Summary
Обонятельных нейронов рецептора (ORNs) преобразуют сигналы запах сначала в текущем рецепторов, что в свою очередь вызывает потенциалы действия, которые передаются на второй нейронов порядка в обонятельной луковице. Здесь мы опишем метод всасывающего пипетки для записи одновременно одоранта вызванных рецептором тока и потенциалов действия с мышью ORNs.
Abstract
Животные попробовать пахучих окружающей среды вокруг них через хемосенсорной систем, расположенных в носовой полости. Хемосенсорной сигналы влияют на комплекс поведения, такие как выбор продуктов питания, хищник, конспецифичный и признания партнера и других социально значимых сигналов. Обонятельных нейронов рецептора (ORNs) находится в спинной части носовой полости, встроенные в обонятельный эпителий. Эти биполярные нейроны отправить аксона к обонятельной луковице (см. рис. 1, Reisert и Чжао 1, первоначально опубликованной в журнале общей физиологии) и продолжим одного дендрита к эпителиальным границу, откуда реснички излучать в слизи, которая покрывает обонятельный эпителия. Реснички содержать механизм передачи сигнала, что в конечном итоге приводит к возбуждающим текущий приток через цилиарной каналов трансдукции, циклических нуклеотидов закрытого (CNG) канала и Ca 2 +-активированных Cl - каналов (рис. 1). Последовавшая за этим depolarization вызывает потенциал действия поколение в теле клетки 2-4.
В этом видео мы описываем использование "всасывания пипетки техники" для записи одоранта вызванных ответов от ORNs. Этот метод был первоначально разработан для записи с фоторецепторы стержня 5 и вариант этого метода можно найти на jove.com изменение записи с мышью конуса фоторецепторов 6. Техника всасывающие пипетки была позже адаптирована также записывать с ORNs 7,8. Короче говоря, после диссоциации обонятельного эпителия и изолятор, все тело клетки ORN всасывается в кончике пипетки записи. Дендритов и реснички остаются подвержены ванной решения и, следовательно, доступными для решения изменений, позволяющих, например, запахом или фармакологических приложение окон. В этой конфигурации нет доступа к внутриклеточной среде получили (не цельноклеточной напряжения зажим) и внутриклеточное напряжение остается свободным меняться. Это всеРМО одновременной записи медленным течением рецептор, который берет свое начало на реснички и быстро потенциалы действия уволен по телу клетки 9. Различия в кинетике между этими двумя сигналами позволяет им быть разделены с использованием различных настроек фильтра. Эта техника может быть использована на любом дикого типа или нокаут мыши или записать выборочно из ORNs, что также выразить GFP для обозначения конкретных подмножеств ORNs, например, выразив данный рецептор одоранта или ионного канала.
Protocol
1. Настройка записи
Запись камеры установлены на TE2000U Nikon Eclipse, инвертированный микроскоп с фазовым контрастом оптики, который устанавливается на столе и воздух электрически экранированы использовании клетки Фарадея. Камера Оргстекло запись состоит из двух разделов частично разделены барьером и наклеиваются на силанизированного предметное стекло. Один из разделов камеры используются для урегулирования клетки, а другой используется для стимула экспозиции во время записи, чтобы минимизировать воздействие преждевременного оседлого, но пока еще неиспользованных клеток одоранта. Запись установка состоит из всасывающего пипеткой (см. ниже), установленный в гранулированной держатель пипетки и заземляющего электрода. Всасывающий пипетки позиционируется с помощью микроманипулятора. Стимул решения применяются с использованием тройной баррель стекла квадратной трубы, с каждой квадратной трубы бытия 0,7 мм х 0,7 мм. Тройной ствол стекло было связано с моторизованным быстрым шагом перфузионной системы установлены на манипуляторе (Суттер SF-77B, Warner Instruments) и вошел в записи камеры под углом ~ 45 °. В конце тройное стекло ствола скошенные под углом 45 °, снова такая, что окончательное лицо (открытия) тройной ствол стекло было вертикальным, чтобы позволить близким расположением пипетки.
Электрод всасывающие пипетки заполнены стандартными млекопитающих, раствор Рингера и заземляющего электрода подключены к 1 ГОм headstage из усилителя зажим патч (PC-501A, Warner Instruments) в режиме напряжения зажима. Аналоговый сигнал от усилителя (низкочастотный фильтруют при 5 кГц) выводится на цифровой осциллограф для мониторинга сигнала в режиме реального времени, а также подключены к 8-полюсный фильтр Бесселя (Крон-Хайт), где сигнал низких частот отфильтрованный при 50 Гц. Оба сигнала (фильтром нижних частот на 5 кГц и 50 Гц) подается в A / D конвертер (Cambridge Electronic Design Micro 1401 MKII), который подключается к ПК для сбора данных. Данные, записанные с помощью Сигнал 3 ACQuisition программного обеспечения (Cambridge Electronic Design) при частоте дискретизации 10 кГц. Сигнал записывается в двух различных полос пропускания, чтобы сначала записать рецепторов текущем вместе с наложенной потенциалов действия, а затем рецептор текущего самостоятельно (см. рис. 2). Перфузии система используется быстро переключаться между Ringer (контроля) решений и одоранта стимулов или любого решения нужной композиции и контролируется компьютером и программным обеспечением Сигнал 3. Решения, содержащиеся в 60 мл шприцев и расход контролируется медицинскими класса внутривенного регуляторов потока. Как правило, скорость потока устанавливается в 1 мл / мин.
Всасывания на записи пипетки контролируется следующим образом: стороны порта держатель пипетки подключен к нефти линия, которая в свою очередь связана с регулируемыми по высоте нефтяного пласта. Повышение или понижение резервуар гарантирует, что давление пипетки и поэтому Ringer потока через наконечник рipette является минимальным и слегка положительным. Дополнительная всасывания или давления могут быть применены через трубку, соединенную с воздушным пространством резервуара с мундштуком на другом конце сосать тела клетки изолированной ORN на кончике пипетки записи.
Эксперименты проводились при температуре 37 ° C для того, чтобы тесно имитировать родную физиологического состояния клеток. Температура регулируется с помощью прохождения решения через заказные нагревательный элемент, состоящий из керамических резисторов, через который из нержавеющей стали пробирки, содержащие решения прошло 10. Температура контролируется с помощью термометра термопара (Fluke).
2. Решения
Млекопитающие раствор Рингера (мм): 140 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl 2, 2, CaCl 2, 0,01 ЭДТА, 10 HEPES, 10 Глюкоза. РН доводят до 7,5 с помощью NaOH. 10% разбавленного раствора Рингера был использован для измерения переходе тока. OdoraNT решения: Ацетофенон и эвгенол были подготовлены ежедневно в растворе Рингера от 20 мм акции ДМСО.
3. Изготовления электродов
- Поместите unfilamented боросиликатного стеклянный капилляр в Sutter P-97 Съемник микропипетки и вытащить микропипетки с длинным конусом.
- Перенесите пипеткой на заказ микропипетки держатель установлен на Nikon E200 Микроскоп Eclipse, которая в свою очередь оснащена сетки в окуляре и нож подвижный алмазов установлен на сцене.
- Обратите внимание на кончике пипетки в соответствии с 20x цели и используя сетку в качестве ориентира, мягко писец пипетки на угол 90 ° использованием заказных алмазного ножа, где пипетки 10 мкм широкий (наружный диаметр).
- Переместить алмазного ножа дальнейшем к кончику и постепенно оказывать давление на кончике с алмазным ножом. Кончика пипетки должны нарушать чисто в точке, где она была описана.
Кроме шаги 3,1 до3,4 могут быть объединены и пипетки можно вытянуть с заданными размерами напрямую, без того, чтобы вырезать кончиком пипетки, хотя это может оказаться сложнее тянуть надежно пипетки с такой большой диаметр наконечника и аккуратно вырезать края.
- Под 40x цель, стрелять полировать кончиком пипетки к внутренним диаметром 5 мкм с использованием электрического нагрева нити. После завершения микропипетки готова быть использован для записи токов от мыши ORNs. Открытое сопротивление пипетки должна быть около 1 МОм при заполнении Ringer.
4. Выделение обонятельных нейронов рецептора
- Пожертвуйте мыши после институциональных принципов и правил. Удалите головы, удаляйте кожа, покрывающая череп и медиально пополам голову вдоль средней линии.
- Поместите два полу-головы под рассекает стереомикроскопа, снять носовой перегородки и удаление обонятельных раковин. Поместите все ткани в чашке Петри с глюкозой сontaining млекопитающих раствор Рингера.
- Пил обонятельного эпителия с основной хрящ из двух носовых раковин и передать ткани в трубку Eppendorf, содержащие 250 мкл Ringer. Мы используем ткани от 2 раковины, чтобы получить право плотность клеток на размер нашей записи камеры. Храните оставшиеся ткани при 4 ° С для последующего использования.
- Вихревые трубки Эппендорф содержащей обонятельный эпителий дважды кратковременно в течение 1 сек на средней скорости. Этот шаг приводит к механической диссоциации ORNs из эпителия.
- Поместите Ringer раствор, содержащий диссоциированных ORNs в записи камеры. Удалите большие куски ткани, также присутствует в суспензии с использованием тонких щипцов.
- Пусть ORNs урегулировать в течение 20 минут перед началом непрерывной superfusion с Ringer и приступить к записи.
5. Записи
- Опустить всасывающий электрод, соединенный с масляной линии в камере записи и Regulели высотой нефтяной пласт установить небольшое положительное давление на кончике пипетки. Это можно сделать, наблюдая, например, мусор клетки отходит от (положительное давление) или в сторону (отрицательное давление) пипетки. Старайтесь не загрязнять кончика пипетки с клеточной мусора.
- Сканирование записи камеры для изолированного ORN, которая может быть признана типичной морфологией биполярного помощью увеличения 20-40x. Перемещение записи электрода в непосредственной близости от ORN тела клетки. Осторожно начала сосать так, что клетка тела вступает в кончике пипетки. Осторожно и медленно продолжать применять всасывающие, пока все тело клетки втягивается в кончике пипетки всасывающие, оставив дендритов и реснички подвергаются ванну решение. Для изображения сосала ORNs и пипетки форм см. 7,11. Убедитесь, что раз нет всасывающий применяется, ORN не перемещается в или из пипетки. Если это так, отрегулируйте высоту нефтяного пласта соответственно.
- Использованиемикроманипуляторами, перемещать всасывающий пипетки с разделом, содержащим поселился ORNs к записи части камеры. Аккуратно положите всасывающий пипетки перед 3-ствольного трубки для решения обмена. Всасывающий пипетки должны быть размещены достаточно близко к открытию 3-ствольного трубку так, что ORN подвергается ламинарного потока позволяет избежать смешивания турбулентности и добиться быстрого обмена решение. Решение обмена достигается путем активизации взаимодействия между параллельными потоками течет решение по кончиком пипетки всасывающие. Время ходе решения обмена обычно составляет около 20 мс, измеренной от перехода текущего вызывали путем активизации ячейки между решениями различных ионного состава (см. рис. 2). Решения поставляются под действием силы тяжести.
6. Представитель Результаты
Рисунок 1.) Биполярное рецепторов нейронов в обонятельной луковице. B) передачи сигнала техники в ресничками в конечном итоге приводит к возбуждающим текущего притока. Последовавшая за этим деполяризация вызывает потенциал действия поколение в тело клетки.
На рисунке 2 показана скорость и надежность решений обмена. Пипетки вышел из нормального на 10% разбавленного Ringer в течение 100 мс и связующей текущего результате разнородных концентрации ионов был записан. Черный след пр.ярости из 5 испытаний, красный проследить свою SD. Небольшие изменения в SD при решении обмен демонстрирует надежность решение обмен от испытания к испытанию и отсутствием лишнего шума в любом решении поток.
На рисунке 3 показана эвгенол вызванного ответа от ORN с использованием техники всасывающие пипетки. ORN был разоблачен до 100 мкМ эвгенола в течение 1 секунды, как указано выше бара записи. На рис. 3А (черная линия) рецепторов ток фильтруется в полосе 0 - 50 Гц для отображения только рецептор тока Рис.. 3B показывает ту же запись, теперь фильтруются в широкой полосе пропускания 0 - 5000 Гц (красная линия), чтобы также показать потенциалов действия (ПД, указаны стрелками). На вставке показан тот же след на расширил шкалу времени для визуализации точек доступа более четко в начале ответа.
Рисунок 4. Доза-ответ семью эвгенол проблематику ORN (A). Эвгенол был использован при концентрациях в пределах от 0,3 мкм до 100 мкм, стимул длительностью 1 с и следы были отфильтрованы при температуре 0 - 50 Гц. Постепенное увеличение концентрации одоранта привело к большим и более быстрый отклик, который также прекращено еще раз медленно одоранта экспозиции было прекращено.
ORNs может отображать колебательные шаблон ответа в течение длительного раздражения при средней концентрации одоранта (рис. 4В). Здесь acetephenone (3 мкм) реагировать ORN стимулировали в течение 8 секунд. После того, как быстро и переходные максимальной чувствительностью в начале стимуляции ряд более мелких, повторяющихся ответов наблюдается. Запись пропускная способность составляет 0 - 50 Гц.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана NIH DC009613, гуманитарных наук границ программы и Морли Уход стипендий (для JR).
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Air table | equipment | Newport Corp. | ||
| Air Pump | equipment | Newport Corp. | ACGP | |
| Pipette Puller | equipment | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Borosilicate glass | equipment | World Precision Instruments, Inc. | 1B150-4 | |
| Nikon Eclipse Inverted microscope | equipment | Nikon Instruments | TE2000U | Equipped with Hg lamp, GFP filter and objectives 20X and 5X at least |
| Amplifier PC-501A | equipment | Warner Instruments | 64-0008 | Headstage 1 GΩ |
| Diamond knife | Equipment | Custom Made | ||
| Digitizer Mikro1401 A/D | equipment | Cambridge Electronic Design | ||
| Filter unit 3382 | equipment | Krohn-Hite Co. | ||
| Signal | software | Cambridge Electronic Design | ||
| Molded Ag/AgCl Pellet | equipment | World Precision Instruments, Inc. | 64-1297 | |
| Pipette holder | equipment | Warner Instruments | 64-0997 | Custom modified to fit headstage |
| Recording chamber | Equipment | Custom Made | ||
| Micromanipulator MP85-1028 | equipment | Sutter Instrument Co. | Micromanipulator MP85-1028 | |
| Mineral oil | Solution | Sigma-Aldrich | 330779-1L | |
| Oscilloscope TDS 1001 | equipment | Tektronix, Inc. | ||
| Three-barreled square glass tube | Equipment | Warner Instruments | 64-0119 | 0.6 mm ID , 5 cm long |
| Valve | equipment | The Lee Company | ||
| Valvelink 8.2 | equipment | AutoMate Scientific, Inc. | ||
| SF-77B Perfusion fast step | equipment | Warner Instruments |
References
- Reisert, J., Zhao, H. Perspectives on: Information and coding in mammalian sensory physiology: Response kinetics of olfactory receptor neurons and the implications in olfactory coding. J. Gen. Physiol. 138, 303-310 (2011).
- Kaupp, U. B. Olfactory signalling in vertebrates and insects: differences and commonalities. Nat. Rev. Neurosci. 11, 188-200 (2010).
- Tirindelli, R., Dibattista, M., Pifferi, S., Menini, A. From pheromones to behavior. Physiol. Rev. 89, 921-956 (2009).
- Kleene, S. J. The electrochemical basis of odor transduction in vertebrate olfactory cilia. Chem. Senses. 33, 839-859 (2008).
- Baylor, D. A., Lamb, T. D., Yau, K. W. Responses of retinal rods to single photons. J. Physiol. 288, 613-634 (1979).
- Wang, J., Kefalov, V. J. Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors. J. Vis. Exp. (35), e1681 (2010).
- Lowe, G., Gold, G. H. The spatial distributions of odorant sensitivity and odorant-induced currents in salamander olfactory receptor cells. J. Physiol. 442, 147-168 (1991).
- Reisert, J., Matthews, H. R. Na+-dependent Ca2+ extrusion governs response recovery in frog olfactory receptor cells. J. Gen. Physiol. 112, 529-535 (1998).
- Reisert, J., Matthews, H. R. Adaptation of the odour-induced response in frog olfactory receptor cells. J. Physiol. 519, 801-813 (1999).
- Matthews, H. R. A compact modular flow heater for the superfusion of mammalian cells. J. Physiol. 518P, 13 (1999).
- Reisert, J., Matthews, H. R. Simultaneous recording of receptor current and intraciliary Ca2+ concentration in salamander olfactory receptor cells. J. Physiol. 535, 637-645 (2001).
