Summary
Versuche, die zystische Fibrose Transmembran Regulator (CFTR) in Ausdruck
Abstract
Die zystische Fibrose Transmembran Regulator (CFTR) ist ein Chlorid-Kanal, die im Fall einer Mutation entstehen Mukoviszidose in humans.There geben können, ist daher ein großes Interesse in diesem Protein, aber die Bemühungen um die Struktur und Aktivität zu untersuchen haben, durch die Schwierigkeit behindert worden Expression und Aufreinigung von ausreichenden Mengen des Proteins 1-3. Wie viele "schwierige" eukaryotischen Membranproteine, ist Ausdruck in einer schnell wachsenden Organismus wünschenswert, aber eine Herausforderung, und in der Hefe S. cerevisiae, so weit geringe Mengen erhalten und einen schnellen Abbau des rekombinanten Proteins wurde 4-9 beobachtet. Proteine, die in der Verarbeitung von rekombinanten CFTR in Hefe beteiligt wurden 6-9 beschrieben. In diesem Bericht beschreiben wir eine Methode zur Expression des CFTR in Hefe und dessen Reinigung in signifikanten Mengen. Das Protokoll beschreibt, wie die früheren Proteolyse Probleme überwunden werden können und wie Expression vonCFTR läßt sich durch Änderung der Bedingungen und Zellwachstum durch die Kontrolle der Induktionsbedingungen verbessert werden, insbesondere die Zeit vor der Zellernte. Die reagants mit diesem Protokoll (murine CFTR-exprimierenden Hefezellen oder Hefeplasmide) wird über den US-Cystic Fibrosis Foundation, die die Forschung gefördert hat, verteilt werden assoziiert. Ein Artikel beschreibt das Design und die Synthese des CFTR in diesem Bericht verwendeten Konstrukt wird getrennt veröffentlicht (Urbatsch, I.;. Thibodeau, P. et al, unveröffentlicht). In diesem Artikel erklären wir Ihnen, unsere Verfahren beginnend mit der Transformation der Hefezellen mit dem CFTR-Konstrukt - haltigen Hefe-Plasmid (Abb. 1). Das Konstrukt ist ein grün fluoreszierendes Protein (GFP)-Sequenz fusioniert am C-Terminus CFTR und folgt dem System von Drew et al. (2008) 10. Das GFP erlaubt die Expression und Reinigung von CFTR zu relativ leicht verfolgt werden. Die JoVE visualisiert Protokollol endet nach der Herstellung von Mikrosomen, die aus den Hefezellen, obwohl wir auch einige Vorschläge zur Reinigung des Proteins aus den Mikrosomen sind. Leser können auf Wunsch ihre eigenen Änderungen der Mikrosomen Reinigungsverfahren, abhängig von den endgültigen Experimente mit dem Protein und der lokalen Einrichtung steht, um sie durchgeführt werden hinzuzufügen. Die Hefe exprimierten CFTR-Protein teilweise gereinigt werden, indem Metallionen-Affinitätschromatographie unter Verwendung einer intrinsischen Polyhistidin-Tag Reinigung. Nachfolgende Größenausschlusschromatographie ergibt ein Protein, das als> 90% rein, wie durch SDS-PAGE und Coomassie-Färbung des Gels beurteilt wird.
Protocol
1. Vorbereitung der Medien und Puffer
- YNB: Für einen Liter, auszusetzen 6,9 g Yeast Nitrogen Base ohne Aminosäuren und 0,77 g komplette Ergänzung Mischung ohne Uracil in 1 l Wasser. Autoklaven. Lagerung bei 4 ° C.
- YNBA: Für 400 ml, 2,76 g auszusetzen Yeast Nitrogen Base ohne Aminosäuren, 0,38 g komplette Ergänzung Mischung ohne Uracil und 8g bakteriologischer Agar in 350 ml Wasser. Autoklaven. Mix 8 g Glukose mit 50 ml Wasser und erhitzt leicht, bis es gelöst ist. Sterilisieren durch einen 0,2 um Filter und Ergänzungen der YNBA während der Agar geschmolzen ist. Lagerung bei Raumtemperatur.
- 20% Glucose-Medium: Für 500 ml, mischen 100 g Glukose mit 500 ml YNB und erhitzt leicht, bis es gelöst ist. Fahren Sie durch einen 0,2 um Filter in eine sterile Flasche Duran. Lagerung bei Raumtemperatur.
- 20% Galactose-Medium: Für 2 Liter, 400 g Galaktose mischen mit 2l YNB und erhitzt leicht, bis es gelöst ist. Fahren Sie durch einen 0,2 um Filter in ein steriles Duran Flasche. Lagerung bei Raumtemperaturtur.
- Protease-Inhibitor Aktien: CFTR ist sehr anfällig für Proteolyse 4. Die Autoren fanden folgende Inhibitoren wirksam zu sein in der Einschränkung der Proteolyse, obwohl Leser zugeschnitten diese Liste wünschen, können ihren eigenen Anforderungen gerecht zu werden. Shop in 100 ul Aliquots bei -20 ° C bis Frost-Tau-Probleme zu reduzieren. Alle Inhibitoren sollte aus den Stammlösungen der Konzentration arbeiten, wie unten verdünnt werden:
| Inhibitor | Stoffkonzentration | Stoffaufbereitung | Arbeitskonzentration |
| AEBSF | 200 mM | Auflösen 48mg in 1 ml destilliertem Wasser | 0,2 mM |
| Benzamidin | 300 mM | Auflösen 36mg in 1 ml destilliertem Wasser | 0,3 mM |
| Chymostatin | 4 mM | Man löst 2,5 mg in 1 ml trockenem DMSO | 4 uM |
| E-64 | 7 mM | Man löst 2,5 mg in 1 ml destilliertem Wasser | 7 uM |
| Leupeptin | 20 mM | Man löst 10 mg in 1 ml destilliertem Wasser | 20 uM |
| Pepstatin A | 15 mM | Man löst 10 mg in 1 ml trockenem DMSO | 15 uM |
| PMSF | 1 M | Auflösen 174mg in 1ml trockenem DMSO | 1 mM |
- DTT (1 M): Man löst 154 mg Dithiothreitol in 1 ml destilliertem Wasser. Lagerung bei -20 ° C. Verwenden Sie bei einer Verdünnung von 1:1000 in Puffer angegeben.
- EDTA (0,5 M): Mix 29,22 g Ethylendiamintetraessigsäure mit 100 ml Wasser. In 10 N NaOH tropfenweise, bis das gesamte EDTA wurde gelöst und der pH-Wert 8 erreicht. Machen Sie bis zu 200 ml mit Wasser und fahren durch einen 0,2 um Filter in eine sterile Flasche Duran. Lagerung bei Raumtemperatur.
- CRB (300 mM Tris-HCl,pH 7,4, 0,56 M Sorbit, 1 mM EDTA): Man löst 18,17 g Tris-Base in 350 ml Wasser und pH auf 7,4 durch Zugabe von HCl. In 51,35 g Sorbit und machen Volumen bis zu 500 ml mit Wasser. Autoklaven. 1 ml EDTA-Stammlösung und lagern bei 4 ° C.
- CFTR-Puffer (50 mM Tris, pH 8,0, 10% v / v Glycerol): Man löst 6,06 g Tris-Base in 500 ml Wasser. Der pH-Wert bis 8 mit HCl, 100 ml Glycerin und auf 1 L mit Wasser. Autoklavieren und bei 4 ° C.
- 2x Last Farbstoff: 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 5% Glycerin, 5 mM EDTA (pH 8,0), 0,02% Bromphenolblau, 4% SDS, 0,05 M DTT. Machen Sie 10 ml, portionieren und bei -20 ° C.
2. Screening Transformanten
Dieses Protokoll geht davon aus, dass der CFTR-GFP-Fusion 8His Gens in einen Hefe-Plasmid stromabwärts zu einer GAL1 Galaktose-Promotor (Abb. 1) und wurde eingefügt, dass das Plasmid wurde in FGY217 Zellen, ein PEP4 Deletionsmutante von S. cerevisiae 10 umgewandelt worden et al. (2008) 10 beschrieben.
- Wählen 5-10 gut getrennte Kolonien aus einer Transformation Platte. Übertragen Sie jede Kolonie eine separate sterile 50 ml Falcon-Röhrchen mit 9 ml YNB und 1 ml 20% Glucose-Medium. Für diesen Schritt ist es wichtig, um eine Endkonzentration von 2% Glucose (w / v) in der Kultur, um das Zellwachstum aufrechtzuerhalten haben. Wachsen Sie über Nacht für 16 Stunden bei 250 rpm, 30 ° C in einem Orbital Schüttelinkubator.
- Machen Glycerin Aktien für jede der abgeschirmten Kolonien. Aseptisch 0,8 ml der Übernacht-Kulturen bis 0,2 ml steriles Glycerin in etikettierten Flaschen mit Schraubverschluss, kurz vortexen und Speicher bei -80 ° C
- Verdünnen Sie die verbleibenden Kulturen über Nacht zu einem endgültigen Volumen von 50 ml in YNB, darunter 250 ul 20% Glucose-Medium.Für diesen Schritt ist es wichtig, um die Glucosekonzentration auf etwa 0,1% (w / w) in der Kultur zu schwächen, weil die hohe Glukose GAL1-Promotors 10 unterdrücken kann. Wachsen Kulturen in etikettierten 250 ml Erlenmeyerkolben Kolben mit Schikanen zu einer OD 600 von 0,7-0,8 bei 250 rpm, 30 ° C in einem Orbital Schüttelinkubator.
- Induzieren die Kulturen durch Zugabe von 5 ml 20% Galactose-Medium pro Flasche und wachsen auf 16 Stunden.
- Bestätigen Sie die Expression von CFTR mittels Fluoreszenzmikroskopie. Nehmen Sie 100 ul der Kultur und der Zugabe von 100 ul Glycerin zu Zelle Mobilität in Lösung zu begrenzen. Analyse Zellen in einem Delta Vision RT Wiederherstellung Mikroskop (oder ähnlich), mit blauem Laser unter einem FITC-Filters (Anregungswellenlänge von 490 nm und Emissionswellenlänge von 528-538 nm). Positiv Expression des CFTR-GFP-Fusionsprotein sichtbar sein soll als ein Ring der Fluoreszenz an der Plasmamembran der Hefezellen. Nicht transformierte Hefezellen kann als Kontrolle verwendet werden.
- Übertragen Sie dieKulturen in 50ml Falcon-Röhrchen. Ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 3500 xg, 4 ° C für 10 Minuten in einer Tischzentrifuge. Während die Zentrifuge läuft, bereiten Sie 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit Schraubdeckel mit etwa 500 ul säuregewaschen Glasperlen und auf Eis stellen. Die Überstände verwerfen und Pellet resuspendieren gegenseitig in 500-800 ul eiskaltem CRB mit Protease-Inhibitoren. Übertragen Sie die Suspensionen zu den Mikrozentrifugenröhrchen mit den Perlen und halten Sie auf dem Eis.
- Lyse der Zellen durch kräftiges Schütteln / Vortexen jedes Mikrozentrifugenröhrchen für 10 Perioden von 30 Sekunden, ruhen auf dem Eis zwischen den Perioden. Ein BeadBeater als Alternative eingesetzt werden können, z. B. ein Mini BioSpec BeadBeater für 3 min betrieben.
- Die Röhrchen in ein Tisch-Mikrozentrifuge und Zentrifuge bei 3500 xg, 4 ° C für 5 Minuten. Die Überstände, die das rohe Membran Bevölkerung zu Mikrozentrifugenröhrchen und auf Eis zu reinigen. Fügen Sie 500 ul frisches Eis-cold CRB mit Protease-Inhibitoren in jedes Röhrchen und wiederholen Sie den Vorgang, um die Membranen anreichern.
- Sammeln Sie die Rohöl-Membranen durch Spinnen bei maximaler Geschwindigkeit, 4 ° C in einer Tischzentrifuge Mikrozentrifuge für 2 Stunden. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren jedes Pellet in 50 ul eiskaltem Puffer CFTR.
- In sauberen Mikrozentrifugenröhrchen, Mix 15 ul jeder Federung mit 15 ul 2x Last Farbstoff durch Auf-und Abpipettieren. Inkubieren bei Raumtemperatur für 10 Minuten. Nicht kochen die Proben, da dies CFTR und andere Membranproteine verursachen wird der SDS-unlösliche Aggregate bilden und auch denaturieren, die das GFP-Tag.
- Laden der Proben mit PageRuler Zzgl. vorgefärbten Proteinstandards (Fermentas) auf ein 4-20% Tris / Glycin-Gradienten-Gel (NuSep) und führen bei 150 V für 40 Minuten oder bis der Farbstoff-vorne an der Unterseite des Gels ist.
- Identifizieren der höchsten exprimierenden Zellen durch In-Gel-Fluoreszenz. In einen Fluoreszenz-Bildgebungsvorrichtung, wie beispielsweise einem Taifun Scanner. Scannen Sie das Gel usingen die blauen Laser mit einer Anregungswellenlänge von 488 nm und einer Emissionswellenlänge von 526 nm. Das CFTR-GFP-Fusion sichtbar sein soll bei ca. 220 kDa. Es wird auch eine schwach fluoreszierenden Bande sichtbar bei etwa 70 kDa, die wahrscheinlich eine intrinsische Hefe FAD-enthaltende Membran-Protein (wie Succinat-Dehydrogenase Untereinheit A) 11,12 sein.
- Färben des Gels mit Coomassie, entfärben und scannen Sie das Gel zum Vergleich mit dem Fluoreszenz-Scan über eine komfortable Bildbetrachtung Software-Paket. Die Coomassie-gefärbten Gel ermöglicht eine relative Bewertung von CFTR-GFP-Expression, die in unterschiedlichen klonalen Linien nach der Normalisierung für die Menge an Gesamtprotein auf jeder Spur des Gels geladen.
- Streak aus dem höchsten exprimierenden Zelllinie aus seiner Glycerin Lager (2,2) auf eine frische YNBA Platte und inkubieren bei 30 ° C für 2-3 Tage. Diese Platte kann dann gelagert werden bis zu 2 Wochen bei 4 ° C
3. Großflächige Fermenter Culture
- Planen Vorkulturen für den Fermenter. Kratzen Sie einen 1cm 2 Fläche von Zellen aus dem YNBA Platte (2,13) in eine sterile Schleife und in den 45 ml YNB und 5 ml 20% Glucose-Medium, so dass die OD 600 ungefähr 0,1 ist. Wachsen Sie in 250 ml Erlenmeyer Kolben mit Schikanen bei 250 rpm, 30 ° C in einem Orbital Schüttelinkubator bis die OD 600 erreicht 1.
- Teilen Sie die Kultur zwischen zwei 2 l-Erlenmeyer-Kolben mit Schikanen jeweils das 450 ml YNB und 25 ml 20% Glucose Medium. Wachsen diese auf 250 UpM, 30 ° C in einem Orbital Schüttelinkubator bis die OD 600 1,2 erreicht.
- Während diese Vorkulturen wachsen, richten Sie den Fermenter. Machen 11.2l von YNB wie in 1.1 beschrieben, lösen sich aber eine zusätzliche 8,28 g und 0,95 g YNB drop out Ergänzung für den Zusatz von Glycerin bei Induktion zu kompensieren. Aseptisch die 11,2 l YNB und 75 ml 20% Glucose-Medium in ein steriles 20l Fermentergefäß und stellen Sie die Betriebstemperatur zu30 ° C
- Aseptisch den Vorkulturen auf den Fermenter und stellen Sie die Rührgeschwindigkeit auf ca. 800 Umdrehungen pro Minute und dass die Temperatur bei 30 ° C Druckluft sollte bei ca. 15 dm 3 min -1 fließen. Sobald die Fermenterkultur erreicht eine OD 600 von 1,2, induziert durch Zugabe von 1,5 l aseptisch YNB 20% Galaktose-Lösung und 1,2 l Glycerin. Reduzieren der Temperatur auf 25 ° C wachsen und die Kultur für 16 Stunden.
- Übertragen Sie die Fermenterinhalt in gekühlte Zentrifuge 1l Töpfe auf dem Eis mit Hilfe einer Schlauchpumpe. Ernten der Zellen mittels Zentrifugation bei 3.500 × g, 4 ° C für 30 Minuten in einer großen Kapazität Rotor (zB 6 Liter). Die Zellen in 150 ml eiskaltem CRB mit Protease-Inhibitoren. Von nun an sollten alle Arbeiten bei 4 ° C durchgeführt werden
- Lyse der Zellen durch Durchleiten durch einen Constant Systems Zelle Unterbrecher in 4 Durchläufen bei 25, 30, 32 und 35 kPa, Sammeln des Lysats auf Eis in jedem Fall. Alternativ können Sie einen Wulst Beater (Biospec) mit einem gleichen Volumen von sauer gewaschene 0,5 mm Glasperlen und für 3 Minuten bei voller Leistung bewegen. Übertragen des Lysats auf 50ml Falcon-Röhrchen und Pellet die Zelltrümmer durch Zentrifugation bei 3.500 × g, 4 ° C für 15 Minuten in einer Tischzentrifuge.
- Den Überstand in Zentrifugenröhrchen gekühlt. Zentrifugieren bei 14000 × g, 4 ° C für 30 Minuten in einer Zentrifuge zu entfernen, Mitochondrien.
- Überstand in gekühlten Ultrazentrifuge Röhren. Zentrifuge bei 200.000 × g, 4 ° C für 90 Minuten in einer Ultrazentrifuge zur Mikrosomen sammeln.
- Vorsichtig dekantieren und den Überstand verwerfen und fügen 2ml eiskaltem CFTR-Puffer mit Protease-Inhibitoren und 1 mM DTT in jedes Röhrchen. Vorsichtig resuspendieren Pellets mit einem Pinsel, füllen Sie jedes Röhrchen mit Puffer-und CFTR-Mix mit einem Vortexer.
- Zentrifugieren Sie die Suspension bei 200.000 xg, 4 ° C für 60 Minuten in der Ultrazentrifuge, verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Pellets in 2 ml eiskaltem Puffer CFTR wi-ten Protease-Inhibitoren (Kein DVB-T) mit einem Pinsel.
- Pool die resuspendierten Mikrosomen auf das Endvolumen auf 50 ml mit CFTR-Puffer und gut mischen. Reservieren Sie ein 1 ml Aliquot für SDS-PAGE-Gel-Analyse, wie in 2.9 beschrieben - 2,11. Die Mikrosomen kann nun in flüssigem Stickstoff gefroren und dann bei -80 ° C bis zum Gebrauch.
- Lithium-perfluorooctonoate Säure (LiPFO), tetradecanoly-lyso-Phosphatidylglycerin (LPG14), n-Dodecyl-β-D-maltosid (DDM): CFTR aus Mikrosomen mit einer der folgenden Reinigungsmittel extrahiert werden. Mische die Mikrosomen mit CFTR-Puffer, Protease-Inhibitoren und 5% Detergens (w / w). Wenn DDM verwendet wird, auch hinzufügen, 300 mM NaCl in den Puffer. Schütteln bei 4 ° C für 15 Minuten auf einem Rohr Rotator.
- Zentrifugation der Proben bei 100.000 × g, 4 ° C für 1 Stunde in einer Ultrazentrifuge. Bewahren Sie den Überstand und nehmen einen kleinen Aliquot für SDS-PAGE-Gel-Analyse. CFTR kann nun aus dem Material solublised durch immobilisierte Metall gereinigt werdenAffinitätschromatographie gefolgt von Größenausschlusschromatographie.
4. Repräsentative Ergebnisse
Transformation von Hefe mit dem CFTR-enthaltenden Plasmid ist nicht zu 100% effizient. Ein Vertreter kleinen Bildschirm des CFTR-Expression in ausgewählten Kolonien aus einer Transformation Experiment wird etwa 1 zu 4 Kolonien die das Protein exprimieren nachgeben. Ein typisches Ergebnis von einem Bildschirm von 5 Kolonien von einer Platte aufgenommen ist in Panel A Abb. 3. Eine der Kolonien zeigt ein hohes Maß an Expression des CFTR-GFP-Fusionsprotein, die typischerweise verläuft zwischen der 250 kDa und 130 kDa-Marker, wie gezeigt. Die CFTR-GFP-Fluoreszenz Ebenen werden jedoch unterschiedlich Experimente, mit Kolonie 4 in Abb. 3, aus denen mindestens 10-fach höhere Fluoreszenz als die intrinsische Fluoreszenz-Bande bei etwa 70kDa. Wenn Expression von CFTR-GFP-Fluoreszenz zu geben weniger als die 70 kDa Bande erscheinen, dann ist es wohl wert, neu zu verwandeln und die Auswahl einer Koloniemit einem höheren CFTR-GFP-Expression. Wie in gezeigt. 3A, ist es unwahrscheinlich, auch mit einer hohen Expression des CFTR-GFP, dass die CFTR-GFP-Band wird erkennbar sein im Zellextrakt durch Coomassie-Färbung.
Nach der Auswahl Kolonien wurden in größerem Umfang Experimente angebaut worden, Mikrosomen und isoliert, die Anwesenheit von CFTR-GFP innerhalb der Mikrosomen wird zu beurteilen sein, wie in Abb. 3B. Die Ergebnisse dieses Experiments sind wichtig, nicht nur die Effizienz der Induktion der Expression bewerten, sondern auch um sicherzustellen, dass die Mikrosomen wurden sorgfältig und hergestellt, dass die Proteolyse minimiert wurde. Die Ergebnisse sind in gezeigt. 3B implizieren, dass in diesem Experiment das CFTR-GFP-Expression etwas niedriger (wie beurteilt bezogen auf die intrinsische 70kDa Bande) als in der kleinen Experiment in Panel A dargestellt jedoch dieser Eindruck durch die Überbelichtung des Fluoreszenz-Detektor in dieser vorgespannt ist Messung. Das lag daran, der Experimentator war checking auf das Vorhandensein von proteolytischen Fragmenten des CFTR-Konstrukt. Es gibt einige Hinweise in diesem Experiment für einige fluoreszierende proteolytische Fragmente zwischen den 130 kDa und 100 kDa Markern, aber diese sind sehr schwach im Vergleich zu dem in voller Länge CFTR-GFP-Band. Mit der Protease-Inhibitoren hier beschrieben, finden wir wenig Beweise für den proteolytischen Abbau von CFTR nach dem Aufbrechen der Zellen. Wenn bedeutende Proteolyse beobachtet wird, empfehlen wir, dass frisches Protease-Inhibitor-Stammlösungen. Wir haben auch gefunden, dass kommerzielle Protease Inhibitor Cocktail-Tabletten weniger wirksam sind für dieses System. Das Wachstum von Zellen über 16 Stunden (nach Induktion), zur Auferstehung des CFTR verringerten Ausdruck zu geben, wie in Abbildung 4 dargestellt. Dies ist wahrscheinlich auf den Umsatz des Proteins, vielleicht wegen Hochregulierung des Hefe-Protein-Qualitätskontrolle Maschinen 6-9,13. Es ist daher ratsam, CFTR-Expression kontrollieren nach Induktion mit Galaktose, wenn möglich, als die optimale Zeit zu ernten die Zellen may variieren von einem Labor zum anderen.
Abbildung 1. Das CFTR-Konstrukt-haltigen Hefeplasmid. Die CFTR-GFP-Fusion wird in 8His der 2μ p424GAL1 Expressionsvektor inseriert wird, unter der Kontrolle eines Galactose (GAL1)-Promotor. Der Vektor enthält auch einen Selektionsmarker Uracil (URA) und ein Ampicillin-Resistenzgen (Amp).
Abbildung 2. Ein Flussdiagramm mit einer Zusammenfassung der visualisierten Protokoll.
Abbildung 3. Vertreter SDS-PAGE-Gele von CFTR Expression und Reinigung. Tafel A zeigt fünf zufällig ausgewählten Transformantenkolonien (Spuren 1-5), die für die CFTR Expression gescreent. Tafel B zeigt Mikrosomen, die aus einem 15l ferm isoliert wurdenGeben Kultur. Tafel C zeigt gereinigt murinen CFTR nach der zweistufigen Reinigung mittels Affinitätschromatographie durch Größenausschlusschromatographie gefolgt erhalten. Alle Gele werden unter Beleuchtungsbedingungen Anregung der Fluoreszenz aus der GFP-Domäne (links) und nach Coomassie-Färbung (rechts) gezeigt. Die relativen Positionen der Molekulargewichtsmarker sind auf der linken (kDa) angegeben.
Abbildung 4. Repräsentative Daten für die Expression des CFTR in Hefe. Abbildung A zeigt eine zeitliche Verlauf der CFTR Expression nach Induktion mit Galactose. Zellextrakte wurden durch SDS-PAGE analysiert, und die GFP-Fluoreszenz für die CFTR-GFP-Protein-Bande wurde integriert. Tafel B zeigt typische Ergebnisse für die Fluoreszenzmikroskopie von GFP-exprimierenden Zellen 16 Stunden nach der Induktion. Typischerweise exprimieren nur ein Bruchteil der Zellen CFTR auf hohem Niveau.
Discussion
Dieses Papier stellt ein Verfahren für die Expression von murinem CFTR-Protein in Hefezellen, welche die Forschung an Mukoviszidose sollte zu erleichtern. Ziel ist es, dieses Papier mit der Veröffentlichung des murinen CFTR-DNA-Konstrukt, das erhältlich sein wird durch die Mukoviszidose-Stiftung (Link http://www.cff.org/research/CFFT/ ). Andere Orthologe sollten verfügbar sein später. Die Transformation der Hefezellen mit dem CFTR-enthaltenden Vektor ist einfach, aber es ist wichtig zu screenen Kolonien, die hohe Konzentrationen von CFTR. Variable Expression kann von mehreren Faktoren ergeben, aber die Anzahl der Kopien des Plasmids pro Zelle wahrscheinlich für eine beträchtliche Unterschiede. Kritische hier beschriebenen Schritte sollte es die Produktion von CFTR-exprimierenden Hefezellen und CFTR-haltigen mikrosomalen Membranen. Nachdem die Transformation, Wachstum, Ernte und Lyse von Hefezellen wurden gemeistert, purifTZBEREICH des Proteins möglich sein sollte, und in Abbildung 3 haben wir ein Beispiel für die Reinheit, die erreichbar sein sollten in diesem Fall als nützliche Benchmark gegeben. Es ist nicht unsere Absicht, in dieser Handschrift, um detaillierte Methodik für die Reinigung des Proteins liefern. Es gibt jedoch einige kritische stromabwärtigen Reinigungsschritte, die spezifisch für die S.cerevisae Expressionssystem, wie Zell-Lyse und Aufreinigung Mikrosomen sind, und diese sind im Detail in dieser Handschrift aufgenommen. Es sollte erwähnt werden, jedoch, dass abgesehen von den beiden Methoden, die wir verwendet haben, können alternative Hefezelle Aufschlussverfahren eingesetzt werden, wie die Verwendung eines Französisch Druckzelle werden. Das rekombinante Protein eine TEV-spaltbare C-terminalen GFP-Domäne, die das Protein nach der Induktion verfolgt werden (Abb. 4) ermöglicht. Hefe haben einen intrinsischen 70kDa Protein (wahrscheinlich Succinatdehydrogenase 12), dass fluoresziert unter den gleichen Bedingungen 11, und damit ein sinnvoller inter bieteninterne Kalibrierung Maß für die relative Expression von CFTR in Ganzzellextrakten oder Mikrosomen (Abb. 3). Es ist klar, aus den Daten in 4 gezeigt, dass der Zeitpunkt der Zellernte nach Induktion mit Galactose von entscheidender Bedeutung ist. Ausbeuten von CFTR Tropfen steil nach etwa 16 Stunden der Induktion, so dass es wird praktisch kein nachweisbares CFTR in Hefe-Zellen nach 24 Stunden der Induktion.
Die Ausbeute an gereinigtem Protein ist etwa 1-2mg CFTR-Protein pro 15 Liter-Fermenter Kultur. Die Wiederherstellung kann etwa 70% der gesamten CFTR-GFP-Protein bis zu der Mikrosomen Stadium davon ausgegangen werden, und etwa 25% Gewinnung von gereinigtem Protein. Charakterisierung des S. cerevisiae-ausgedrückt CFTR ist im Gange. Wie in ersichtlich. 4, kann das Protein die Stelle in der Zelle durch Fluoreszenz-Mikroskopie beobachtet werden. Obwohl ein Großteil der Fluoreszenz in der Umgebung der Peripherie der Zelle als erwarteten 10 gefunden wird, wird etwas von dem Protein ein punktförmiges Körperregion, entweder in odergerade innerhalb der Plasmamembran, die möglicherweise durch das Recycling durch einen späten Golgi / endosomalen Weg 14 oder vielleicht einem Fach hinter der Knospung der Vesikel von der ER 4 CFTR konnte. Die Behandlung mit PNGaseF, ein Enzym, das Proteine deglycosylates, zeigten eine minimale Änderung in der Migration des CFTR-Protein-Bande auf SDS-PAGE, was bedeutet, dass es glykosyliert ist oder eine minimale Glykosylierung 15. Versuche über die Phosphorylierung des Proteins sind im Gange. In einigen der Wasch bisher getesteten, zeigt das gereinigte Protein ATPase-Aktivität (dh durch ein CFTR-spezifischer Inhibitor inhibiert 16) mit Raten, die ähnlich zu den zuvor veröffentlichten 2,15 sind. Messung der CFTR-Kanal Aktivität erforderlich Rekonstitution des gereinigten Proteins, das eine letzten Reinigungsschritt in einem Reinigungsmittel, das eine relativ hohe kritische Mizellenkonzentration (CMC) 17 weist bedeuten würde. Hefe-Mikrosomen containing CFTR kann mit verschiedenen üblicherweise eingesetzten Reinigungsmittel 18, einschließlich Detergenzien wie Dodecylmaltosid 2, die im Allgemeinen gelten als "mild" solublised werden. Doch die meisten hohen CMC Waschmittel haben sich als ineffizient für solubilsation, so weit, was darauf hindeutet, dass der Austausch in dieser Waschmittel in einem späten Stadium in irgendeiner Reinigungsschema sollte erwogen werden.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Wir danken der Cystic Fibrosis Foundation (CFF) zur Finanzierung dieser Arbeit durch seine 3D-Struktur CFTR Consortium (Grant Number FORD08XX0). Wir erkennen den enormen Beitrag von allen Kolleginnen und Kollegen innerhalb des Konsortiums zu dieser Arbeit, insbesondere in der Gestaltung der CFTR-Gene. Wir erkennen auch die wertvollen Beiträge von Drs. James Birtley (NCSR Demokritos, Griechenland), Mark Young (University of Cardiff, UK) und David Drew (Imperial College, London, UK) in den frühen Phasen der Arbeit. Besonders danken wir Dr. Ina Urbatsch (Texas Tech. University, Lubbock) für die kritische Durchsicht des Manuskripts.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FGY217 S.cerevisiae strain, with pep4 deletion 10 | |||
| Yeast nitrogen base without amino acids | Formedium | CYN0410 | |
| Complete supplement mixture without uracil | Formedium | DCS0169 | |
| Bacteriological agar | Sigma-Aldrich | A5306 | |
| D-galactose | Fisher | BP656-500 | |
| D-glucose | Fisher | D16-500 | |
| Pepstatin A | Sigma-Aldrich | P4265 | |
| Leupeptin | Merck | 108975 | |
| Chymostatin | Sigma-Aldrich | C7268 | |
| Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| Epoxysuccinyl-leucylamido-butane (E-64) | Sigma-Aldrich | E3132 | |
| Amin–thylbenzenesulfonyl fluoride (AEBSF) | Sigma-Aldrich | A8456 | |
| Benzamidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 434760 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher | BP120500 | |
| Tris-base | Formedium | TRIS01 | |
| Tris-HCl | Fisher | P631 | |
| D-sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 | |
| Glycerol | Fisher | 065017 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 | |
| n-dodecyl-β-D-maltopyranoside | Affymetrix | D310S | |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | 114391 | |
| PageRuler Plus prestained protein standards | Fermentas | SM1811 | |
| NuSep tris-gly 4-20% gradient gels | NuSep | NB10-420 | |
| Instant Blue Coomassie Stain | Novexin | ISB1L | |
| Glass beads, acid washed | Sigma | G8772 | |
| 50ml Sterile Falcon Tubes | Sarstedt | 62.547.254 | |
| 2ml Sterile screw-top vials | Sarstedt | 72.694.005 | |
| 250ml Sterile Erlenmeyer baffled flasks | BD Biosciences | 355119 | |
| 2l Sterile Erlenmeyer baffled flasks | BD Biosciences | 355131 | |
| 2ml microfuge tubes | Sarstedt | 72.695 | |
| 0.2μM syringe filter | Sartorius | FC121 | |
| ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 355618 | |
| centrifuge tubes | Beckman Coulter | 357000 | |
| 1l centrifuge pots | Beckman Coulter | 969329 | |
| Orbital shaking incubator with temperature control | New Brunswick Scientific | ||
| Deltavision RT restoration microscope | Applied Vision | ||
| Benchtop centrifuge | HERMLE | Z300 | |
| Benchtop microfuge | Fisher | 13-100-511 | |
| Vortex mixer | Star Labs | ||
| Typhoon Trio Scanner | GE Healthcare | 63-0055-87 | |
| LAS3000 imaging system | Fuji | ||
| 20l fermenter vessel and control unit | Applikon | ||
| Constant systems cell disrupter | Constant systems | ||
| Beadbeater cell disrupter | BioSpec | 1107900 | |
| Mini-beadbeater-16 | BioSpec | 607 | |
| JA-17 rotor | Beckman Coulter | 369691 | |
| Optima L-100 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 392050 | |
| 50.2Ti rotor | Beckman Coulter | 337901 |
References
- Ford, R. C., Birtley, J., Rosenberg, M. F., Zhang, L. CFTR three-dimensional structure. Methods Mol. Biol. 741, 329-346 (2011).
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