Summary
Försök att uttrycka den cystisk fibros transmembran konduktans (CFTR) in
Abstract
Cystisk fibros transmembran konduktans-regulator (CFTR) är en klorid-kanal, att när muterade, kan ge upphov till cystisk fibros i humans.There är därför ett stort intresse för detta protein, men arbetet med att studera dess struktur och aktivitet har hindrats av svårigheten att uttrycka och rena tillräckliga mängder av proteinet 1-3. Liksom många "svår" eukaryota membranproteiner, är uttryck i ett snabbt växande organism önskvärt, men utmanande, och i jästen S. cerevisiae, som hittills låga mängder erhölls och snabb nedbrytning av det rekombinanta proteinet observerades 4-9. Proteiner involverade i behandlingen av rekombinant CFTR i jäst har beskrivits 6-9. I denna rapport beskriver vi en metod för uttryck av CFTR i jäst och rening i betydande mängder. Protokollet beskriver hur de tidigare proteolys problem kan lösas och hur nivåer uttryck avCFTR kan förbättras avsevärt genom att modifiera de villkor cell tillväxt och genom att kontrollera induktion villkor, särskilt den tid före cellen skörd. De reagants förknippade med detta protokoll (mus CFTR-uttryckande jästceller eller plasmider jäst) kommer att distribueras via USA cystisk fibros Foundation, som har sponsrat forskningen. En artikel som beskriver utformning och syntes av CFTR konstruktion som används i denna rapport kommer att publiceras separat (Urbatsch, I.,. Thibodeau, P. et al, opublicerad). I denna artikel kommer vi att förklara vår metod börjar med omvandlingen av jästcellerna med CFTR bygger - som innehåller jästplasmid (Fig. 1). Konstruktionen har en grönt fluorescerande protein (GFP)-sekvens fusionerad till CFTR vid sin C-terminus och följer det system som utvecklats av Drew et al. (2008) 10. GFP tillåter expression och rening av CFTR följas relativt lätt. Jové visualiserades protokollol slutar efter beredning av mikrosomer från jästceller, även om vi inkluderar några förslag för rening av proteinet från mikrosomer. Läsarna kanske vill lägga till sina egna ändringar i mikrosom reningsförfarandet, beroende på de slutliga försöken som skall genomföras med proteinet och den lokala utrustning som finns tillgänglig för dem. Den jästuttryckt CFTR-protein kan renas partiellt med användning av metalljon affinitetskromatografi med användning av en inneboende tagg polyhistidin rening. Efterföljande size exclusion kromatografi ger ett protein som förefaller vara> 90% ren såsom bedömdes genom SDS-PAGE och Coomassie-färgning av gelén.
Protocol
1. Beredning av media och buffertar
- YNB: För en liter, tillfälligt 6,9 g jästkvävebas utan aminosyror och 0,77 g komplett kosttillskott blandning utan uracil i 1 liter vatten. Autoklavera. Lagra vid 4 ° C.
- YNBA: För 400 ml, suspendera 2,76 g jästkvävebas utan aminosyror, 0,38 g komplett komplement blandning utan uracil och 8g bakteriologisk agar i 350 ml vatten. Autoklavera. Blanda 8 g glukos med 50 ml vatten och värm försiktigt tills det är upplöst. Sterilisera genom ett 0,2 m filter och lägga till YNBA medan agar är smält. Lagra vid rumstemperatur.
- 20% glukos medium: För 500 ml, blanda 100 g glukos med 500 ml YNB och värm försiktigt tills det är upplöst. Passera genom en 0,2 M-filter i en steril Duran flaska. Lagra vid rumstemperatur.
- 20% galaktos medium: För 2 liter, blanda 400 g galaktos med 2l YNB och värm försiktigt tills det är upplöst. Passera genom en 0,2 m filter i en steril Duran flaska. Förvara vid rumstemperaturenperatur.
- Proteashämmare lager: CFTR är mycket känslig för proteolys 4. Författarna fann följande hämmare vara effektiva i att begränsa proteolys, men läsare kan vilja anpassa denna förteckning att uppfylla sina egna behov. Lagra i 100 | il alikvoter vid -20 ° C för att reducera frys-tö-problem. Alla hämmare bör spädas från lager lösningar till den arbetande koncentrationen enligt nedan:
| Inhibitor | Mäldkoncentrationen | Mäldberedningen | Arbetskoncentration |
| AEBSF | 200 mM | Lös 48 mg i 1 ml destillerat vatten | 0,2 mM |
| Bensamidin | 300 mM | Lös 36 mg i 1 ml destillerat vatten | 0,3 mM |
| Kymostatin | 4 mM | Lös 2,5 mg i 1 ml torrt DMSÅ | 4 | iM |
| E-64 | 7 mM | Lös 2,5 mg i 1 ml destillerat vatten | 7 ^ M |
| Leupeptin | 20 mM | Lös 10 mg i 1 ml destillerat vatten | 20 pM |
| Pepstatin A | 15 mM | Lös 10 mg i 1 ml torr DMSO | 15 pM |
| PMSF | 1 M | Lös 174 mg i 1 ml torr DMSO | 1 mM |
- DTT (1 M): Lös 154 mg ditiotreitol i 1 ml destillerat vatten. Förvara vid -20 ° C. Använd vid 1:1000 utspädning i buffertar anges.
- EDTA (0,5 M): Blanda 29,22 g etylendiamintetraättiksyra med 100 ml vatten. Tillsätt 10 N NaOH droppvis tills allt EDTA har lösts och pH når 8. Späd till 200 ml med vatten och passera genom ett 0,2 pm filter in i en steril flaska Duran. Lagra vid rumstemperatur.
- CRB (300 mM Tris-HCl,pH 7,4, 0,56 M sorbitol, 1 mM EDTA): Lös 18,17 g Tris-bas i 350 ml vatten och justera pH till 7,4 genom tillsats av HCl. Lägg 51,35 g sorbitol och att volymen till 500 ml med vatten. Autoklavera. Tillsätt 1 ml EDTA stamlösning och förvaras vid 4 ° C.
- CFTR-buffert (50 mM Tris, pH 8,0, 10% vol / vol glycerol): Lös upp 6,06 g Tris-bas i 500 ml vatten. Justera pH till 8 med HCl, tillsätt 100 ml glycerol och späd till 1 liter med vatten. Autoklav och förvara vid 4 ° C.
- 2X belastning färgämne: 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 5% glycerol, 5 mM EDTA (pH 8,0), 0,02% bromfenolblått, 4% SDS, 0,05 M DTT. Gör 10 ml, alikvot och förvara vid -20 ° C.
2. Screening Transformanter
Detta protokoll antas att CFTR-GFP-8His fusionsgenen har insatts i en jästplasmid nedströms till en GAL1 galaktos promotor (Fig. 1) och att plasmiden har omvandlats till FGY217 celler, en pep4 deletions-mutant av S. cerevisiae 10 et al. (2008) 10.
- Pick 5-10 väl separerade kolonier från en transformation platta. Överför varje koloni med en separat steril 50 ml Falcon-rör innehållande 9 ml YNB och 1 ml 20% glukos-medium. För detta steg är det viktigt att ha en slutlig koncentration av 2% glukos (vikt / volym) i kulturen för upprätthållande av celltillväxt. Växa över natten i 16 timmar vid 250 varv per minut, 30 ° C i en orbital skakinkubator.
- Göra glycerolstamlösningar för vardera av de screenade kolonierna. Aseptiskt tillsätt 0,8 ml av de nattgamla kulturer till 0,2 ml steril glycerol i märkta med skruvlock ampuller, skaka snabbt och lagra vid -80 ° C.
- Späd de återstående övernattskulturer till en slutlig volym av 50 ml i YNB, inklusive 250 pl av 20% glukos-medium.För detta steg är det viktigt att späda glukoskoncentrationen till cirka 0,1% (vikt / vikt) i kulturen, eftersom hög glukoshalt kan undertrycka GAL 1-promotom 10. Växa kulturer i märkt 250 ml Erlenmeyer-kolvar bafflad till ett OD 600 på 0,7-0,8 vid 250 rpm, 30 ° C i en orbital skakinkubator.
- Inducera kulturerna genom tillsats av 5 ml 20% galaktos-medium till varje flaska och växa på under 16 timmar.
- Bekräfta uttrycket av CFTR med användning av fluorescens-mikroskopi. Ta 100 pl av kultur och tillsätt 100 pl glycerol för att begränsa cell rörlighet i lösning. Analysera cellerna på en Delta Vision RT restaurering mikroskop (eller liknande) med hjälp av en blå laser under en FITC-filter (excitationsvåglängd av 490 nm och emissionsvåglängd av 528-538 nm). Positiva uttryck av CFTR-GFP fusionsprotein bör vara synlig som en ring av fluorescensen vid plasmamembranet av jästcellerna. Otransformerade jästceller kan användas som en kontroll.
- Överförkulturer i 50 ml Falcon-rör. Skörda cellerna genom centrifugering vid 3500 x g, 4 ° C under 10 minuter i en bänkcentrifug. Medan centrifugen körs, förbereda 2 ml mikrofugrör med skruvkork innehåller ca 500 ^ syratvättade glaspärlor och lägg på is. Kasta supernatanterna och återsuspendera varje pellet i 500-800 ul iskall CRB med proteasinhibitorer. Överför suspensioner till mikrofugrör innehåller pärlorna och hålla på is.
- Lyse cellerna genom kraftig skakning / vortexa varje mikrofugrör för 10 perioder om 30 sekunder, vilar på is mellan perioderna. En beadbeater kan användas som ett alternativ, t.ex. en Biospec mini beadbeater drivs under 3 min.
- Placera rören i en mikrofug bänk och centrifugera vid 3500 x g, 4 ° C under 5 minuter. Överföra supernatanter innehållande den råa membranet populationen för att rengöra mikrofugrör och placera på is. Tillsätt 500 pl färsk is-samld CRB med proteasinhibitorer till varje rör och upprepa processen att ackumulera membranen.
- Samla de råa membranen genom spinning vid maximal hastighet, 4 ° C i en bordscentrifug mikrofug under 2 timmar. Kasta bort supernatanten och återsuspendera varje pellet i 50 | il iskall CFTR-buffert.
- I rena mikrocentrifugrör, blanda 15 ^ il av varje suspension med 15 | il 2x belastning färgämne genom pipettering upp och ned. Inkubera vid rumstemperatur under en 10 minuter. Inte koka inte proven, eftersom detta kommer att orsaka CFTR och andra membranproteiner att bilda SDS-olösliga aggregat och även denaturera GFP taggen.
- Ladda proverna tillsammans med PageRuler Plus förfärgade standarder protein (Fermentas) på en 4-20% Tris / glycin-gradient-gel (NuSep) och kördes vid 150 V under 40 minuter eller tills färgämnet front är vid botten av gelén.
- Identifiera de högsta uttryckande celler genom in-gel fluorescens. Ställe i en fluorescens avbildningssystem såsom en Typhoon skanner. Skanna gelen usjunga den blå laser vid en excitationsvåglängd av 488 nm och en emissionsvåglängd av 526 nm. CFTR-GFP fusionen ska vara synlig på cirka 220 kDa. Det kommer också att vara en svag fluorescerande band synligt vid ca 70 kDa, vilket är sannolikt en inneboende jäst FAD-innehållande membranprotein (som succinat dehydrogenas subenhet A) 11,12.
- Färga gelén med Coomassie, Avfärga och skanna gel för jämförelse med fluorescens sökningen med hjälp av en praktisk image-paket visning programvara. Coomassie-färgade gelén kan en relativ bedömning av CFTR-GFP-uttryck nivåer i olika klonala linjer efter normalisering för mängden av totalt protein laddades på varje bana av gelén.
- Streak reda på den högsta uttryckande cellinjen från glycerol lager (2,2) på en ny YNBA plattan och inkubera vid 30 ° C under 2-3 dagar. Denna platta kan sedan lagras i upp till 2 veckor vid 4 ° C.
3. Storskalig Fermenter Culture
- Förbered före-odlingar i jästanken. Skrapa en 1 cm 2 område av celler från YNBA platta (2,13) med användning av en steril ögla och tillsätt till 45 ml YNB-och 5 ml 20% glukos-medium, så att OD 600 är ungefär 0,1. Växa i 250 ml bafflade Erlenmeyerkolvar på 250 varv per minut, 30 ° C i en orbital inkubator skakning tills OD 600 når 1.
- Dela kulturen mellan två 2 förbryllad L Erlenmeyer kolvar vardera innehållande 450 ml YNB och 25 ml 20% glukos medium. Växer dessa på vid 250 rpm, 30 ° C i en orbital inkubator skakning tills OD 600 når 1,2.
- Även om dessa pre-odlingar växer, ställa in jästanken. Gör 11.2l av YNB som beskrivs i 1,1, men löser ytterligare 8,28 g YNB och 0,95 g släppa ut tillägg för att kompensera för tillsättning av glycerol vid induktion. Aseptiskt tillsätta 11,2 l YNB och 75 ml 20% glukos-medium till en steril 20l fermentationskärl och justera driften temperaturen till30 ° C.
- Aseptiskt tillsätta förkulturer till fermentorn och ställa in omrörningshastigheten till cirka 800 rpm och temperaturen hölls vid 30 ° C. Tryckluft bör rinna med cirka 15 dm 3 min -1. När jästanken kulturen når en OD 600 på 1,2, framkalla genom att aseptiskt tillsätta 1,5 l YNB 20% galaktos lösning och 1,2 l glycerol. Reducera temperaturen till 25 ° C och växer kulturen under 16 timmar.
- Överföra fermentorinnehållet i kylda 1l centrifugrör krukor på is med användning av en peristaltisk pump. Skörda cellerna genom centrifugering vid 3500 x g, 4 ° C under 30 minuter i en stor kapacitet rötor (t ex 6 liter). Återsuspendera cellerna i 150 ml iskall CRB med proteashämmare. Från och med nu bör allt arbete ske vid 4 ° C.
- Lysera cellerna genom att passera genom en konstant Systems Cell Disrupter vid 4 passager vid 25, 30, 32 och 35 kPa, uppsamling av lysatet på is i varje fall. Alternativt kan du använda en pärla Beater (Biospec) med en lika stor volym av syra-tvättade 0,5 mm glaspärlor och skaka under 3 minuter vid full effekt. Överföra lysatet till 50 ml Falcon-rör och pelleten celldebris genom centrifugering vid 3500 x g, 4 ° C under 15 minuter i en bordscentrifug.
- Överför supernatanten till kylda centrifugrör. Centrifugera vid 14.000 x g, 4 ° C under 30 minuter i en centrifug för att avlägsna mitokondrier.
- Överför supernatanten till kylda ultracentrifugrör. Centrifugera vid 200.000 x g, 4 ° C under 90 minuter i en ultracentrifug för att samla mikrosomer.
- Dekantera försiktigt och kasta bort supernatanten och tillsätt 2 ml iskall buffert CFTR med proteas-inhibitorer och 1 mM DTT till varje rör. Försiktigt återsuspendera pellets med hjälp av en pensel, fyll upp varje rör med CFTR buffert och blanda med hjälp av en vortexblandare.
- Centrifugera suspensionen vid 200.000 x g, 4 ° C under 60 minuter i en ultracentrifug, Kasta supernatanten och återsuspendera pelleten i 2 ml iskall buffert CFTR viktite proteasinhibitorer (Ingen DTT) med användning av en pensel.
- Pool de resuspenderade mikrosomer, justera den slutliga volymen till 50 ml med CFTR buffert och blanda väl. Reserv en 1 ml alikvot för SDS-PAGE-gel-analys, såsom beskrivs i 2,9 till 2,11. Mikrosomerna kan nu snabbfrystes i flytande kväve och lagrades därefter vid -80 ° C tills de behövdes.
- CFTR kan extraheras från mikrosomer med hjälp av någon av följande detergenter: litium perfluorooctonoate syra (LiPFO), tetradecanoly-lyso-fosfatidylglycerol (LPG14), n-dodecyl-β-D-maltosid (DDM). Blanda mikrosomer med CFTR-buffert, proteasinhibitorer och 5% detergent (vikt / vikt). Om DDM används också lägga 300 mM NaCl till bufferten. Omröra vid 4 ° C under 15 minuter på en tub rotator.
- Centrifugera proverna vid 100.000 x g, 4 ° C under 1 timme i en ultracentrifug. Kvarhålla supernatanten och ta en liten alikvot för SDS-PAGE-gelanalys. CFTR kan nu renas från solublised materialet genom immobiliserad metallaffinitetskromatografi följt av storleksuteslutningskromatografi.
4. Representativa resultat
Transformation av jäst med den CFTR-innehållande plasmiden är inte 100% effektiv. En representativ småskalig skärm av CFTR-expressionen i utvalda kolonier från en transformationsförsök ger ca 1 i 4 kolonier som uttrycker proteinet. Ett typiskt resultat från en skärm av 5 kolonier plockades från en platta visas i panel A i Figur. 3. En av kolonierna visar en stark grad av expression av CFTR-GFP fusionsprotein som typiskt sträcker sig mellan de 250 kDa och 130 kDa markörer, såsom visas. CFTR-GFP fluorescens nivåer varierar kraftigt mellan experiment, med koloni 4 i figur. 3 som visar minst 10x högre fluorescens än den inneboende fluorescerande band vid ca 70 kDa. Om expression nivåer av CFTR-GFP tycks ge mindre fluorescens än 70 kDa-bandet, så är det förmodligen värt åter omvandla och välja en kolonimed högre nivåer av CFTR-GFP-uttryck. Såsom visas i fig.. 3A, är det osannolikt, även med en hög nivå uttryck av CFTR-GFP, som CFTR-GFP-bandet kommer att vara urskiljbar i cellextraktet genom Coomassie-färgning.
När utvalda kolonier har odlats i större skala experiment mikrosomer och isolerade, förekomsten av CFTR-GFP inom mikrosomer kommer att behöva bedömas, visas i figur. 3B. Resultaten av detta experiment är viktiga, inte bara att bedöma effektiviteten i induktion av uttryck, men också att kontrollera att mikrosomerna har utarbetats noggrant och att proteolys har minimerats. Resultaten visas i Fig.. 3B antyder att i detta experiment CFTR-GFP-expression är något lägre (såsom bedömdes relativt den inneboende 70 kDa-bandet) än i den småskaliga experiment som visas i panel A. Emellertid detta avtryck är förspänd av överexponering av fluorescensdetektor i detta mätning. Detta berodde på att den som utför experimentet var checking med avseende på närvaro av proteolytiska fragment av CFTR-konstruktionen. Det finns vissa bevis i detta experiment för några lysrör proteolytiska fragment mellan 130 kDa och 100 kDa markörer, men dessa är mycket svag jämfört med den fulla längd CFTR-GFP band. Med proteashämmare som beskrivs här, finner vi få bevis för proteolytisk nedbrytning av CFTR efter cell brott. Om betydande proteolys observeras rekommenderar vi göra nya proteashämmare lösningar hämmare lager. Vi har också funnit att kommersiella proteasinhibitorcocktail tabletter är inte så effektiva för detta system. Tillväxt av celler utanför 16 h (efter induktion) kommer att ge upphov till minskad CFTR-expression, såsom visas i figur 4. Detta beror troligen på omsättningen av proteinet, kanske på grund av uppreglering av jästproteinet kvalitetskontroll maskiner 6-9,13. Det är därför tillrådligt att övervaka CFTR uttryck nivåer efter induktion med galaktos, om möjligt, eftersom den optimala tiden för att skörda cellerna may varierar från ett laboratorium till ett annat.
Figur 1. CFTR konstruktionen som innehåller jästplasmid. CFTR-GFP-fusionsprotein 8His införes i 2μ p424GAL1 expressionsvektor, under kontroll av en galaktos (GAL 1)-promotor. Vektorn innehåller också en markör uracil selektion (URA) och en ampicillinresistensgen (amp).
Figur 2. Ett flödesschema som sammanfattar visualiseras protokollet.
Figur 3. Representativa SDS-PAGE-geler av CFTR-expression och rening. Panel A visar fem slumpmässigt plockade transformanta kolonier (banorna 1-5) som screenades för CFTR-expression. Panel B visar mikrosomer som isolerades från ett 15L FERMin kultur. Fält C visar renat murint CFTR erhölls efter två steg rening med användning av affinitetskromatografi följt av storleksuteslutningskromatografi. Alla geler visas i belysningsförhållanden excitera fluorescens från GFP-domänen (vänster) och efter Coomassie-färgning (höger). De relativa lägena för molekylviktsstandarder listas till vänster (kDa).
Figur 4. Representativa data för uttryck av CFTR i jäst. Panel A visar ett tidsförlopp av CFTR-expressionen efter induktion med galaktos. Cellextrakt analyserades med SDS-PAGE, och GFP-fluorescens för CFTR-GFP-proteinet band integreras. Panel B visar typiska resultat för fluorescensmikroskopi av GFP-uttryckande celler 16 h efter induktion. Normalt är endast en bråkdel av cellerna uttrycka CFTR vid höga nivåer.
Discussion
Detta papper tillhandahåller en metod för expression av murint CFTR-protein i jästceller, vilket bör underlätta forskning på cystisk fibros. Målet är att koppla detta papper med lanseringen av den murina CFTR DNA-konstruktionen, som kommer att vara tillgängliga via cystisk fibros Foundation ( http://www.cff.org/research/CFFT/ ). Andra ortologer bör bli tillgänglig senare. Transformation av jästceller med CFTR-vektorn är okomplicerad, men det är viktigt att screena för kolonier som uttrycker höga nivåer av CFTR. Variabla uttrycksnivåer kan uppstå av flera faktorer, men antalet kopior av plasmiden per cell förmodligen står för en betydande grad av variation. Kritiska steg som beskrivs här bör göra det möjligt produktion av CFTR-uttryckande jästceller och CFTR-innehållande mikrosomala membran. När omvandling, tillväxt, skörd och lys av jästceller har bemästrat, Purifblue av proteinet bör vara möjligt, och i Figur 3 har vi gett ett exempel på renhet som bör kunna uppnås i detta fall som ett användbart riktmärke. Det är inte vår avsikt detta manuskript för att ge detaljerad metod för rening av proteinet. Det finns dock några viktiga nedströms reningssteg som är specifika för S.cerevisae uttrycket, såsom cell-lys och mikrosom rening, och dessa har tagits med i detalj i detta manuskript. Det bör emellertid nämnas att, bortsett från de två metoderna som vi har använt, kan alternativa jäst cellsönderdelning metoder användas, såsom användning av en fransk tryckcell. Det rekombinanta proteinet har en TEV-klyvbar C-terminala GFP domän som tillåter att proteinet som skall spåras efter induktion (Fig. 4). Jäst har en inneboende 70 kDa protein (förmodligen succinatdehydrogenas 12) som fluorescerar under samma villkor 11, och detta kan ge ett användbart blandNal kalibreringsstandard för de relativa expressionsnivåerna för CFTR i hela cellextrakt eller mikrosomer (fig. 3). Det framgår klart av de data som visas i figur 4 att tidsanpassningen för cellskörd efter induktion med galaktos är avgörande. Utbyten av CFTR droppe förhastat efter ungefär 16 timmar av induktion, så att det är knappt någon påvisbar CFTR i jästceller efter 24 timmars induktion.
Utbytet av renat protein är ca 1-2mg CFTR-protein per 15 liters fermentor kultur. Återvinning kan uppskattas som ca 70% av den totala CFTR-GFP-proteinet upp till mikrosom steget och omkring 25% återvinning av renat protein. Karakterisering av S. cerevisiae-uttryckt CFTR pågår. Såsom ses i FIG. 4, kan proteinets lokalisering i cellen övervakas genom fluorescensmikroskopi. Även om mycket av fluorescens hittas runt periferin av cellen som förväntat 10 visar en del av proteinet en punktformig lokalisering, antingen i ellerbara inuti plasmamembranet som skulle kunna bero på CFTR återvinns med hjälp av en sent Golgi / endosomala reaktionsvägen 14 eller kanske en nedströmskammare av knoppning av transport vesiklar från ER 4. Behandling med PNGasF, ett enzym som deglycosylates proteiner visade minimal förändring av migreringen av CFTR-proteinet på SDS-PAGE, vilket tyder på att det är oglykosylerat, eller har minimal glykosylering 15. Experiment på fosforyleringstillståndet för proteinet är på gång. I vissa av de detergenter som testats hittills, uppvisar det renade proteinet ATPas-aktivitet (som inhiberas av en CFTR-specifik hämmare 16) vid hastigheter som är jämförbara med de som tidigare publicerats 2,15. Mätning av CFTR-kanalaktivitet kräver rekonstituering av det renade proteinet, vilket skulle innebära ett slutligt reningssteg i en detergent som har en relativt hög kritisk micellkoncentration (CMC) 17. Jäst mikrosomer containing CFTR kan solublised med flera vanligen använda rengöringsmedel 18, inklusive detergenter såsom dodecyl maltosid 2, som allmänt anses vara "mild". Men de flesta höga CMC rengöringsmedel har visat sig vara ineffektivt för solubilsation hittills tyder på att utbytet i dessa rengöringsmedel bör betraktas på ett sent stadium i någon rening system.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi tackar cystisk fibros Foundation (CFF) för att finansiera detta arbete genom sitt CFTR 3D Structure Consortium (licensnummer FORD08XX0). Vi erkänner den enorma bidrag från alla våra kolleger inom konsortiet till detta arbete, särskilt i utformningen av CFTR gener. Vi erkänner också ovärderliga bidrag Dr. James Birtley (NCSR Demokritos, Grekland), Mark Young (University of Cardiff, Storbritannien) och David Drew (Imperial College, London, Storbritannien) i ett tidigt skede av arbetet. Vi tackar särskilt Dr Ina Urbatsch (Texas Tech. University, Lubbock) för kritisk läsning av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FGY217 S.cerevisiae strain, with pep4 deletion 10 | |||
| Yeast nitrogen base without amino acids | Formedium | CYN0410 | |
| Complete supplement mixture without uracil | Formedium | DCS0169 | |
| Bacteriological agar | Sigma-Aldrich | A5306 | |
| D-galactose | Fisher | BP656-500 | |
| D-glucose | Fisher | D16-500 | |
| Pepstatin A | Sigma-Aldrich | P4265 | |
| Leupeptin | Merck | 108975 | |
| Chymostatin | Sigma-Aldrich | C7268 | |
| Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| Epoxysuccinyl-leucylamido-butane (E-64) | Sigma-Aldrich | E3132 | |
| Amin–thylbenzenesulfonyl fluoride (AEBSF) | Sigma-Aldrich | A8456 | |
| Benzamidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 434760 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher | BP120500 | |
| Tris-base | Formedium | TRIS01 | |
| Tris-HCl | Fisher | P631 | |
| D-sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 | |
| Glycerol | Fisher | 065017 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 | |
| n-dodecyl-β-D-maltopyranoside | Affymetrix | D310S | |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | 114391 | |
| PageRuler Plus prestained protein standards | Fermentas | SM1811 | |
| NuSep tris-gly 4-20% gradient gels | NuSep | NB10-420 | |
| Instant Blue Coomassie Stain | Novexin | ISB1L | |
| Glass beads, acid washed | Sigma | G8772 | |
| 50ml Sterile Falcon Tubes | Sarstedt | 62.547.254 | |
| 2ml Sterile screw-top vials | Sarstedt | 72.694.005 | |
| 250ml Sterile Erlenmeyer baffled flasks | BD Biosciences | 355119 | |
| 2l Sterile Erlenmeyer baffled flasks | BD Biosciences | 355131 | |
| 2ml microfuge tubes | Sarstedt | 72.695 | |
| 0.2μM syringe filter | Sartorius | FC121 | |
| ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 355618 | |
| centrifuge tubes | Beckman Coulter | 357000 | |
| 1l centrifuge pots | Beckman Coulter | 969329 | |
| Orbital shaking incubator with temperature control | New Brunswick Scientific | ||
| Deltavision RT restoration microscope | Applied Vision | ||
| Benchtop centrifuge | HERMLE | Z300 | |
| Benchtop microfuge | Fisher | 13-100-511 | |
| Vortex mixer | Star Labs | ||
| Typhoon Trio Scanner | GE Healthcare | 63-0055-87 | |
| LAS3000 imaging system | Fuji | ||
| 20l fermenter vessel and control unit | Applikon | ||
| Constant systems cell disrupter | Constant systems | ||
| Beadbeater cell disrupter | BioSpec | 1107900 | |
| Mini-beadbeater-16 | BioSpec | 607 | |
| JA-17 rotor | Beckman Coulter | 369691 | |
| Optima L-100 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 392050 | |
| 50.2Ti rotor | Beckman Coulter | 337901 |
References
- Ford, R. C., Birtley, J., Rosenberg, M. F., Zhang, L. CFTR three-dimensional structure. Methods Mol. Biol. 741, 329-346 (2011).
- Rosenberg, M. F., Kamis, A. B., Aleksandrov, L. A., Ford, R. C., Riordan, J. R. Purification and crystallization of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. CFTR). J. Biol. Chem. 279, 39051-39051 (2004).
- Zhang, L., Aleksandrov, L. A., Riordan, J. R., Ford, R. C. Domain location within the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein investigated by electron microscopy and gold labelling. Biochim. Biophys. Acta. 1808, 399-404 (2011).
- Kiser, G. L. Expression and degradation of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in Saccharomyces cerevisiae. Arch. Biochem. Biophys. 390, 195-205 (2001).
- Huang, P., Stroffekova, K., Cuppoletti, J., Mahanty, S. K., Scarborough, G. A. Functional expression of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in yeast. Biochim. Biophys. Acta. 1281, 80-90 (1996).
- Ahner, A., Nakatsukasa, K., Zhang, H., Frizzell, R. A., Brodsky, J. L. Small heat-shock proteins select deltaF508-CFTR for endoplasmic reticulum-associated degradation. Mol. Biol. Cell. 18, 806-814 (2007).
- Fu, L., Sztul, E. ER-associated complexes (ERACs) containing aggregated cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are degraded by autophagy. Eur. J. Cell. Biol. 88, 215-226 (2009).
- Sun, F. Derlin-1 promotes the efficient degradation of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) and CFTR folding mutants. J. Biol. Chem. 281, 36856-36863 (2006).
- Zhang, Y., Michaelis, S., Brodsky, J. L. CFTR expression and ER-associated degradation in yeast. Methods Mol. Med. 70, 257-2565 (2002).
- Drew, D. GFP-based optimization scheme for the overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae. Nat. Protoc. 3, 784-798 (2008).
- Knight, A. W., Billinton, N. Seeing the wood through the trees: A review of techniques for distinguishing green fluorescent protein from endogenous autofluorescence. Anal. Biochem. 291, 175-197 (2001).
- Robinson, K. M., Lemire, B. D. Isolation and nucleotide sequence of the Saccharomyces cerevisiae gene for the succinate dehydrogenase flavoprotein subunit. J. Biol. Chem. 267, 10101-10107 (1992).
- Gnann, A., Riordan, J. R., Wolf, D. H. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator degradation depends on. the lectins Htm1p/EDEM and the Cdc48 protein complex in. 15, 4125-4135 (2004).
- Yoo, J. S. Non-conventional trafficking of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator through the early secretory pathway. J. Biol. Chem. 277, 11401-11409 (2002).
- Zhang, L. Architecture of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein and structural changes associated with phosphorylation and nucleotide binding. Journal of Structural Biology. 167, 242-251 (2009).
- Wellhauser, L. A small-molecule modulator interacts directly with deltaPhe508-CFTR to modify its ATPase activity and conformational stability. Mol. Pharmacol. 75, 1430-148 (2009).
- Ramjeesingh, M. A monomer is the minimum functional unit required for channel and ATPase activity of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Biochemistry. 40, 10700-10706 (2001).
- Huang, P., Liu, Q., Scarborough, G. A. Lysophosphatidylglycerol: a novel effective detergent for solubilizing and purifying the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Anal. Biochem. 259, 89-97 (1998).
