Summary
الخلايا العصبية مستقبلات الشم (ORNs) تحويل الإشارات الأولى إلى رائحة مستقبلات الحالية التي بدورها يطلق إمكانات العمل التي يتم نقلها إلى الخلايا العصبية من الدرجة الثانية في البصلة الشمية. نحن هنا وصف الأسلوب ماصة شفط لتسجيل وقت واحد مستقبلات الرائحة التي يسببها الحالية وإمكانات العمل من ORNs الماوس.
Abstract
الحيوانات أخذ عينات من البيئة المحيطة بهم معطر من خلال أنظمة حسي كيميائي يقع في تجويف الأنف. إشارات حسي كيميائي يؤثر على السلوكيات المعقدة مثل اختيار الطعام، المفترس، والاعتراف مناوع زميله وغيرها من الاشارات ذات الصلة اجتماعيا. تقع الخلايا العصبية مستقبلات الشم (ORNs) في الجزء الظهري للتجويف الأنف جزءا لا يتجزأ من ظهارة شمية. هذه الخلايا العصبية ترسل القطبين محور عصبي إلى البصلة الشمية (انظر الشكل 1، وReisert تشاو 1، نشرت في الأصل في مجلة علم وظائف الأعضاء العام) وتوسيع التغصنات واحد من الحدود الظهارية من حيث تشع أهداب في المخاط الذي يغطي حاسة الشم ظهارة. أهداب تحتوي على آلات نقل الإشارة أن يؤدي في النهاية إلى تدفق إثاري الحالي من خلال القنوات الهدبية تنبيغ، ودوري النوكليوتيدات بوابات قناة (CNG) والكالسيوم (أ) 2 + تنشيط الكلور - قناة (الشكل 1). وتلت ذلك depolarization مشغلات الجيل عمل محتمل في جسم الخلية 2-4.
في هذا الفيديو وصفنا استخدام "تقنية شفط ماصة" لتسجيل الرائحة الناجمة عن ردود ORNs. وضعت أصلا هذه الطريقة لتسجيل من المستقبلات الضوئية قضيب 5 و يمكن العثور على البديل من هذا الأسلوب في jove.com تعديل لتسجيل من مبصرات مخروط الماوس 6. وقد تم تكييف هذه التقنية في وقت لاحق لتسجيل ماصة شفط أيضا من ORNs 7،8. لفترة وجيزة، وبعد تفكك الظهارة الشمية والعزلة الخلية، وامتص الجسم الخلية بأكملها من ORN في غيض من ماصة التسجيل. والتغصنات وأهداب وتظل عرضة لحل حمام وبالتالي يمكن الوصول إليها للتغيرات حل لتمكين الرائحة على سبيل المثال أو تطبيق مانع الدوائية. في هذا التكوين، لا المكتسبة الوصول إلى البيئة داخل الخلايا (أي المشبك الجهد خلية كاملة) والجهد داخل الخلايا لا تزال خالية إلى تختلف. كل هذاOWS في وقت واحد تسجيل من مستقبلات الحالي بطيء الذي ينشأ في أهداب وإمكانات العمل بسرعة أطلقها جسم الخلية 9. الفرق بين حركية في هذه إشارات اثنين يسمح لهم باستخدام فصل إعدادات التصفية مختلفة. ويمكن استخدام هذه التقنية على أي نوع البرية أو الماوس أو لتسجيل خروج المغلوب من انتقائي ORNs التي تعبر عن GFP أيضا لتسمية مجموعات فرعية محددة من ORNs، على سبيل المثال التعبير عن مستقبلات الرائحة معين أو قناة أيون.
Protocol
1. التسجيلات الإعداد
هي التي شنت على الدائرة تسجيل المجهر نيكون الكسوف TE2000U مقلوب مع عدسات النقيض المرحلة التي يتم تركيبها على جدول الهواء ومحمية كهربائيا باستخدام قفص فاراداي. الدائرة تسجيل زجاج شبكي يتكون من قسمين يفصل جزئيا بحاجز ولصقها على شريحة زجاجية silanized. يتم استخدام مقطع واحد للغرفة لتسوية الخلايا بينما يستخدم الآخر لتعرض التحفيز أثناء التسجيل المبكر للتقليل من التعرض للتسوية ولكن كما الخلايا غير المستخدمة حتى الآن لالرائحة. الإعداد تسجيل يتكون من ماصة شفط (أنظر أدناه) التي شنت في حامل ماصة مكعبات وقطب الأرض. يتم وضع ماصة الشفط باستخدام مياداة مجهرية. يتم تطبيق حلول التحفيز باستخدام مربع من الزجاج الثلاثي برميل أنبوب، أنبوب مربع مع بعضها كونها 0.7 مم × 0.7 مم. كان على علاقة الزجاج الثلاثي برميل إلى نظام الآلية نضح سريع الخطوة التي شنت على مناور (سوتدخلت SF-77B ثالثا، الآلات وارنر) وغرفة تسجيل بزاوية 45 ° ~. ومشطوف نهاية الزجاج برميل الثلاثي بزاوية 45 درجة مرة أخرى بحيث الوجه النهائي (فتح) من الزجاج الثلاثي برميل كان العمودي للسماح لتحديد المواقع ختام ماصة.
يتم توصيل القطب ماصة شفط مليئة القياسية حل قارع الأجراس في الثدييات والقطب الأرض إلى headstage GΩ 1 من رقعة مكبر للصوت المشبك (PC-501A، وارنر الصكوك) في وضع المشبك الجهد. يتم عرض الإشارات التناظرية من مكبر للصوت (ممر منخفض تمت تصفيتها في 5 كيلو هرتز) على الذبذبات الرقمية لرصد إشارة في الوقت الحقيقي وتوصيلها أيضا إلى عامل تصفية بسل 8-القطب (كروهن، هايت) حيث تكون الإشارة منخفضة تمرير تصفية في 50 هرتز. ويتم تغذية كل من اشارات (ممر منخفض تمت تصفيتها في 5 كيلو هرتز هرتز و50) إلى تحويل A / D (كامبردج الإلكترونية تصميم MKII 1401 مايكرو) التي يتم توصيلها إلى جهاز كمبيوتر للحصول على البيانات. يتم تسجيل البيانات باستخدام البث 3 ACQuisition البرمجيات (كامبردج الإلكترونية التصميم) على تردد أخذ العينات من 10 كيلو هرتز. يتم تسجيل إشارة في عرض الموجات مختلفين لتسجيل أول مستقبلات الحالي جنبا إلى جنب مع إمكانات العمل فرضه ثم مستقبلات الحالية وحدها (انظر الشكل 2). يتم استخدام نظام نضح للتبديل بسرعة بين الحل (التحكم) قارع الأجراس والمحفزات الرائحة أو أي حل للتكوين المطلوب ويتم التحكم بواسطة برنامج 3 PC والإشارات. وترد الحلول في المحاقن 60 مل، ويتم التحكم معدل التدفق من قبل المنظمين الطبية الصف تدفق الوريد. عادة، يتم ضبط معدل تدفق إلى 1 مل / دقيقة.
يتم التحكم في السحب على ماصة تسجيل على النحو التالي: يتم توصيل منفذ جانب حامل ماصة إلى خط النفط الذي بدوره يرتبط إلى خزان النفط ارتفاع قابل للتعديل. رفع أو خفض الخزان يضمن أن الضغط ماصة، وبالتالي تدفق قارع الأجراس من خلال غيض من عipette هو الحد الأدنى وإيجابية قليلا. ويمكن تطبيق شفط إضافية أو الضغط من خلال أنبوب متصل المجال الجوي للخزان مع لسان حال في الطرف الآخر لامتصاص خلايا الجسم من ORN معزولة في غيض من ماصة التسجيل.
يتم تنفيذ التجارب في 37 ° C من أجل محاكاة عن كثب حالة الأم الفسيولوجية للخلية. يتم التحكم في درجة الحرارة عن طريق تمرير الحلول من خلال وحدة التدفئة حسب الطلب الذي يتكون من السيراميك المقاومات التي من خلالها يتم تمرير أنابيب الفولاذ المقاوم للصدأ تحتوي على حلول 10. ويتم رصد درجة الحرارة باستخدام ميزان حرارة الحرارية (فلوك).
2. حلول
قارع الأجراس في الثدييات حل (مم): 140 كلوريد الصوديوم، 5 بوكل، 1 MgCl 2، 2 CaCl 2، 0،01 EDTA، 10 HEPES، 10 الجلوكوز. تم تعديل الرقم الهيدروجيني إلى 7.5 مع هيدروكسيد الصوديوم. تم استخدام 10٪ المخفف رينغر الحل لقياس تقاطع الحالي. Odoraوأعدت الأسيتوفينون والأوجينول يوميا في حل رينغر من 20 ملي الأسهم DMSO: NT الحلول.
3. صنع أقطاب
- تضع الزجاج البورسليكات unfilamented الشعرية في مجتذب P-97 سوتر micropipette وسحب micropipette مع تفتق الطويل.
- نقل ماصة لحامل micropipette حسب الطلب التي شنت على الكسوف نيكون المجهر E200 الذي هو بدوره مزودة شبكاني في العدسة وسكين الماس المنقولة التي شنت على خشبة المسرح.
- مراقبة غيض من ماصة في إطار الهدف 20X واستخدام شبكاني كدليل؛ الكاتب بلطف ماصة بزاوية 90 درجة باستخدام سكين الماس حسب الطلب حيث ماصة هو 10 ميكرومتر واسعة (القطر الخارجي).
- نقل سكين الماس أخرى نحو الحافة وتطبيق الضغط تدريجيا على الطرف السكين مع الماس. يجب غيض ماصة نظيفة كسر عند النقطة التي كان مكتوب عليها.
وبدلا من الخطوات من 3.1 إلىويمكن الجمع بين 3.4 و يمكن سحب ماصات ذات أبعاد المطلوب مباشرة دون الحاجة إلى قطع غيض ماصة، على الرغم من أنها يمكن أن تكون أكثر صعوبة لسحب ماصات موثوق مع مثل هذا القطر تلميح كبير وحواف قطع نظيفة.
- تحت الهدف 40X، النار تلميع غيض من ماصة إلى القطر الداخلي من 5 ميكرون باستخدام خيوط ساخنة كهربائيا. الانتهاء مرة واحدة، micropipette على استعداد لاستخدامها في التيارات التسجيل من ORNs الماوس. ينبغي أن تكون مفتوحة المقاومة ماصة حوالي 1 MΩ عندما مليئة قارع الأجراس.
4. عزل الخلايا مستقبلات الشم
- التضحية ماوس اتباع المبادئ التوجيهية المؤسسية والأنظمة. إزالة الرأس، بعيدا قشر الجلد المغطي الجمجمة والرأس بشكل إعلامي شطر على طول خط الوسط.
- وضع اثنين من رؤساء نصفي تحت stereomicroscope تشريح، وسحب قبالة الحاجز الأنفي وإزالة القرائن حاسة الشم. إخضاع جميع الأنسجة في طبق بتري مع الجلوكوز جontaining الثدييات حل قارع الأجراس.
- قشر ظهارة شمية قبالة الغضروف الأساسية من اثنين القرائن ونقل الأنسجة في أنبوب إيبندورف تحتوي على 250 ميكرولتر قارع الأجراس. نستخدم الأنسجة من 2 القرائن للحصول على كثافة خلايا حق لحجم غرفة تسجيل لدينا. تخزين الأنسجة المتبقية في 4 درجات مئوية لاستخدامها لاحقا.
- دوامة أنبوب إيبندورف يحتوي على ظهارة شمية لفترة وجيزة مرتين ل1 ثانية على سرعة متوسطة. هذه الخطوة تؤدي إلى التفكك الميكانيكية للORNs من ظهارة.
- وضع حل قارع الأجراس التي تحتوي على ORNs فصل في قاعة التسجيل. إزالة قطعة كبيرة من الأنسجة موجودة أيضا في التعليق باستخدام ملقط غرامة.
- السماح للORNs تسوية لمدة 20 دقيقة قبل البدء superfusion المستمر مع قارع الأجراس، والشروع في التسجيلات.
5. التسجيلات
- انخفاض القطب الشفط المتصلة بخط النفط إلى غرفة تسجيل وREGULيأكل من ذروة النفط لإنشاء خزان الضغط الإيجابي قليلا في الطرف ماصة. ويمكن أن يتم هذا من خلال مراقبة مثل الحطام الخلية الابتعاد عن (الضغط الإيجابي) أو نحو (الضغط السلبي) ماصة. ليس محاولة لتلويث غيض من ماصة مع الحطام الخلية.
- مسح غرفة تسجيل لORN المعزولة التي يمكن التعرف عليه بواسطة التشكل في القطبين نموذجية باستخدام التكبير 40X من-20. الانتقال إلى القطب تسجيل مقربة من جسم الخلية ORN. بدء مص بلطف بحيث يدخل في جسم الخلية غيض من ماصة. بعناية وببطء مواصلة تطبيق شفط حتى يتم رسم جسم الخلية بأكملها إلى غيض من ماصة شفط، وترك التغصنات وأهداب تتعرض لحمام الحل. عن صور وأشكال ORNs امتص ماصة انظر 7،11. ضمان أنه بمجرد أن يتم تطبيق أي شفط، وORN لا يتحرك داخل أو خارج ماصة. إذا كان الأمر كذلك، ضبط ارتفاع الخزان النفط وفقا لذلك.
- باستخدامmicromanipulators، نقل ماصة شفط من قسم يحتوي على ORNs استقر إلى قسم التسجيل للغرفة. ضع ماصة بعناية شفط أمام الأنبوب 3-الماسورة لتبادل الحل. يجب وضع ماصة قريبة بما فيه الكفاية لشفط افتتاح أنبوب 3-الماسورة بحيث يتعرض ORN إلى تدفق الصفحي وبالتالي تجنب الاضطرابات خلط وتبادل سريع لتحقيق الحل. ويتحقق الحل عن طريق تبادل يخطو التفاعل بين تيارات موازية من حل تتدفق عبر غيض من ماصة الشفط. أثناء وقت تبادل الحل هو عادة حوالي 20 مللي، وتقاس من تقاطع الحالية التي حركها خطوة الخلية بين الحلول المختلفة لتكوين الأيونية (انظر الشكل 2). يتم تسليم الحلول عن طريق الجاذبية.
6. ممثل النتائج
الشكل 1. A مستقبلات القطبين) الخلايا العصبية في البصلة الشمية. B) إشارة آلات تنبيغ في أهداب يؤدي في النهاية إلى إثاري تدفق الحالية. وإزالة الاستقطاب التي تلت ذلك يؤدي جيل عمل محتمل في خلايا الجسم.
ويبين الشكل 2 السرعة والموثوقية الصرف حل. وصعدت ماصة من العادي إلى قارع الأجراس المخفف 10٪ لمدة 100 مللي ثانية وسجلت الحالية تقاطع الناجمة عن تركيز أيون متباينة. الأسود هو تتبع افيالغضب من 5 تجارب، الأحمر تتبع لها SD. التغيير قليلا في SD خلال تبادل حل يوضح موثوقية الصرف حل من المحاكمة للمحاكمة وعدم وجود ضوضاء الزائدة في مجرى الحل أيضا.
ويبين الشكل 3 استجابة الأوجينول التي يسببها من ORN باستخدام تقنية شفط ماصة. تعرضت لالأوجينول ميكرومتر ORN 100 ل1 ثانية كما هو مبين أعلاه بواسطة شريط التسجيل. في الشكل. 3A (أسود التتبع) وتصفية الحالية مستقبلات في عرض النطاق الترددي 0 حتي 50 هرتز لعرض فقط مستقبلات الحالي الشكل. 3B يظهر تسجيل نفسه وتصفيتها الآن في عرض النطاق الترددي واسعة من 0 حتي 5000 هرتز (الأحمر التتبع) لعرض إمكانات العمل أيضا (الجزائرية، المشار إليها بواسطة الأسهم). وأقحم يظهر التتبع الزمني لنفسه في توسيع نقاط وصول لتصور أكثر وضوحا في بداية الاستجابة.
الشكل 4. الأسرة الاستجابة للجرعة من ORN الأوجينول التي تستجيب لل(A). وكان مدة التحفيز كان يستخدم بتركيزات تتراوح الأوجينول من 0.3 ميكرومتر إلى 100 ميكرومتر، و1 ق تم تصفيتها آثار في 0 - 50 هرتز. أدت الزيادة التدريجية في تركيز الرائحة إلى استجابة أكبر وأسرع، والتي انتهت أيضا أكثر ببطء مرة تم إنهاء التعرض الرائحة.
يمكن ORNs عرض نمط الاستجابة متذبذبة خلال التحفيز طويلة بتركيزات متوسطة الرائحة (الشكل 4B). هنا كان لحفز acetephenone (3 ميكرومتر) ORN تستجيب لمدة 8 ثوان. بعد استجابة سريعة وذروة عابرة في بداية التحفيز ويلاحظ سلسلة من ردود أصغر، المتكررة. وكان عرض النطاق الترددي تسجيل 0 حتي 50 هرتز.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة DC009613، علم الإنسان حدود برنامج والعناية مورلي زمالة (لJR).
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Air table | equipment | Newport Corp. | ||
| Air Pump | equipment | Newport Corp. | ACGP | |
| Pipette Puller | equipment | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Borosilicate glass | equipment | World Precision Instruments, Inc. | 1B150-4 | |
| Nikon Eclipse Inverted microscope | equipment | Nikon Instruments | TE2000U | Equipped with Hg lamp, GFP filter and objectives 20X and 5X at least |
| Amplifier PC-501A | equipment | Warner Instruments | 64-0008 | Headstage 1 GΩ |
| Diamond knife | Equipment | Custom Made | ||
| Digitizer Mikro1401 A/D | equipment | Cambridge Electronic Design | ||
| Filter unit 3382 | equipment | Krohn-Hite Co. | ||
| Signal | software | Cambridge Electronic Design | ||
| Molded Ag/AgCl Pellet | equipment | World Precision Instruments, Inc. | 64-1297 | |
| Pipette holder | equipment | Warner Instruments | 64-0997 | Custom modified to fit headstage |
| Recording chamber | Equipment | Custom Made | ||
| Micromanipulator MP85-1028 | equipment | Sutter Instrument Co. | Micromanipulator MP85-1028 | |
| Mineral oil | Solution | Sigma-Aldrich | 330779-1L | |
| Oscilloscope TDS 1001 | equipment | Tektronix, Inc. | ||
| Three-barreled square glass tube | Equipment | Warner Instruments | 64-0119 | 0.6 mm ID , 5 cm long |
| Valve | equipment | The Lee Company | ||
| Valvelink 8.2 | equipment | AutoMate Scientific, Inc. | ||
| SF-77B Perfusion fast step | equipment | Warner Instruments |
References
- Reisert, J., Zhao, H. Perspectives on: Information and coding in mammalian sensory physiology: Response kinetics of olfactory receptor neurons and the implications in olfactory coding. J. Gen. Physiol. 138, 303-310 (2011).
- Kaupp, U. B. Olfactory signalling in vertebrates and insects: differences and commonalities. Nat. Rev. Neurosci. 11, 188-200 (2010).
- Tirindelli, R., Dibattista, M., Pifferi, S., Menini, A. From pheromones to behavior. Physiol. Rev. 89, 921-956 (2009).
- Kleene, S. J. The electrochemical basis of odor transduction in vertebrate olfactory cilia. Chem. Senses. 33, 839-859 (2008).
- Baylor, D. A., Lamb, T. D., Yau, K. W. Responses of retinal rods to single photons. J. Physiol. 288, 613-634 (1979).
- Wang, J., Kefalov, V. J. Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors. J. Vis. Exp. (35), e1681 (2010).
- Lowe, G., Gold, G. H. The spatial distributions of odorant sensitivity and odorant-induced currents in salamander olfactory receptor cells. J. Physiol. 442, 147-168 (1991).
- Reisert, J., Matthews, H. R. Na+-dependent Ca2+ extrusion governs response recovery in frog olfactory receptor cells. J. Gen. Physiol. 112, 529-535 (1998).
- Reisert, J., Matthews, H. R. Adaptation of the odour-induced response in frog olfactory receptor cells. J. Physiol. 519, 801-813 (1999).
- Matthews, H. R. A compact modular flow heater for the superfusion of mammalian cells. J. Physiol. 518P, 13 (1999).
- Reisert, J., Matthews, H. R. Simultaneous recording of receptor current and intraciliary Ca2+ concentration in salamander olfactory receptor cells. J. Physiol. 535, 637-645 (2001).
