Summary
Modèle expérimental chez le rat en raison de l'endocardite résistant à la méthicilline
Abstract
Infections endovasculaires, y compris l'endocardite, la vie en danger syndromes infectieux 1-3. Staphylococcus aureus est la plus fréquente dans le monde entier la cause de ces syndromes avec la morbidité et la mortalité trop élevé, même avec des traitements appropriés d'agents antimicrobiens 4-6. L'augmentation des infections dues à des staphylocoques résistants à S. méthicilline (SARM), les taux élevés d'échecs de traitement clinique et la vancomycine problèmes croissants de linézolide et la résistance daptomycine ont tous encore plus compliquée la gestion des patients atteints de ces infections, et a conduit à des coûts de santé élevés 7, 8. En outre, il convient de souligner que les études les plus récentes avec les résultats du traitement aux antibiotiques ont été fondées dans les milieux cliniques, et donc pourrait bien être influencée par des facteurs d'accueil variant de patient à patient. Par conséquent, un modèle animal pertinent de l'infection endovasculaire dans laquelle les facteurs d'accueil sont similaires à partir de l'animal à l'animal est pluscruciale pour enquêter sur la pathogenèse microbienne, ainsi que l'efficacité de nouveaux agents antimicrobiens. L'endocardite chez le rat est un modèle bien établi animal expérimental qui se rapproche de l'homme une endocardite de la valve native. Ce modèle a été utilisé pour examiner le rôle de certains facteurs de virulence de staphylocoques et de l'efficacité des traitements antibiotiques pour une endocardite staphylococcique. Dans ce rapport, nous décrivons le modèle endocardite expérimentale à SARM qui pourraient être utilisées pour étudier la pathogenèse bactérienne et la réponse au traitement antibiotique.
Protocol
1. Préparation de la souches de SARM de l'infection
- Inoculer une anse de culture de SARM à partir d'un tube de stock à -80 ° C à un sang de mouton Trypticase Soy Agar (TSA) plaque (voir le tableau des réactifs spécifiques et de l'équipement), et incuber à 37 ° C pour la nuit.
- Vérifiez la pureté de la culture sur la gélose au sang (phénotypes colonie similaires) pour s'assurer qu'il n'y a pas de contamination.
- Choisissez une colonie de la plaque de sang de mouton TSA et l'inoculer la colonie dans 5 ml de bouillon de trypticase soja (TSB) dans un composant logiciel enfichable 15 ml tube à bouchon.
- Incuber à 37 ° C pendant la nuit sous agitation à 200 rpm.
2. Préparation cathéters Chirurgie
Couper le tube en polyéthylène (PE10;. Becton Dickinson, l'ordonnance n ° 427401) à 10 cm de longueur, et faire fondre une extrémité en appuyant sur la pointe avec une pince stérile. Le but de sceller une extrémité du cathéter est d'éviter des saignements pendant un cathétérisme.
3. Pré-sPréparation urgery et anesthésie
- Lieu rat Sprague-Dawley (Harlan, Indianapolis, Ind femelle, 250-300 grammes) dans une chambre de mélange gazeux contenant de l'oxygène isofluorane-(50%: 50%) jusqu'à ce que l'anesthésie fasse effet (par exemple les muscles sont détendus et les réflexes sont absents à pédales ), et maintenir les animaux dans un état anesthésié pendant l'opération avec le mélange gazeux.
- Nettoyer la zone du cou, du menton au juste en dessous du sternum avec de la Bétadine et l'éthanol à 70%.
4. Procédure chirurgicale
- Utiliser une technique stérile tout au long de la chirurgie. Faire une incision (1-1.5 cm) verticalement à travers seulement la couche de peau du cou au-dessus du sternum.
- Utilisation de dissection, séparer le fascia pour exposer l'artère carotide droite en utilisant 2 paires de courbes pince à griffes.
- Tirez doucement sur l'artère vers le haut hors de la cavité du cou, et place des deux longueurs de 10 cm de suture de soie sous l'artère et de nouer l'artère à l'extrémité exposée céphalique, placez un clip sur la artery pour prévenir les saignements.
- Faites un petit trou dans le haut de l'artère en utilisant un introducteur de cathéter (Becton Dickinson, réf. 406999), insérer un cathéter muni d'une pince à travers le trou dans l'artère, retirer le clip et poussez vers le bas du cathéter vers le cœur jusqu'à ce qu'une résistance est satisfaite.
- Attacher le fil de suture lâche autour de l'extrémité caudale de l'artère et fixer le cathéter en place avec la suture de soie lorsque le cathéter est en place tel que déterminé par: i) la longueur de cathéter inséré (4-5 cm); ii) la résistance à l'avancement et iii) de pulsation du cathéter avec le rythme cardiaque. Laisser le cathéter en place pour le reste de l'expérience.
- Couper l'excès de suture et se termine par cathéter, et assurez-vous qu'il n'y a pas de saignement du cathéter. Rentrez les bouts sous la peau du cou et de fermer la peau avec des clips de la peau.
- Placez le rat dans la cage dans un endroit chaud jusqu'à ce récupéré de l'anesthésie, et fournir de la nourriture et l'eau. Vérifiez fréquemment le rat pendant etaprès la récupération de l'anesthésie.
- Cette chirurgie est une "catégorie E" procédure. Les procédures élaborées douleur n'est pas soulagée par des analgésiques depuis des infections à SARM accompagnant la détresse des animaux.
5. Infection à SARM
- L'infection peut être effectuée entre 1 et 7 jours post-opératoires, mais gardez cohérente dans les expériences.
- Queue de rat avec de l'éthanol pur à 70%, et d'injecter 0,5 ml SARM à un nombre de cellules désiré (10 avril-10 juin ufc / animal pour la plupart des souches de S. aureus). Avec aiguille 27 G 1/2 pouces par voie intraveineuse dans la veine de la queue Attention : la culture appartient à SARM niveau de biosécurité 2 (BSL2) et a modéré danger potentiel pour le personnel et l'environnement.
- Maintenez la pression sur le site jusqu'à ce que l'hémostase se produit avant de retourner chez le rat à la cage.
6. Rats Sacrifice et les tissus cibles Culture
- Sacrifice des rats par injection intrapéritonéale de pentobarbital de sodium (200 mg/ Kg) après 1 à 6 jours post-infection.
- Placez le rat sur son dos et essuyer la poitrine avec de l'éthanol 70%.
- Faire une incision en forme de V dans la poitrine sous le sternum, et couper le cartilage des côtes de chaque côté du sternum afin d'exposer le cœur.
- Tirez sur le cœur en douceur, et le clip à travers le tissu cardiaque à proximité de l'aorte et de disséquer jusqu'à libérer le cœur.
- Placez le coeur sur une boîte de Petri stérile avec l'intérieur de 4x4 pouces de gaze, faire une coupe à travers la paroi ventriculaire gauche intérieure et ouvrir la chambre du côté gauche.
- Vérifiez visuellement pour la pose du cathéter. Examiner et retirer les végétations de la valve avec des ciseaux et des pinces.
- Peser et homogénéiser les végétations, et de faire des dilutions en série avec du PBS pour une culture quantitative.
7. Les résultats représentatifs
Immédiatement après l'insertion du cathéter dans l'artère et en poussant vers le bas le cathéter cm environ 4-5 vers le cœur, une résistance sera expéced. Si aucune résistance est détectée, le cathéter peut-être pas bien été inséré dans le côté gauche de la chambre cardiaque, ce qui peut affecter la mise en place d'un cathéter. Un cathéter correcte publiés antérieurement 9 est illustré à la figure 1.
Partie d'échantillons d'infection à SARM ont besoin d'être cultivée quantitative l's'assurer que le nombre exact bactérienne viable pour l'infection et la pureté de l'échantillon infection. En outre, les organismes récupérés à partir des végétations doit être la même que celles utilisées dans l'inoculum.
Le tableau 1 présente un exemple de la virulence d'un S. souche de Staphylococcus dans le modèle endocardite rat qui a été publié antérieurement 9. Tous les animaux en cause avec des inoculums de 10 5 et 10 6 ufc et sacrifié entre 3 à 6 jours après les infections endocardits développés à forte S. densités aureus dans les végétations cardiaques, ainsi que les reins et la rate ( une carte SD, écart-type. P <0,001 par rapport à 5 ou 10 10 6 UFC-contesté animaux. Tableau 1. S. la densité aureus dans les végétations cardiaques avec inoculums différente dans le modèle de rat endocardite 9. 
Figure 1. Le cathéter est dans un bon endroit (côté gauche de la chambre de coeur), et des végétations nombreuses sont visibles autour de l'aorte vannes 9. Inoculum (nombre de animas) Moyenne log 10 UFC / g de tissu ± écart-type a dans: Végétation Rein Rate 10 6 UFC / animaux (9) 10,36 ± 0,85 7,30 ± 0,64 6,70 ± 0,57 10 5 UFC / animaux (8) 9,93 ± 0,53 7,14 ± 0,53 6,44 ± 0,63 10 4 UFC / animal (7) 3,46 ± 0,50 * 1,81 ± 0,74 * 1,58 ± 0,59 *
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Discussion
L'endocardite chez le rat est un modèle animal important et bien caractérisé dans les études in vivo dans la pathogenèse et les agents antimicrobiens dans le traitement des infections bactériennes 9-11. En outre, le modèle endocardite chez le rat représente un composite d'infections aiguës et subaiguës, et imite étroitement homologue humain et de la endocardite de la valve native. En outre, accompagné d'un cathéter logement dans, il représente une infection classique biofilm associé, un problème fréquent et difficile dans les milieux cliniques 12. Plus important encore, les résultats générés par le modèle endocardite chez le rat sont hautement reproductibles.
Le pouvoir pathogène de S. aureus dans le modèle une endocardite chez le rat, comme d'autres modèles animaux, peut varier en fonction d'un certain nombre de paramètres, y compris la dose d'inoculum, la phase de croissance bactérienne (log vs stationnaire), l'âge des animaux, des animaux et de fond génétique 9, 13. Taux de réussite chirurgicaux sont haprès tant de paroles s'appuie sur l'expertise et les compétences techniques chirurgicales du chercheur. Le succès de la chirurgie peut être mesurée par: 1) le nombre d'animaux qui récupèrent de la chirurgie; 2) du cathéter dans un bon endroit au moment du sacrifice, et 3) des végétations présentes sur les valves cardiaques.
En résumé, l'endocardite chez le rat est un possible, le modèle reproductible et importante qui imite la situation clinique en étroite collaboration. Par conséquent, il est approprié pour tous les domaines de la recherche, y compris sepsis pathogenèse microbienne et l'efficacité des agents antimicrobiens dans le traitement des syndromes endocardite expérimentale.
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Disclosures
Pas de conflits d'intérêt déclarés.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le US National Institutes of Health [subvention R01AI-39108 à ASB] et l'American Heart Association [subventions SDG 0630219N et de l'AID 09GRNT2180065 à YQX].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blood agar plate, 5% sheep blood in Trypticase Soy agar(TSA) | Hardy Diagnostics | A10BX | |
| Trypticase Soy broth (TSB) | BD Biosciences | 211825 | |
| Shaking incubator | Labnet International | I5311-DS | |
| Polyethylene tubing | BD Biosciences | 427401 | |
| Catheter introducer | BD Biosciences | 6999 | |
| Isofluorance | Western Medical Suppy, Inc | 2147 | Follow safety and handling information |
| Surgical Instruments | Fine Science Tools and Biomedical Research Instruments, Inc. | Find the instruments from the two companies for your needs |
References
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