Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Uttrykk og rensing av Cystisk fibrose transmembrane Conduktans Regulator Protein i Saccharomyces cerevisiae

Published: March 10, 2012 doi: 10.3791/3860

Summary

Forsøk på å uttrykke den cystisk fibrose transmembrane konduktans regulator (CFTR) i

Abstract

Cystisk fibrose transmembrane konduktans regulator (CFTR) er en klorid kanal, at når mutert, kan gi opphav til cystisk fibrose i humans.There er derfor stor interesse i dette proteinet, men arbeidet med å studere sin struktur og aktivitet har vært hemmet av problemer uttrykke og rensende tilstrekkelige mengder protein 1-3. Som mange "vanskelige" eukaryote membran proteiner, er uttrykk i en raskt voksende organisme ønskelig, men utfordrende, og i gjær S. cerevisiae, så langt lave mengder ble innhentet og rask nedbrytning av rekombinant protein ble observert 4-9. Proteiner er involvert i behandlingen av rekombinant CFTR i gjær har blitt beskrevet 6-9. I denne rapporten beskriver vi en metode for uttrykk av CFTR i gjær og rensing i betydelige mengder. Protokollen beskriver hvordan de tidligere proteolyse problemene kan overvinnes og hvordan uttrykket nivåer avCFTR kan bli mye bedre ved å endre cellen vekstbetingelser og ved å kontrollere induksjon forholdene, særlig perioden før celle høsting. De reagants tilknyttet denne protokollen (murine CFTR-uttrykke gjærceller eller gjær plasmider) vil bli distribuert via den amerikanske Cystisk fibrose Foundation, som har sponset forskningen. En artikkel som beskriver design og syntese av CFTR konstruere ansatt i denne rapporten vil bli publisert separat (Urbatsch, I.,. Thibodeau, P. et al, upublisert). I denne artikkelen vil vi forklare vår metode begynner med transformasjon av gjærceller med CFTR konstruere - inneholder gjær plasmid (Fig. 1). Konstruktet har grønt fluoriserende protein (GFP) sekvens smeltet CFTR på sitt C-terminus og følger systemet utviklet av Drew et al. (2008) 10. GFP gir uttrykk og rensing av CFTR skal følges relativt enkelt. Den Jove visualisert protocol ferdig etter utarbeidelsen av mikrosomer fra gjærceller, selv om vi inkluderer noen forslag til rensing av protein fra mikrosomer. Leserne kan ønske å legge til sine egne modifikasjoner på microsome rensing prosedyren, avhengig av endelige eksperimenter som skal utføres med protein og den lokale utstyret tilgjengelig for dem. Den gjær-uttrykte CFTR proteinet kan delvis renset ved hjelp av metall ion affinitet kromatografi, ved hjelp av en iboende polyhistidine rensing tag. Etterfølgende størrelse utestenging kromatografi gir et protein som synes å være> 90% ren, som bedømt av SDS-PAGE og Coomassie-farging av gel.

Protocol

1. Utarbeidelse av Media og buffere

  1. YNB: For en liter, suspendere 6,9 ​​g gjær nitrogen base uten aminosyrer og 0,77 g komplett supplement blanding uten uracil i 1 l vann. Autoklaver. Oppbevares ved 4 ° C.
  2. YNBA: For 400 ml, suspendere 2,76 g gjær nitrogen base uten aminosyrer, 0,38 g komplett supplement blanding uten uracil og 8g bakteriologisk agar i 350 ml vann. Autoklaver. Bland 8 g glukose med 50 ml vann og varme forsiktig til det er oppløst. Steriliser gjennom et 0,2 mikrometer filter og legge til YNBA mens agar er smeltet. Oppbevares ved romtemperatur.
  3. 20% glukose medium: For 500 ml, bland 100 g glukose med 500 ml YNB og varme forsiktig til det er oppløst. Passere gjennom en 0,2 mM filter inn i et sterilt Duran flaske. Oppbevares ved romtemperatur.
  4. 20% galaktose medium: For 2 liter, bland 400 g galaktose med 2l YNB og varme forsiktig til det er oppløst. Passere gjennom en 0,2 mikrometer filter inn i et sterilt Duran flaske. Oppbevares ved romtemperatur temperamentperatur.
  5. Proteasehemmer Aksjer: CFTR er svært utsatt for proteolyse 4. Forfatterne fant følgende hemmere for å være effektive i å begrense proteolyse, men leserne kan ønske å skreddersy denne listen for å oppfylle sine egne krav. Oppbevares i 100 mL alikvoter ved -20 ° C for å redusere fryse-tine problemer. Alle hemmere bør fortynnes fra lager løsninger til arbeiderklassen konsentrasjon som følger:
Inhibitor Stock Konsentrasjon Stock Forberedelse Arbeide Konsentrasjon
AEBSF 200 mm Løs opp 48mg i 1 ml destillert vann 0,2 mm
Benzamidine 300 mm Løs opp 36mg i 1 ml destillert vann 0,3 mm
Chymostatin 4 mm Løs opp 2,5 mg i 1 ml tørr DMSO 4 mM
E-64 7 mm Løs 2,5 mg i 1 ml destillert vann 7 mM
Leupeptin 20 mm Løs opp 10mg i 1 ml destillert vann 20 mM
Pepstatin A 15 mm Løs opp 10mg i 1 ml tørr DMSO 15 mM
PMSF 1 M Løs opp 174mg i 1ml tørr DMSO 1 mm
  1. DTT (1 M): Oppløs 154 mg ditiotreitol i 1 ml destillert vann. Oppbevar ved -20 ° C. Bruk på 1:1000 fortynning i buffere indikert.
  2. EDTA (0,5 M): Mix 29.22 g ethylenediaminetetraacetic syre med 100 ml vann. Legg 10 N NaOH dropwise til all EDTA har oppløst og pH når åtte. Fyll opp til 200 ml med vann og passerer gjennom et 0,2 mikrometer filteret i en steril Duran flaske. Oppbevares ved romtemperatur.
  3. CRB (300 mM Tris-HCl,7,4 pH, 0,56 M sorbitol, 1 mm EDTA): Løs opp 18,17 g Tris-base i 350 ml vann og justere pH til 7,4 ved tilsetting av HCl. Legg 51,35 g sorbitol og gjøre volum opp til 500 ml med vann. Autoklaver. Tilsett 1 ml EDTA stamløsning og oppbevar ved 4 ° C.
  4. CFTR buffer (50 mM Tris, 8,0 pH, 10% v / v glyserol): Løs opp 6,06 g Tris-base i 500 ml vann. Juster pH til 8 med HCl, tilsett 100 ml glyserol og fyll opp til 1 L med vann. Autoklaven og oppbevar ved 4 ° C.
  5. 2x belastning fargestoff: 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 5% glyserol, 5 mm EDTA (pH 8,0), 0,02% Bromophenol blå, 4% SDS, 0,05 M DTT. Lag 10 ml, alikvoter og oppbevares ved -20 ° C.

2. Screening Transformants

Denne protokollen forutsetter at CFTR-GFP-8His fusion genet har blitt satt inn en gjær Plasmid nedstrøms til en GAL1 galaktose promoter (Fig.1), og at plasmidet har blitt forvandlet til FGY217 celler, en Pep4 sletting mutant av S.cerevisiae 10 et al. (2008) 10.

  1. Pick 5-10 godt separerte kolonier fra en transformasjon plate. Overfør hver koloni til en separat steril 50 ml Falcon rør inneholder 9 ml YNB og 1 ml 20% glukose medium. For dette trinnet, er det viktig å ha en endelig konsentrasjon på 2% glukose (w / v) i kulturen for å opprettholde cellevekst. Vokse over natten i 16 timer ved 250 rpm, 30 ° C i en orbital riste kuvøse.
  2. Gjør glyserol aksjer for hver av de skjermede koloniene. Aseptisk legge 0,8 ml av natten kulturer til 0,2 ml steril glyserol i merket skrue-top ampuller, vortex kort og oppbevar ved -80 ° C.
  3. Fortynn de resterende natten kulturer til en endelig volum på 50 ml i YNB, inkludert 250 mL 20% glukose medium.For dette trinnet, er det viktig å fortynne glukosekonsentrasjonen til ca 0,1% (w / w) i kultur fordi høye glukose kan undertrykke GAL1 promoter 10. Grow kulturer i merket 250 ml Erlenmeyer forbløffet kolber til en OD 600 av 0,7 til 0,8 ved 250 rpm, 30 ° C i en orbital riste kuvøse.
  4. Indusere kulturene ved tilsetting av 5 ml 20% galaktose medium til hver kolbe og vokse på i 16 timer.
  5. Bekreft uttrykk for CFTR bruke fluorescens mikroskopi. Ta 100 mL av kultur og tilsett 100 mL glyserol å begrense celle mobilitet i løsningen. Analyse celler i et Delta Vision RT restaurering mikroskop (eller lignende), ved hjelp av en blå laser under en FITC filter (eksitasjon bølgelengde på 490 nm og utslipp bølgelengde 528-538 nm). Positiv uttrykk for CFTR-GFP fusjon proteiner bør være synlig som en ring av fluorescens i plasma membran av gjærceller. Untransformed gjærceller kan brukes som en kontroll.
  6. Overførkulturer i 50 ml Falcon rør. Høste cellene ved sentrifugering ved 3500 xg, 4 ° C i 10 minutter i en benk topp sentrifuge. Mens sentrifuge kjører, forberede 2 ml microfuge rør med skrue topper som inneholder ca 500 mL syre-vasket glassperler og legg på is. Kast supernatants og resuspender hver pellet i 500-800 mL iskaldt CRB med proteasehemmere. Overfør suspensjoner til microfuge rør som inneholder perler og holde på is.
  7. Lyse cellene ved kraftig risting / virvling hver microfuge rør i 10 perioder på 30 sekunder, hviler på isen i mellom perioder. En beadbeater kan benyttes som et alternativ, for eksempel en BioSpec mini beadbeater operert for 3 min.
  8. Plasser rørene til en stasjonær microfuge og sentrifuger ved 3500 xg, 4 ° C i 5 minutter. Overfør supernatants inneholder råolje membranen befolkningen å rengjøre microfuge rør og legg på is. Legg til 500 mL fersk is-cold CRB med proteasehemmere til hvert rør og gjenta prosessen for å samle membraner.
  9. Samle de grove membranene ved å spinne på maksimal hastighet, 4 ° C i en Borstemmaskin microfuge i 2 timer. Kast supernatanten og resuspender hver pellet i 50 mL iskald CFTR buffer.
  10. I rene microfuge rør, blande 15 mL av hver suspensjon med 15 mL 2x belastning fargestoff ved pipettering opp og ned. Inkuber ved romtemperatur i 10 minutter. Ikke koke prøvene, da dette vil føre CFTR og andre membran proteiner for å danne SDS-uoppløselige aggregater og også denature GFP taggen.
  11. Legge prøvene sammen med PageRuler Plus prestained protein standarder (Fermentas) på en 4-20% Tris / glysin gradient gel (NuSep) og kjører på 150 V i 40 minutter eller til dye-fronten er på bunnen av gelen.
  12. Identifiser de høyeste uttrykker cellene ved in-gel fluorescens. Stedet til et fluorescens imaging system som en Typhoon skanner. Skann gel usynge den blå laseren på en eksitasjon bølgelengde på 488 nm og en emisjon bølgelengde 526 nm. Den CFTR-GFP fusjon skal være synlig ved ca 220 kDa. Det vil også være et svakt selvlysende bånd synlig på rundt 70 kDa som trolig er en iboende gjær FAD-holdig membran protein (slik som succinate dehydrogenase subenheten A) 11,12.
  13. Flekk gelen med Coomassie, destain og skanne gel for sammenligning til fluorescens skanning ved hjelp av en praktisk bildevisning programvarepakken. Den Coomassie-beiset gel gir en relativ vurdering av CFTR-GFP uttrykk nivåer i ulike klonal linjer etter normalisering for mengden av total protein lastet opp på hvert spor av gel.
  14. Streak ut den høyeste uttrykke cellelinje fra sin glyserol lager (2.2) på en fersk YNBA plate og Inkuber ved 30 ° C i 2-3 dager. Denne platen kan deretter lagres i opptil 2 uker ved 4 ° C.

3. Storskala fermentering Culture

  1. Forbered pre-kulturer for fermentering. Skrap en 1cm 2 område av celler fra YNBA plate (2.13) ved hjelp av en steril løkke og legge til 45 ml YNB og 5 ml 20% glukose medium, slik at OD 600 er ca 0,1. Vokse i 250 ml Erlenmeyer forbløffet kolber ved 250 rpm, 30 ° C i en orbital riste inkubator til OD 600 når en.
  2. Split kulturen mellom to 2 l Erlenmeyer forbløffet kolber som hver inneholder 450 ml YNB og 25 ml 20% glukose medium. Grow disse på ved 250 rpm, 30 ° C i en orbital riste inkubator til OD 600 når 1,2.
  3. Selv om disse pre-kulturene vokser, satt opp fermentering. Lag 11.2l av YNB som beskrevet i 1.1, men oppløse en ekstra 8,28 g YNB og 0,95 g slipp ut supplement for å kompensere for tillegg av glyserol ved induksjon. Aseptisk legge til 11,2 l YNB og 75 ml 20% glukose medium til et sterilt 20L fermentering fartøyet og justere kjører temperaturen til30 ° C.
  4. Aseptisk legge til precultures til fermentering og sette røring hastigheten til ca 800 rpm og holde temperaturen på 30 ° C. Trykkluft skal flyte på ca 15 dm 3 min -1. Når fermentering kulturen når en OD 600 på 1,2, induserer aseptisk ved å tilsette 1,5 l YNB 20% galaktose løsning og 1,2 l glyserol. Reduser temperaturen til 25 ° C og vokse kulturen i 16 timer.
  5. Overfør fermentering innholdet i en nedkjølt 1l sentrifuger potter på isen ved hjelp av en peristaltiske pumpen. Høste cellene ved sentrifugering ved 3500 xg, 4 ° C i 30 minutter i en stor kapasitet rotor (f.eks 6 liter). Resuspender cellene i 150 ml iskald CRB med proteasehemmere. Herfra skal alt arbeid utføres ved 4 ° C.
  6. Lyse cellene ved å passere gjennom en konstant Systems celle Disrupter i 4 omganger på 25, 30, 32 og 35 kPa, samle lysate på isen i hvert enkelt tilfelle. Alternativt kan du bruke en perle beater (Biospec) med et likt volum av syre-vasket 0,5 mm glassperler og agitere for 3 minutter på full effekt. Overfør lysate til 50ml Falcon rør og pellet den celleavfall ved sentrifugering ved 3500 xg, 4 ° C i 15 minutter i en Borstemmaskin sentrifuge.
  7. Overfør supernatanten til kjølt sentrifugerør. Sentrifuger ved 14 000 xg, 4 ° C i 30 minutter i en sentrifuge for å fjerne mitokondriene.
  8. Overfør supernatanten til kjølt Ultrasentrifuger rør. Sentrifuger ved 200 000 xg, 4 ° C i 90 minutter i en Ultrasentrifuger å samle mikrosomer.
  9. Nøye dekanter og kast supernatanten og legge 2ml iskald CFTR buffer med proteasehemmere og 1mm DTT i hvert rør. Forsiktig resuspender pellets ved hjelp av en pensel, topp opp hver tube med CFTR buffer og bland med en vortex blandebatteri.
  10. Sentrifuger fjæringen på 200 000 xg, 4 ° C i 60 minutter i en Ultrasentrifuger, kast supernatanten og resuspender pellets i 2 ml iskald CFTR buffer wed proteasehemmere (Ingen DTT) med en pensel.
  11. Svømmebasseng de resuspendert mikrosomer, justere det endelige volumet til 50 ml med CFTR buffer og bland godt. Reserve en 1 ml delmengde for SDS-PAGE gel analyse, som beskrevet i 02.09-02.11. De mikrosomer kan nå være flash frosset i flytende nitrogen og deretter lagret ved -80 ° C inntil nødvendig.
  12. CFTR kan utvinnes fra mikrosomer hjelp av én av følgende vaskemidler: litium perfluorooctonoate syre (LiPFO), tetradecanoly-Lysø-phosphatidylglycerol (LPG14), n-dodecyl-β-D-maltoside (DDM). Bland mikrosomer med CFTR buffer, proteasehemmere og 5% vaskemiddel (w / w). Hvis DDM brukes, også legge 300 mM NaCl til buffer. Rør ved 4 ° C i 15 minutter på en tube Rotator.
  13. Sentrifuger prøver ved 100 000 xg, 4 ° C i 1 time i en Ultrasentrifuger. Behold supernatanten og ta en liten delmengde for SDS-PAGE gel analyse. CFTR kan nå bli renset fra solublised materialet ved immobilisert metallaffinitet kromatografi etterfulgt av størrelse utelukkelse kromatografi.

4. Representative Resultater

Transformasjon av gjær med CFTR-inneholder plasmid er ikke 100% effektiv. En representant småskala skjerm av CFTR uttrykk i utvalgte kolonier fra en transformasjon eksperiment vil gi om lag 1 i 4 kolonier uttrykker protein. Et typisk resultat fra en skjerm av 5 kolonier plukket fra en plate er vist i panel A Fig. 3. En av koloniene viser en sterk grad av uttrykk av CFTR-GFP fusjon proteiner som vanligvis går mellom 250 kDa og 130 kDa markører, som vist. De CFTR-GFP fluorescens nivåer vil variere betydelig mellom eksperimenter, med kolonien 4 i fig. 3 som viser minst 10x større fluorescens enn den iboende fluorescerende bandet på om 70kDa. Hvis uttrykket nivåer av CFTR-GFP synes å gi mindre fluorescens enn 70 kDa bandet, så er det antagelig verdt re-transformere og velge en kolonimed høyere nivåer av CFTR-GFP uttrykk. Som vist i fig. 3A, er det lite sannsynlig, selv med et høyt uttrykk nivå av CFTR-GFP at CFTR-GFP band vil være merkbar i cellen ekstrakt av Coomassie farging.

Når utvalgte kolonier har blitt dyrket i større skala eksperimenter, mikrosomer og isolert, tilstedeværelsen av CFTR-GFP innenfor mikrosomer må vurderes, som vist i fig. 3B. Resultatene av dette eksperimentet er viktig, ikke bare å vurdere effektiviteten av induksjon av uttrykket, men også for å kontrollere at mikrosomer er utarbeidet nøye og at proteolyse har blitt minimert. Resultatene er vist i fig. 3B innebærer at i dette forsøket CFTR-GFP uttrykk er noe lavere (som bedømmes i forhold til den indre 70kDa bandet) enn i liten skala eksperiment vist i panel A. Men dette inntrykket er partisk ved overeksponering av fluorescensdetektor i denne måling. Dette var fordi eksperimentator var checking for tilstedeværelsen av proteolytiske fragmenter av CFTR konstruere. Det er noe bevis på dette eksperimentet for noen lysrør proteolytiske fragmenter mellom 130 kDa og 100 kDa markører, men disse er svært svak i forhold til full-lengde CFTR-GFP band. Med de proteasehemmere som er beskrevet her, finner vi lite bevis for proteolytisk nedbrytning av CFTR etter celle brekkasje. Dersom betydelig proteolyse er observert, anbefaler vi å lage frisk proteasehemmer stamløsninger. Vi har også funnet ut at kommersielle proteasehemmer cocktail tabletter er ikke like effektive for dette systemet. Vekst av celler utover 16 timer (etter induksjon) vil gi opphav til redusert CFTR uttrykk som vist i Figur 4. Dette skyldes trolig omsetning av protein, kanskje på grunn av oppregulering av gjær protein kvalitetskontroll maskiner 6-9,13. Det er derfor tilrådelig å overvåke CFTR uttrykk nivåer etter induksjon med galaktoseintoleranse, hvis mulig, som det optimale tidspunktet for å høste cellene may varierer fra laboratorium til et annet.

Figur 1
Figur 1. Den CFTR konstruksjon-holdig gjær plasmid. Den CFTR-GFP-8His fusion er satt inn i 2μ p424GAL1 uttrykk vektor, under kontroll av en galaktose (GAL1) promoter. Vektoren inneholder også en uracil utvalg markør (URA) og en ampicillin resistens genet (AMP).

Figur 2
Figur 2. Et flytdiagram oppsummere visualisert protokollen.

Figur 3
Figur 3. Representative SDS-PAGE geler av CFTR uttrykk og rensing. Panel A viser fem tilfeldig plukket transformant kolonier (kjørefelt 1-5) som ble screenet for CFTR uttrykk. Panel B viser mikrosomer som ble isolert fra en 15L Fermskriv kultur. Panel C viser renset murine CFTR oppnås etter to-trinns rensing ved hjelp av slektskap kromatografi etterfulgt av størrelse utelukkelse kromatografi. Alle gels er vist under belysning forhold spennende fluorescens fra GFP domenet (venstre) og etter Coomassie flekker (til høyre). De relative plasseringen av molekylvekt standarder er listet opp på venstre (KDA).

Figur 4
Figur 4. Representative data for uttrykk av CFTR i gjær. Panel A viser en time-løpet av CFTR uttrykk etter induksjon med galaktose. Cell ekstrakter ble analysert ved SDS-PAGE, og GFP fluorescens for CFTR-GFP protein bandet ble integrert. Panel B viser typiske resultater for fluorescens mikroskopi av GFP-uttrykke celler 16 timer etter induksjon. Vanligvis bare en brøkdel av cellene uttrykker CFTR på høye nivåer.

Discussion

Denne artikkelen gir en metode for uttrykket av murine CFTR proteinet i gjærceller, som skal lette forskning på cystisk fibrose. Målet er å knytte dette papiret med utgivelsen av den murine CFTR DNA konstruksjon, som vil være tilgjengelig via Cystisk fibrose Foundation ( http://www.cff.org/research/CFFT/ ). Andre orthologs bør bli tilgjengelig senere. Transformasjon av gjærceller med CFTR-inneholder vektor er grei, men det er viktig å screene for kolonier uttrykker høye nivåer av CFTR. Variable uttrykk nivåer kan oppstå fra flere faktorer, men antall kopier av plasmidet per celle trolig står for en betydelig grad av variasjon. Kritiske trinn beskrives her bør tillate produksjon av CFTR-uttrykkende gjærceller og CFTR-inneholder mikrosomale membraner. Når transformasjon, vekst, høsting og lysis av gjærceller har blitt mestret, purification av proteinet bør være mulig, og i figur 3 har vi gitt et eksempel på renhet som bør være oppnåelig i dette tilfellet som en nyttig målestokk. Det er ikke vår intensjon i dette manuskriptet for å gi detaljert metode for rensing av protein. Det er imidlertid noen viktige nedstrøms renseanlegg trinn som er spesifikke for S.cerevisae uttrykk system, slik som cellelyse og microsome rensing, og disse er inkludert i detalj i dette manuskriptet. Det bør nevnes imidlertid at bortsett fra de to metodene vi har brukt, kan alternative gjærcelle avbrudd metoder benyttes, for eksempel bruk av en fransk press celle. Den rekombinant protein har en TEV-cleavable C-terminal GFP domene som gjør at proteinet spores etter induksjon (Fig. 4). Gjær har en iboende 70kDa protein (sannsynligvis succinate dehydrogenase 12) som fluoresces under samme vilkår 11, og dette kan gi en nyttig interNAL kalibrering standard for de relative uttrykk nivåer av CFTR i helcelle ekstrakter eller mikrosomer (Fig. 3). Det er klart fra data vist i figur 4 at tidspunktet for cellen høsting etter induksjon med galaktose er avgjørende. Avlingene av CFTR fall bratt etter ca 16 timer av induksjon, slik at det er knapt noen påvisbar CFTR i gjærceller etter 24 timer av induksjon.

Utbyttet av renset protein er om 1-2mg CFTR protein per 15 liter fermentering kultur. Recovery kan beregnes som ca 70% av den totale CFTR-GFP protein opp til microsome scenen, og ca 25% gjenvinning av renset protein. Karakterisering av S. cerevisiae-uttrykte CFTR pågår. Som sett i fig. 4, kan proteinet plassering i cellen bli overvåket av fluorescens mikroskopi. Selv om mye av fluorescens er funnet rundt periferien av cellen som forventet 10, viser noe av det proteinet en punktformet lokalisering, enten i, ellerbare inne i plasmamembranen som kan skyldes CFTR resirkulering gjennom en sen Golgi / endosomal gangsti 14 eller kanskje et rom nedstrøms den spirende av transport vesikler fra ER 4. Behandling med PNGaseF, et enzym som deglycosylates proteiner, viste minimal endring i migrasjon av CFTR proteinet bandet på SDS-PAGE, noe som tyder på at det er unglycosylated, eller har minimal glykosylering 15. Eksperimenter på fosforylering tilstand av proteinet er underveis. I noen av vaskemidler testet så langt, viser renset protein ATPase aktivitet (som er hemmet av en CFTR-spesifikk hemmer 16) på priser som er lik de tidligere publisert 2,15. Måling av CFTR kanal aktivitet vil kreve oppløsning av det renset protein, noe som ville innebære en endelig rensingen i et vaskemiddel som har en relativt høy kritisk miceller konsentrasjon (CMC) 17. Gjær mikrosomer containing CFTR kan solublised med flere vanlige arbeidstakere vaskemidler 18, inkludert rengjøringsmidler som dodecyl 2 maltoside, som er generelt ansett for å være "mild". Men de fleste høye CMC vaskemidler har vist seg å være ineffektiv for solubilsation, så langt, tyder på at utveksling til disse midlene bør vurderes på et sent stadium i noen rensing ordningen.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklært.

Acknowledgments

Vi takker Cystisk fibrose Foundation (CFF) for å finansiere dette arbeidet gjennom sin CFTR 3D Structure Consortium (stipend nummer FORD08XX0). Vi erkjenner den store bidrag fra alle våre kolleger i konsortiet til dette arbeidet, spesielt i utformingen av CFTR gener. Vi erkjenner også de uvurderlige bidrag fra legene. James Birtley (NCSR Demokritos, Hellas), Mark Young (University of Cardiff, Storbritannia) og David Drew (Imperial College, London, Storbritannia) i de tidlige stadier av arbeidet. Vi vil spesielt takke dr. Ina Urbatsch (Texas Tech. University, Lubbock) for kritisk lesing av manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
FGY217 S.cerevisiae strain, with pep4 deletion 10
Yeast nitrogen base without amino acids Formedium CYN0410
Complete supplement mixture without uracil Formedium DCS0169
Bacteriological agar Sigma-Aldrich A5306
D-galactose Fisher BP656-500
D-glucose Fisher D16-500
Pepstatin A Sigma-Aldrich P4265
Leupeptin Merck 108975
Chymostatin Sigma-Aldrich C7268
Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) Sigma-Aldrich P7626
Epoxysuccinyl-leucylamido-butane (E-64) Sigma-Aldrich E3132
Amin–thylbenzenesulfonyl fluoride (AEBSF) Sigma-Aldrich A8456
Benzamidine hydrochloride Sigma-Aldrich 434760
Dimethylsulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418
dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich 43815
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Fisher BP120500
Tris-base Formedium TRIS01
Tris-HCl Fisher P631
D-sorbitol Sigma-Aldrich S1876
Glycerol Fisher 065017
NaCl Sigma-Aldrich S6191
n-dodecyl-β-D-maltopyranoside Affymetrix D310S
Bromophenol blue Sigma-Aldrich 114391
PageRuler Plus prestained protein standards Fermentas SM1811
NuSep tris-gly 4-20% gradient gels NuSep NB10-420
Instant Blue Coomassie Stain Novexin ISB1L
Glass beads, acid washed Sigma G8772
50ml Sterile Falcon Tubes Sarstedt 62.547.254
2ml Sterile screw-top vials Sarstedt 72.694.005
250ml Sterile Erlenmeyer baffled flasks BD Biosciences 355119
2l Sterile Erlenmeyer baffled flasks BD Biosciences 355131
2ml microfuge tubes Sarstedt 72.695
0.2μM syringe filter Sartorius FC121
ultracentrifuge tubes Beckman Coulter 355618
centrifuge tubes Beckman Coulter 357000
1l centrifuge pots Beckman Coulter 969329
Orbital shaking incubator with temperature control New Brunswick Scientific
Deltavision RT restoration microscope Applied Vision
Benchtop centrifuge HERMLE Z300
Benchtop microfuge Fisher 13-100-511
Vortex mixer Star Labs
Typhoon Trio Scanner GE Healthcare 63-0055-87
LAS3000 imaging system Fuji
20l fermenter vessel and control unit Applikon
Constant systems cell disrupter Constant systems
Beadbeater cell disrupter BioSpec 1107900
Mini-beadbeater-16 BioSpec 607
JA-17 rotor Beckman Coulter 369691
Optima L-100 Ultracentrifuge Beckman Coulter 392050
50.2Ti rotor Beckman Coulter 337901

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ford, R. C., Birtley, J., Rosenberg, M. F., Zhang, L. CFTR three-dimensional structure. Methods Mol. Biol. 741, 329-346 (2011).
  2. Rosenberg, M. F., Kamis, A. B., Aleksandrov, L. A., Ford, R. C., Riordan, J. R. Purification and crystallization of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. CFTR). J. Biol. Chem. 279, 39051-39051 (2004).
  3. Zhang, L., Aleksandrov, L. A., Riordan, J. R., Ford, R. C. Domain location within the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein investigated by electron microscopy and gold labelling. Biochim. Biophys. Acta. 1808, 399-404 (2011).
  4. Kiser, G. L. Expression and degradation of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in Saccharomyces cerevisiae. Arch. Biochem. Biophys. 390, 195-205 (2001).
  5. Huang, P., Stroffekova, K., Cuppoletti, J., Mahanty, S. K., Scarborough, G. A. Functional expression of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in yeast. Biochim. Biophys. Acta. 1281, 80-90 (1996).
  6. Ahner, A., Nakatsukasa, K., Zhang, H., Frizzell, R. A., Brodsky, J. L. Small heat-shock proteins select deltaF508-CFTR for endoplasmic reticulum-associated degradation. Mol. Biol. Cell. 18, 806-814 (2007).
  7. Fu, L., Sztul, E. ER-associated complexes (ERACs) containing aggregated cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are degraded by autophagy. Eur. J. Cell. Biol. 88, 215-226 (2009).
  8. Sun, F. Derlin-1 promotes the efficient degradation of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) and CFTR folding mutants. J. Biol. Chem. 281, 36856-36863 (2006).
  9. Zhang, Y., Michaelis, S., Brodsky, J. L. CFTR expression and ER-associated degradation in yeast. Methods Mol. Med. 70, 257-2565 (2002).
  10. Drew, D. GFP-based optimization scheme for the overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae. Nat. Protoc. 3, 784-798 (2008).
  11. Knight, A. W., Billinton, N. Seeing the wood through the trees: A review of techniques for distinguishing green fluorescent protein from endogenous autofluorescence. Anal. Biochem. 291, 175-197 (2001).
  12. Robinson, K. M., Lemire, B. D. Isolation and nucleotide sequence of the Saccharomyces cerevisiae gene for the succinate dehydrogenase flavoprotein subunit. J. Biol. Chem. 267, 10101-10107 (1992).
  13. Gnann, A., Riordan, J. R., Wolf, D. H. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator degradation depends on. the lectins Htm1p/EDEM and the Cdc48 protein complex in. 15, 4125-4135 (2004).
  14. Yoo, J. S. Non-conventional trafficking of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator through the early secretory pathway. J. Biol. Chem. 277, 11401-11409 (2002).
  15. Zhang, L. Architecture of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein and structural changes associated with phosphorylation and nucleotide binding. Journal of Structural Biology. 167, 242-251 (2009).
  16. Wellhauser, L. A small-molecule modulator interacts directly with deltaPhe508-CFTR to modify its ATPase activity and conformational stability. Mol. Pharmacol. 75, 1430-148 (2009).
  17. Ramjeesingh, M. A monomer is the minimum functional unit required for channel and ATPase activity of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Biochemistry. 40, 10700-10706 (2001).
  18. Huang, P., Liu, Q., Scarborough, G. A. Lysophosphatidylglycerol: a novel effective detergent for solubilizing and purifying the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Anal. Biochem. 259, 89-97 (1998).
Uttrykk og rensing av Cystisk fibrose transmembrane Conduktans Regulator Protein i<em> Saccharomyces cerevisiae</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

O'Ryan, L., Rimington, T., Cant, N., Ford, R. C. Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (61), e3860, doi:10.3791/3860 (2012).More

O'Ryan, L., Rimington, T., Cant, N., Ford, R. C. Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (61), e3860, doi:10.3791/3860 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter