochondries.
  8. Transférer le surnageant dans des tubes réfrigérés ultracentrifugeuse. Centrifuger à 200 000 xg, 4 ° C pendant 90 minutes dans une ultracentrifugeuse à recueillir des microsomes.
  9. Décanter avec soin et jeter le surnageant et ajouter 2 ml de tampon CFTR glacée avec les inhibiteurs de protéase et 1 mM DTT à chaque tube. Resuspendre doucement les boulettes à l'aide d'un pinceau, faire l'appoint de chaque tube avec un tampon de CFTR et mélanger à l'aide d'un mélangeur vortex.
  10. Centrifuger la suspension à 200.000 xg, 4 ° C pendant 60 minutes dans une ultracentrifugeuse, jeter des boulettes surnageant et remettre en suspension dans 2 ml de glace froide CFTR w tamponinhibiteurs de la protéase vec (Pas de TNT) à l'aide d'un pinceau.
  11. Piscine des microsomes remises en suspension, ajuster le volume final à 50 ml avec du tampon CFTR et bien mélanger. Réserver une aliquote de 1 ml pour analyse sur gel SDS-PAGE, tel que décrit dans 02.09 à 02.11. Les microsomes peuvent maintenant être éclair congelés dans l'azote liquide puis conservés à -80 ° C jusqu'à ce que nécessaire.
  12. CFTR peut être extraite de microsomes avec l'une des détergents suivants: lithium perfluorooctonoate acide (LiPFO), tetradecanoly-lyso-phosphatidylglycérol (LPG14), le n-dodécyl-β-D-maltoside (DDM). Mélanger les microsomes avec un tampon de CFTR, inhibiteurs de la protéase et 5% de détergent (w / w). Si DDM est utilisé, ajouter 300 mM de NaCl à la mémoire tampon. Agiter à 4 ° C pendant 15 minutes sur un rotateur tube.
  13. Centrifuger les échantillons à 100.000 xg, 4 ° C pendant 1 heure dans une ultracentrifugeuse. Conserver le surnageant et prendre une petite partie aliquote d'analyse sur gel de SDS-PAGE. CFTR peut désormais être purifié à partir du matériau solublised par le métal immobiliséchromatographie d'affinité suivie par chromatographie d'exclusion stérique.

4. Les résultats représentatifs

Transformation de la levure avec le plasmide contenant la protéine CFTR n'est pas efficace à 100%. Un représentant de petite échelle de l'écran d'expression de CFTR dans les colonies sélectionnées à partir d'une expérience de transformation devrait rapporter environ 1 à 4 colonies exprimant la protéine. Un résultat typique d'un écran de 5 colonies sélectionnées dans une plaque est montré dans le panneau A de la figure. 3. L'une des colonies montre un fort niveau d'expression de la protéine de fusion GFP-CFTR, qui dure généralement entre les 250 kDa et 130 kDa marqueurs, comme le montre. Les niveaux de la protéine CFTR-fluorescence de la GFP peut varier considérablement entre les expériences, avec la colonie 4 sur la figure. 3 démontrant de fluorescence d'au moins 10x plus grande que la bande intrinsèque fluorescente à environ 70kDa. Si les niveaux d'expression de la protéine CFTR-GFP semblent donner moins de fluorescence de la bande de 70 kDa, alors il vaut probablement la peine re-transformant et en choisissant une colonieavec des niveaux plus élevés de la protéine CFTR-GFP expression. Comme le montre la Fig. 3A, il est peu probable, même avec un haut niveau d'expression de la protéine CFTR-GFP, que la bande CFTR-GFP sera perceptible dans l'extrait cellulaire par coloration au bleu de Coomassie.

Une fois sélectionnés les colonies ont été cultivés dans des expériences à plus grande échelle, et les microsomes isolés, la présence de la protéine CFTR-GFP dans les microsomes devront être évalués, comme indiqué dans la Fig. 3B. Les résultats de cette expérience sont importants, non seulement pour évaluer l'efficacité de l'induction de l'expression, mais aussi de vérifier que les microsomes ont été préparés avec soin et que la protéolyse a été minimisé. Les résultats présentés dans la figure. 3B entendre que, dans cette expérience, l'expression du CFTR-GFP est légèrement inférieur (à en juger par rapport à la bande intrinsèque 70kDa) que dans l'expérience à petite échelle montré dans le panneau A. Cependant, cette impression est biaisée par la surexposition du détecteur de fluorescence dans ce mesure. C'est parce que l'expérimentateur était checking pour détecter la présence de fragments protéolytiques de la CFTR construire. Il existe certaines preuves dans cette expérience pour certains fragments fluorescents protéolytiques entre les 130 kDa et 100 kDa marqueurs, mais ceux-ci sont très faibles par rapport à la pleine longueur CFTR-GFP bande. Avec les inhibiteurs de la protéase décrite ici, nous trouvons peu de preuves de la dégradation protéolytique de la protéine CFTR après la rupture des cellules. Si la protéolyse significative n'est observée, nous recommandons de faire de nouvelles solutions inhibiteurs de la protéase d'achat d'actions. Nous avons également constaté que les comprimés commerciaux inhibiteurs de la protéase cocktails ne sont pas aussi efficaces pour ce système. La croissance des cellules au-delà de 16 heures (post-induction) donnera lieu à l'expression du CFTR a diminué comme le montre la figure 4. Cela est probablement dû au chiffre d'affaires de la protéine, peut-être dû à une régulation positive de la machinerie de la levure de protéines contrôle de la qualité 6-9,13. Il est donc conseillé de surveiller les niveaux d'expression du gène CFTR, après induction par le galactose, si possible, que le moment optimal pour récolter les cellules may varient d'un laboratoire à l'autre.

Figure 1
Figure 1. Le CFTR construction contenant plasmide de levure. La fusion du CFTR-GFP-8His est inséré dans le vecteur d'expression 2μ p424GAL1, sous le contrôle d'un galactose (GAL1) promoteur. Le vecteur contient également un marqueur de sélection uracile (URA) et un gène de résistance à l'ampicilline (Amp).

Figure 2
Figure 2. Un organigramme résumant le protocole visualisées.

Figure 3
Figure 3. Représentant gels SDS-PAGE de l'expression du CFTR et la purification. Groupe A, montre que cinq choisi au hasard colonies transformantes (voies 1-5) qui ont été criblés pour l'expression du CFTR. Le panneau B montre microsomes qui ont été isolés à partir d'un ferm 15lentrer la culture. Groupe C montre purifié la protéine CFTR murin obtenu après deux étapes de purification à l'aide de chromatographie d'affinité suivie par chromatographie d'exclusion stérique. Tous les gels sont présentés dans des conditions d'éclairage par fluorescence passionnante du domaine GFP (à gauche) et après Coomassie tacher (à droite). Les positions relatives des standards de poids moléculaire sont indiqués sur la gauche (kDa).

Figure 4
Figure 4. Les données représentatives pour l'expression de la protéine CFTR chez la levure. Le panneau A montre un temps bien sûr de l'expression du CFTR après induction par le galactose. Des extraits cellulaires ont été analysés par SDS-PAGE, et la fluorescence de la GFP pour la bande protéine CFTR-GFP a été intégré. B Panel montre des résultats typiques pour la microscopie de fluorescence de la GFP cellules exprimant induction 16 h après. En règle générale, seule une fraction des cellules expriment la protéine CFTR à des niveaux élevés.

Discussion

Ce document fournit une méthode pour l'expression de la protéine CFTR murin des cellules de levure, ce qui devrait faciliter la recherche sur la fibrose kystique. L'objectif est de relier le présent document avec la sortie de la souris CFTR construction d'ADN, qui sera disponible à travers le Cystic Fibrosis Foundation ( http://www.cff.org/research/CFFT/ ). Autre orthologues devrait être disponible plus tard. Transformation des cellules de levure avec le vecteur contenant la protéine CFTR est simple, mais il est important à l'écran pour les colonies exprimant des niveaux élevés de la protéine CFTR. Les niveaux d'expression variables peuvent provenir de plusieurs facteurs, mais le nombre de copies de la cellule plasmide par représente probablement un degré significatif de la variation. Les étapes critiques décrites ici devrait permettre la production de la protéine CFTR des cellules exprimant la protéine CFTR et de levure contenant des membranes microsomales. Une fois la transformation, la croissance, la récolte et la lyse des cellules de levure ont été maîtrisées, Purification de la protéine devrait être possible, et à la figure 3, nous avons donné un exemple de la pureté qui devrait être réalisable dans ce cas comme une référence utile. Ce n'est pas notre intention dans ce manuscrit de fournir une méthodologie détaillée pour la purification de la protéine. Cependant, il ya certaines étapes critiques de purification en aval qui sont spécifiques au système d'expression S.cerevisae, tels que la lyse cellulaire et de purification des microsomes, et ceux-ci ont été inclus en détail dans ce manuscrit. Il convient de mentionner, cependant, qu'en dehors des deux méthodes que nous avons utilisés, des méthodes alternatives de cellules de levure de perturbation peuvent être employées, telles que l'utilisation d'une cellule de pression française. La protéine recombinante a un domaine VET-clivable GFP C-terminal qui permet à la protéine à être suivis après induction (fig. 4). Levure ont une protéine intrinsèque 70kDa (probablement succinate déshydrogénase 12) qui entre en fluorescence dans les mêmes conditions 11, ce qui peut fournir une inter utileétalon interne pour les niveaux d'expression relatifs des CFTR dans des extraits cellulaires ou des microsomes entiers (fig. 3). Il est clair à partir des données présentées dans la figure 4 que le moment de la récolte des cellules après induction par le galactose est crucial. Les rendements de baisse CFTR précipitamment après environ 16 heures d'induction, de sorte que il n'y a guère CFTR détectable dans les cellules de levure après 24 heures d'induction.

Le rendement de la protéine purifiée est d'environ 1-2mg protéine CFTR par 15 litres culture du fermenteur. La récupération peut être estimée à environ 70% du total CFTR-protéine GFP jusqu'au stade microsomes, et la récupération d'environ 25% de protéine purifiée. Caractérisation de la S. cerevisiae a exprimé la protéine CFTR est en cours. Comme on le voit dans la figure. 4, emplacement de la protéine dans la cellule peut être contrôlée par microscopie de fluorescence. Bien que une grande partie de la fluorescence se trouve autour de la périphérie de la cellule en tant 10 attendue, une partie de la protéine présente une localisation ponctuée, soit dans, oujuste à l'intérieur de la membrane plasmique, qui pourrait être due à CFTR de recyclage grâce à une fin de Golgi / endosome voie 14 ou peut-être un peu en aval du compartiment de le bourgeonnement des vésicules de transport de l'ER 4. Le traitement par PNGaseF, une enzyme qui deglycosylates protéines, ont montré des changements minimes dans la migration de la bande protéine CFTR sur SDS-PAGE, ce qui implique qu'il est non glycosylé, ou a glycosylation minime 15. Expériences sur l'état de phosphorylation de la protéine sont en cours. Dans quelques-unes des détergents testés jusqu'à présent, la protéine purifiée présente une activité ATPase (qui est inhibée par un inhibiteur de la protéine CFTR spécifique 16) à des taux qui sont semblables à ceux publiés antérieurement 2,15. Mesure de l'activité du canal CFTR, il faudra la reconstitution de la protéine purifiée, ce qui impliquerait une étape de purification finale dans un détergent qui a un niveau relativement élevé concentration micellaire critique (cmc) 17. Levure microsomes containing CFTR peut être solublised avec plusieurs détergents couramment utilisés, y compris 18 des détergents tels que le dodécyl maltoside 2, qui sont généralement considérées comme «douces». Cependant, la plupart des détergents haute cmc se sont avérés inefficaces pour solubilsation, jusqu'à présent, ce qui suggère que l'échange dans ces détergents devraient être examinées à un stade tardif de tout régime de purification.

Disclosures

Pas de conflits d'intérêt déclarés.

Acknowledgments

Nous remercions le Cystic Fibrosis Foundation (CFF) pour le financement de ce travail par le biais de son Consortium Structure CFTR 3D (numéro de subvention FORD08XX0). Nous reconnaissons l'énorme contribution de tous nos collègues au sein du Consortium à ce travail, en particulier dans la conception des gènes CFTR. Nous reconnaissons également la contribution inestimable des Drs. James Birtley (CNRS Demokritos, Grèce), Mark Young (Université de Cardiff, Royaume-Uni) et David Drew (Imperial College, Londres, Royaume-Uni) dans les premiers stades du travail. Nous remercions tout particulièrement le Dr Ina Urbatsch (Texas Tech. University, Lubbock) pour la lecture critique du manuscrit.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
FGY217 S.cerevisiae strain, with pep4 deletion 10
Yeast nitrogen base without amino acids Formedium CYN0410
Complete supplement mixture without uracil Formedium DCS0169
Bacteriological agar Sigma-Aldrich A5306
D-galactose Fisher BP656-500
D-glucose Fisher D16-500
Pepstatin A Sigma-Aldrich P4265
Leupeptin Merck 108975
Chymostatin Sigma-Aldrich C7268
Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) Sigma-Aldrich P7626
Epoxysuccinyl-leucylamido-butane (E-64) Sigma-Aldrich E3132
Amin–thylbenzenesulfonyl fluoride (AEBSF) Sigma-Aldrich A8456
Benzamidine hydrochloride Sigma-Aldrich 434760
Dimethylsulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418
dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich 43815
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Fisher BP120500
Tris-base Formedium TRIS01
Tris-HCl Fisher P631
D-sorbitol Sigma-Aldrich S1876
Glycerol Fisher 065017
NaCl Sigma-Aldrich S6191
n-dodecyl-β-D-maltopyranoside Affymetrix D310S
Bromophenol blue Sigma-Aldrich 114391
PageRuler Plus prestained protein standards Fermentas SM1811
NuSep tris-gly 4-20% gradient gels NuSep NB10-420
Instant Blue Coomassie Stain Novexin ISB1L
Glass beads, acid washed Sigma G8772
50ml Sterile Falcon Tubes Sarstedt 62.547.254
2ml Sterile screw-top vials Sarstedt 72.694.005
250ml Sterile Erlenmeyer baffled flasks BD Biosciences 355119
2l Sterile Erlenmeyer baffled flasks BD Biosciences 355131
2ml microfuge tubes Sarstedt 72.695
0.2μM syringe filter Sartorius FC121
ultracentrifuge tubes Beckman Coulter 355618
centrifuge tubes Beckman Coulter 357000
1l centrifuge pots Beckman Coulter 969329
Orbital shaking incubator with temperature control New Brunswick Scientific
Deltavision RT restoration microscope Applied Vision
Benchtop centrifuge HERMLE Z300
Benchtop microfuge Fisher 13-100-511
Vortex mixer Star Labs
Typhoon Trio Scanner GE Healthcare 63-0055-87
LAS3000 imaging system Fuji
20l fermenter vessel and control unit Applikon
Constant systems cell disrupter Constant systems
Beadbeater cell disrupter BioSpec 1107900
Mini-beadbeater-16 BioSpec 607
JA-17 rotor Beckman Coulter 369691
Optima L-100 Ultracentrifuge Beckman Coulter 392050
50.2Ti rotor Beckman Coulter 337901

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References

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Biologie moléculaire Numéro 61 des protéines membranaires la fibrose kystique la protéine CFTR expression de la protéine Fondation de la fibrose kystique système d'expression la protéine fluorescente verte
Expression et purification de la protéine transmembranaire de la fibrose kystique conductance Regulator dans<em> Saccharomyces cerevisiae</em>
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O'Ryan, L., Rimington, T., Cant, N., Ford, R. C. Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (61), e3860, doi:10.3791/3860 (2012).

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