Summary
Experimentele rat endocarditis model veroorzaakt door meticilline-resistente
Abstract
Endovasculaire infecties, waaronder endocarditis, zijn levensbedreigende besmettelijke syndromen 1-3. Staphylococcus aureus is de meest voorkomende wereldwijde oorzaak van dergelijke syndromen met onaanvaardbaar hoge morbiditeit en mortaliteit zelfs met geschikt antibioticum behandelingen 4-6. De toename van infecties veroorzaakt door meticilline-resistente S. aureus (MRSA), de hoge tarieven van vancomycine klinische behandeling storingen en groeiende problemen van linezolid en daptomycine weerstand hebben alle verdere gecompliceerde de behandeling van patiënten met dergelijke infecties, en leidde tot hoge kosten van de gezondheidszorg 7, 8. Daarnaast moet worden benadrukt dat de meeste recente studies met een behandeling met antibiotica uitkomsten zijn gebaseerd op klinische settings, en dus misschien wel worden beïnvloed door gastheer factoren variërend van patiënt-to-patiënt. Daarom is een relevant diermodel endovasculaire infectie waarbij gastheerfactoren geven gelijke dieren per dier iscruciaal microbiële pathogenese, en de effectiviteit van nieuwe antimicrobiële agentia te onderzoeken. Endocarditis in de rat is een gevestigde experimenteel diermodel dat nauw benadert de menselijke inheemse klep endocarditis. Dit model is gebruikt om de rol van bepaalde staphylococcen virulentiefactoren en de werkzaamheid van antibiotica behandelingen op Staphylococcus endocarditis te onderzoeken. In dit rapport beschrijven we de experimentele endocarditis model als gevolg van MRSA die kunnen worden gebruikt om bacteriële pathogenese en de respons op behandeling met antibiotica te onderzoeken.
Protocol
1. Voorbereiden van de MRSA-stammen voor Infectie
- Inoculeer een entoog met bacterie MRSA cultuur van een voorraad buis bij -80 ° C tot een schaap bloed trypticasesoja-agar (TSA) plaat (zie tabel van specifieke reagentia en apparatuur), en incuberen bij 37 ° C voor de overnachting.
- Controleer de zuiverheid van de cultuur op het bloed agar plaat (vergelijkbaar kolonie fenotypes) om ervoor te zorgen is er geen besmetting.
- Kies een kolonie van de schapen bloed TSA plaat en inoculeren de kolonie in 5 ml trypticasesoja bouillon (TSB) in een 15 ml snap-buisje.
- Incuberen bij 37 ° C geroerd onder schudden bij 200 rpm.
2. Voorbereiding operatie Katheters
Snijd polyethyleen buis (PE10;. Becton Dickinson, bestelnr 427401) tot 10 cm lengte, en smelt het ene uiteinde door te drukken op de punt met een steriele pincet. Het doel van de sluiting een uiteinde van de katheter om bloedingen vermijden tijdens katheterisatie.
3. Pre-surgery Voorbereiding en Anesthesie
- Plaats Sprague-Dawley ratten (Harlan, Indianapolis, Ind vrouw, 250-300 gram) in een kamer met isofluorane-zuurstof-gasmengsel (50%: 50%) tot de verdoving van kracht wordt (bijvoorbeeld de spieren ontspannen zijn en de pedalen zijn afwezig ) en handhaven dieren in een verdoofde staat tijdens de operatie met het gasmengsel.
- Maak de nek van kin tot net onder het borstbeen met Betadine en 70% ethanol.
4. Chirurgische procedure
- Gebruik steriele techniek in de operatie. Maak een insnijding (1-1,5 cm) verticaal door alleen de huid laag van de nek boven het borstbeen.
- Met behulp van stompe dissectie, scheid de fascia aan de rechter halsslagader met behulp van 2 paar gebogen getande tang bloot te leggen.
- Trek de slagader op uit de nek holte, en plaats twee 10 cm lengte van de zijden hechtdraad in de slagader en uit de slagader te binden aan het blootgesteld cephalica einde, plaats een clip op de artery om bloedingen te voorkomen.
- Maak een klein gaatje in de bovenkant van de slagader met behulp van een katheter introducer (Becton Dickinson, bestelnr. 406999), een katheter met een pincet door het gat in de slagader, verwijdert u de clip en duw de katheter naar het hart tot u weerstand wordt voldaan.
- Bind de losse hechting rond het caudale einde van de slagader en zet de katheter op zijn plaats met de zijden hechtdraad wanneer de katheter op zijn plaats wordt bepaald door: i) de lengte van de katheter ingebracht (4-5 cm), ii) de weerstand tegen verdere vooruitgang en iii) het pulseren van de katheter met de hartslag. Laat de katheter voor de rest van het experiment.
- Snijd overtollig hechtingen en katheter eindigt, en zorg ervoor dat er geen bloeding van de katheter. Stop de losse uiteinden onder de huid van de nek en sluit de huid met de huid clips.
- Zet de rat in de kooi op een warme plaats totdat hersteld van de narcose, en zorgen voor voedsel en water. Controleer regelmatig de rat tijdens enna herstel van de anesthesie.
- Deze operatie is een "Categorie E"-procedure. De procedures geproduceerd pijn is niet verlicht door pijnstillers, omdat MRSA-infecties bij leed van de dieren.
5. MRSA-infectie
- Infectie kan worden uitgevoerd tussen 1 en 7 dagen na de operatie, maar houd consistent zijn in experimenten.
- Schoon rattenstaart met 70% ethanol, en injecteer 0,5 ml MRSA op een gewenste cellen (10 april-10 juni cfu / dier de S. aureus stammen). Met 27 G 1/2 inch naald intraveneus de staartader Let : MRSA-cultuur behoort tot bioveiligheid niveau 2 (BSL2) en heeft een matige mogelijke gevaar voor het personeel en het milieu.
- Houd de druk op de site tot hemostase optreedt alvorens terug te keren de rat naar de kooi.
6. Offer Ratten en cultuur doelweefsels
- Offer ratten door ip injectie van natrium-pentobarbital (200 mg/ Kg) na 1-6 dagen na infectie.
- Plaats de rat op haar rug en veeg de borst met 70% ethanol.
- Maak een V-vormige incisie in de borst onder het borstbeen, en snijd het kraakbeen van de ribben aan elke kant van het borstbeen naar het hart bloot te leggen.
- Trek het hart zachtjes omhoog en clip door het hart weefsel in de buurt van de aorta en ontleden tot het hart vrij te maken.
- Plaats het hart op een steriele petrischaal met 4x4 inch gaas naar binnen, maken een snede door de linker ventrikel binnenwand en open de linkszijdige kamer.
- Controleer visueel voor de plaatsing van de katheter. Onderzoek en verwijder vegetaties van de klep met een schaar en tang.
- Weeg en homogeniseren van de vegetaties, en maak seriële verdunningen met PBS voor kwantitatieve cultuur.
7. Representatieve resultaten
Direct na het inbrengen van de katheter in de slagader en naar beneden te duwen de katheter ongeveer 4-5 cm in de richting van het hart, zal een weerstand zijn experienced. Indien geen weerstand wordt gedetecteerd, kan de katheter niet goed zijn opgenomen in linkerkant van de hartkamer, die de plaatsing van de katheter beïnvloeden. Een juiste katheter eerder gepubliceerd 9 is getoond in figuur 1.
Een deel van MRSA-infectie monsters moeten kwantitatieve gekweekte de zorg ervoor dat de exacte levensvatbare bacteriële telling voor de infectie en de zuiverheid van de infectie monster. Bovendien moet de organismen zich uit vegetaties dezelfde zijn als die van het entmateriaal.
Tabel 1 geeft een voorbeeld van virulentie van een S. aureus stam in de rat endocarditis model dat werd eerder gepubliceerd 9. Alle dieren uitgedaagd met inocula van 10 5 en 10 6 kve en offerde tussen de 3 tot 6 dagen na infecties ontwikkeld endocardits met hoge S. aureus dichtheden in cardiale vegetaties en nieren en milt ( een SD, standaarddeviatie. p <0,001 met betrekking tot 10 5 of 10 6 CFU-uitgedaagd dieren. Tabel 1. S. aureus dichtheid in het hart vegetaties met verschillende inocula in de rat endocarditis model 9. 
Figuur 1. Catheter is een juiste plaats (linkerkant van hartkamer) en talrijke vegetaties zichtbaar in de aortaklep 9. Inoculum (aantal Animas) De gemiddelde log 10 CFU / g weefsel ± SD een in: Vegetatie Nier Milt 10 6 CFU / dier (9) 10,36 ± 0,85 7,30 ± 0,64 6,70 ± 0,57 10 5 CFU / dier (8) 9,93 ± 0,53 7,14 ± 0,53 6,44 ± 0,63 10 4 CFU / dier (7) 3,46 ± 0,50 * 1,81 ± 0,74 * 1,58 ± 0,59 *
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De rat endocarditis een belangrijke en gekarakteriseerd diermodel voor in vivo studies bij de Pathogenese en antimicrobiële middelen bij de behandeling van bacteriële infecties 9-11. Daarnaast, rat endocarditis model is een samenstelling van acute en sub-acute infecties, en nauw bootst de menselijke tegenhanger en menselijke inheemse klep endocarditis. Bovendien, vergezeld van een in de woning katheter, het vertegenwoordigt een klassiek biofilm-geassocieerde infectie, een veel voorkomende en lastige kwestie in klinische settings 12. Het belangrijkste is dat de resultaten gegenereerd met de rat endocarditis model zijn zeer reproduceerbaar.
De pathogeniciteit van S. aureus in de rat endocarditis model andere diermodellen is afhankelijk van een aantal parameters, waaronder inoculum dosis bacteriegroei fase (log tegen stationaire), leeftijd van, en dierlijke genetische achtergrond 9, 13. Chirurgische slagingspercentages zijn highly afhankelijk van de technische expertise en chirurgische vaardigheden van de onderzoeker. Succes de operatie kan worden gemeten door: 1) het aantal dieren dat herstellen van de operatie, 2) katheter in een juiste plaats op het moment van opoffering en 3) vegetaties aanwezig hartkleppen.
Kortom, de rat endocarditis is een uitvoerbaar, reproduceerbaar en belangrijk model dat de klinische situatie nabootst op de voet. Daarom is het geschikt voor alle gebieden van sepsis onderzoek, met inbegrip van microbiële pathogenese en de werkzaamheid van antimicrobiële middelen bij de behandeling van experimentele endocarditis syndromen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de US National Institutes of Health [subsidie R01AI-39108 aan ASB] en de American Heart Association [subsidies SDG 0630219N en AID 09GRNT2180065 te YQX].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blood agar plate, 5% sheep blood in Trypticase Soy agar(TSA) | Hardy Diagnostics | A10BX | |
| Trypticase Soy broth (TSB) | BD Biosciences | 211825 | |
| Shaking incubator | Labnet International | I5311-DS | |
| Polyethylene tubing | BD Biosciences | 427401 | |
| Catheter introducer | BD Biosciences | 6999 | |
| Isofluorance | Western Medical Suppy, Inc | 2147 | Follow safety and handling information |
| Surgical Instruments | Fine Science Tools and Biomedical Research Instruments, Inc. | Find the instruments from the two companies for your needs |
References
- Petti, C. A., Fowler, V. G. Staphylococcus aureus bacteremia and endocarditis. Cardiol. Clin. 21, 219-233 (2003).
- Bashore, T. M., Cabell, C., Fowler, V. Update on infective endocarditis. Curr. Probl. Cardiol. 31, 274-352 (2006).
- Fowler, V. G. Jr, Justice, A., Moore, C. Risk factors for hematogenous complications of intravascular catheter-associated Staphylococcus aureus bacteremia. Clin. Infect. Dis. 17, 313-320 (1993).
- Wisplinghoff, H., Bischoff, T., Tallent, S. M., Seifert, H., Wenzel, R. P., Edmond, M. B. Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study. Clin. Infect. Dis. 39, 309-317 (2004).
- Hoen, B. Special issues in the management of infective endocarditis caused by gram-positive cocci. Infect Dis. Clin. North Am. 16, 437-452 (2002).
- Moise, P. A., Hershberger, E., Amodio-Groton, M. I., Lamp, K. C. Safety and clinical outcomes when utilizing high-dose (> or =8 mg/kg) daptomycin therapy. Ann. Pharmacother. 43, 1211-1219 (2009).
- Sakoulas, G., Brown, J., Lamp, K. C., Friedrich, L. V., Lindfield, K. C. Clinical outcomes of patients receiving daptomycin for the treatment of Staphylococcus aureus infections and assessment of clinical factors for daptomycin failure: a retrospective cohort study utilizing the Cubicin Outcomes Registry and Experience. Clin. Ther. 31, 1936-1945 (2009).
- Xiong, Y. Q., Willard, J., Kadurugamuwa, J. L., Yu, J., Francis, K. P., Bayer, A. S. Real-time in vivo bioluminescent imaging for evaluating the efficacy of antibiotics in a rat Staphylococcus aureus endocarditis model. Antimicrob. Agents Chemother. 49, 380-387 (2005).
- Peerschke, E. I., Bayer, A. S., Ghebrehiwet, B., Xiong, Y. Q. gC1qR/p33 blockade reduces Staphylococcus aureus colonization of target tissues in an animal model of infective endocarditis. Infect. Immun. 74, 4418-4423 (2006).
- Ganesh, V. K., Rivera, J. J., Smeds, E. A structural model of the Staphylococcus aureus ClfA-fibrinogen interaction opens new avenues for the design of anti-staphylococcal therapeutics. PLoS Pathog. 4, e1000226 (2008).
- Boles, B. R., Horswill, A. R. Staphylococcal biofilm disassembly. Trends Microbiol. , (2011).
- Tseng, C. W., Sanchez-Martinez, M., Arruda, A., Liu, G. Y. Subcutaneous Infection of Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus (MRSA). J. Vis. Exp. (48), e2528 (2011).
