Summary
עכברוש ניסיוני אנדוקרדיטיס בשל methicillin עמיד מודל
Abstract
זיהומים endovascular, כולל דלקת פנים הלב, המהווים סכנת חיים תסמונות זיהומיות 1-3. סטפילוקוקוס אוראוס היא הנפוצה ביותר ברחבי העולם הגורם תסמונות כאלה עם תחלואה ותמותה גבוהים בלתי מתקבל על הדעת אפילו עם טיפולים מתאימים סוכן מיקרוביאלית 4-6. הגידול זיהומים בשל methicillin עמידים ס aureus (MRSA), על שיעור גבוה של קליניים vancomycin כשלים ובעיות טיפול ההולכים וגדלים של linezolid והתנגדות daptomycin יש הכל מסתבך עוד יותר את הניהול של חולים עם זיהומים כאלה, הביאו עלויות שירותי הבריאות הגבוהות 7, 8. בנוסף, יש להדגיש כי מחקרים עדכניים ביותר עם תוצאות טיפול אנטיביוטי התבססו במסגרות קליניות, ולכן עשוי להיות מושפע מגורמים שונים המארחות מחולה לחולה לבצע. לכן, מודל חיה רלוונטי של זיהום endovascular שבו גורמים המארח דומים מן החי בעלי חיים, אליה היא יותרחשוב לחקור בפתוגנזה של חיידקים, כמו גם את היעילות של סוכני מיקרוביאלית הרומן. אנדוקרדיטיס של עכברוש הוא מודל ומבוססת חיים ניסיוני מקרוב בקירוב שסתום האדם אנדוקרדיטיס הילידים. מודל זה נעשה שימוש כדי לבחון את התפקיד של גורמים מסוימים ארסיות staphylococcal ואת היעילות של משטרי טיפול אנטיביוטי אנדוקרדיטיס staphylococcal. בדו"ח זה, אנו מתארים את מודל ניסיוני אנדוקרדיטיס בשל MRSA שיכול לשמש כדי לחקור בפתוגנזה חיידקים בתגובה לטיפול אנטיביוטי.
Protocol
1. הכנת זני MRSA לזיהום
- לחסן loopful התרבות MRSA מהצינור המניה ב -80 ° C עד דם כבשים Trypticase בצלחת אגר (TSA) סויה (ראו טבלה של חומרים כימיים מסוימים וציוד), ו - דגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך לילה.
- לבדוק את טוהר התרבות על צלחת אגר דם (פנוטיפים המושבה דומים) כדי לוודא שאין זיהום לא.
- בחר אחד מן המושבה צלחת דם כבשים TSA ולחסן את המושבה לתוך 5 מ"ל Trypticase סויה מרק (TSB) בצינור הצמד הכתיר 15 מ"ל.
- דגירה על 37 מעלות צלזיוס במשך הלילה עם רועד בסל"ד 200.
2. הכנת צנתרים כירורגיה
חותכים צינורות פוליאתילן (PE10:. בקטון דיקינסון, כדי לא 427,401) ל -10 ס"מ אורך, וממיסים קצה אחד על ידי לחיצה על עצה עם מלקחיים סטריליות. מטרת איטום קצה אחד של הקטטר היא למנוע דימום במהלך הצנתור.
3. מראש שלurgery הכנה הרדמה
- Sprague-Dawley במקום חולדה (הרלן, אינדיאנפוליס, אינדיאנה נקבה, 250-300 גרם) בתא המכיל isofluorane בחמצן תערובת גז (50%: 50%) עד הרדמה נכנס לתוקף (כגון השרירים רגועים רפלקסים פדלים נעדרים ), ולשמור על בעלי החיים במדינה מורדם במהלך הניתוח בתערובת הדלק.
- נקו את אזור הצוואר מהסנטר ממש מתחת לעצם החזה בבטאדין ואתנול 70%.
4. נוהל כירורגי
- השתמש בטכניקה סטרילי לאורך הניתוח. לעשות חתך (1-1.5 ס"מ) אנכית דרך שכבת העור בלבד של הצוואר מעל עצם החזה.
- באמצעות דיסקציה בוטה, להפריד fascia לחשוף את העורק הראשי הנכון באמצעות 2 זוגות מלקחיים שיניים מעוקלות.
- משוך בעדינות את העורק מתוך חלל הצוואר, ושני מקום 10 ס"מ באורך של משי תפר מתחת העורק ולקשור את העורק בסוף cephalic נחשף, הצב קליפ על Arteר"י כדי למנוע דימום.
- לעשות חור קטן בחלק העליון של העורק באמצעות צנתר ההיכרויות (בקטון דיקינסון, ללא סדר. 406,999), הכנס קטטר עם מלקחיים דרך החור בעורק, להסיר את הסרטון ולדחוף את הצנתר לכיוון הלב עד ההתנגדות מתקיים.
- לקשור את תפר רופף לקראת סוף הזנב של העורק ולהבטיח קטטר במקום עם תפר משי כאשר הקטטר נמצא במקום כפי שנקבע על ידי: א) את אורך קטטר מוכנס (4-5 ס"מ), ב ') התנגדות לקידום נוסף , ו-III) הפעימה של קטטר עם קצב הלב. להשאיר את הקטטר במקום עד סוף הניסוי.
- גזור תפר עודף ומסתיים קטטר, ולוודא כי אין דימום מן קטטר. לתחוב את הקצוות מתחת לעור הצוואר ולסגור את העור עם קטעי עור.
- מניחים את החולדה בכלוב במקום חמים עד התאושש מן ההרדמה, ולספק מזון ומים. בדוק את החולדה לעיתים קרובות במהלךלאחר ההתאוששות מן ההרדמה.
- ניתוח זה הוא "E קטגוריה" ההליך. ההליכים המיוצרים הכאב הוא אינסופי על ידי משככי כאבים מאז דלקות MRSA הנלוות מצוקה לבעלי החיים.
5. זיהום MRSA
- זיהום יכול להתבצע בין 1 ל 7 ימים אחרי ניתוח, אבל לשמור על עקביות בתוך ניסויים.
- עכברוש זנב נקי עם אתנול 70%, ולהזריק 0.5 מ"ל MRSA בספירה התא הרצוי (אפריל 10 - יוני 10 CFU / חיה עבור רוב זני ס aureus). עם מחט 27 G 1/2 אינץ מווריד לווריד הזנב זהירות : תרבות MRSA שייך לרמת בטיחות ביולוגית 2 (BSL2) ויש לו פוטנציאל סיכון בינונית עד כוח אדם ואיכות הסביבה.
- הלחץ החזק במקום עד hemostasis מתרחשת לפני החזרה חולדה לכלוב.
6. הקרבה חולדות היעד ורקמות תרבות
- להקריב את החולדות על ידי הזרקת ה-IP של נתרן pentobarbital מ"ג 200 (/ ק"ג) לאחר 1 עד 6 ימים לאחר הפגיעה.
- מניחים את החולדה על גבה ולנגב את החזה עם 70% אתנול.
- לעשות חתך בצורת V בחזה מתחת עצם החזה, וחותכים בסחוס של הצלעות בכל צד של עצם החזה כדי לחשוף את הלב.
- משוך את הלב בעדינות, קליפ דרך רקמת הלב קרוב אבי העורקים ו לנתח את לשחרר את הלב.
- מניחים את הלב על צלחת פטרי סטרילית עם גזה בתוך 4x4 אינץ', לעשות חתך דרך קיר חדר שמאל הפנימית ולפתוח את החדר השמאלי צדדית.
- בדוק חזותית עבור מיקום קטטר. לבחון ולהסיר vegetations מ שסתום עם מספריים מלקחיים.
- לשקול את homogenize vegetations, ולעשות דילולים סדרתי עם PBS לתרבות כמותית.
7. נציג תוצאות
מיד לאחר החדרת צנתר לתוך העורק ודוחף את הקטטר על 4-5 ס"מ לכיוון הלב, ההתנגדות תהיה experienCED. אם אין התנגדות מורגש, קטטר אולי לא בהצלחה מוכנס לתוך הצד השמאלי של החדר לב, אשר עשויים להשפיע על מיקום של קטטר. מיקום קטטר הנכונה שפורסם קודם לכן 9 מוצג באיור 1.
חלק דגימות MRSA זיהום צריך להיות תרבותי כמותי לוודא את הספירה המדויקת חיידקי מעשית עבור זיהום וטוהר המדגם זיהום. בנוסף, את האורגניזמים שהתגלו vegetations צריך להיות זהה לאלה המשמשים הבידוד.
לוח 1 מציג דוגמה ארסיות של ס ' aureus זן במודל חולדה אנדוקרדיטיס אשר פורסם בעבר 9. כל בעלי החיים תיגר עם inocula של 10 5 ו 10 6 CFU והקריב בין 3 עד 6 ימים לאחר זיהומים endocardits שפותחו עם ס 'גבוהה aureus צפיפות ב vegetations לב, כמו גם כליות וטחול ( סטיית SD, סטנדרטי. P <0.001 ביחס 5 10 או 10 6 CFU-תיגר על בעלי חיים. טבלה 1. ס aureus צפיפות vegetations לב עם inocula שונה במודל חולדה אנדוקרדיטיס 9. 
באיור 1. קטטר נמצא במקום הנכון (בצד שמאל של החדר לב), ו vegetations רבים נראים סביב השסתומים אבי העורקים 9. הבידוד (מספר אנימס) זאת אומרת להיכנס 10 CFU / g של רקמת ± SD ב: צמחיה כליה טחול 10 6 CFU / בעלי חיים (9) 10.36 ± 0.85 7.30 ± 0.64 6.70 ± 0.57 10 5 CFU / בעלי חיים (8) 9.93 ± 0.53 7.14 ± 0.53 6.44 ± 0.63 10 4 CFU / בעלי חיים (7) 3.46 ± 0.50 * 1.81 ± 0.74 * 1.58 ± 0.59 *
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אנדוקרדיטיס עכברוש הוא מודל החיה חשוב היטב מאופיין עבור במחקרים vivo בהיווצרות וסוכני מיקרוביאלית בטיפול בזיהומים חיידקיים 9-11. בנוסף, דלקת פנים הלב המודל חולדה מייצג שילוב של דלקת חריפה ותת חריפה, יחקה המקבילה האנושית מגוף האדם אנדוקרדיטיס הילידים. יתר על כן, מלווה קטטר ישיבה, הוא מייצג זיהום הקשורים biofilm, קלאסי, בעיה נפוצה וקשה במסגרות קליניות 12. והכי חשוב, התוצאות שהופקו עם מודל אנדוקרדיטיס חולדה הם מאוד לשחזור.
פתוגניות של S. aureus במודל אנדוקרדיטיס עכברוש, כמו במודלים של בעלי חיים אחרים, עשוי להשתנות בהתאם למספר פרמטרים, לרבות המינון הבידוד, בשלב התפתחות חיידקים (יומן לעומת נייח), גיל של בעלי חיים, הרקע הגנטי בעלי חיים 9, 13. אחוזי ההצלחה של הניתוח הם חתלוי ighly על מומחיות טכנית מיומנויות ניתוח של החוקר. הצלחה בניתוח ניתן למדוד על ידי: 1) את מספר בעלי החיים להתאושש מהניתוח, 2) קטטר במקום הנכון בזמן של הקרבה, ו 3) vegetations הנוכחי על שסתומי הלב.
לסיכום, אנדוקרדיטיס עכברוש הוא מודל מעשי, לשחזור וחשוב המחקה את המצב הקליני מקרוב. לכן, ראוי בכל תחומי המחקר אלח דם, כולל יעילות בפתוגנזה של חיידקים ושל סוכני מיקרוביאלית בטיפול תסמונות פנים הלב ניסויים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגוד עניינים הצהיר.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי המוסד האמריקני הלאומי לבריאות [מענק R01AI-39108 ל ASB] ו איגוד הלב האמריקני [מענקים SDG 0630219N וסיוע 09GRNT2180065 כדי YQX].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blood agar plate, 5% sheep blood in Trypticase Soy agar(TSA) | Hardy Diagnostics | A10BX | |
| Trypticase Soy broth (TSB) | BD Biosciences | 211825 | |
| Shaking incubator | Labnet International | I5311-DS | |
| Polyethylene tubing | BD Biosciences | 427401 | |
| Catheter introducer | BD Biosciences | 6999 | |
| Isofluorance | Western Medical Suppy, Inc | 2147 | Follow safety and handling information |
| Surgical Instruments | Fine Science Tools and Biomedical Research Instruments, Inc. | Find the instruments from the two companies for your needs |
References
- Petti, C. A., Fowler, V. G. Staphylococcus aureus bacteremia and endocarditis. Cardiol. Clin. 21, 219-233 (2003).
- Bashore, T. M., Cabell, C., Fowler, V. Update on infective endocarditis. Curr. Probl. Cardiol. 31, 274-352 (2006).
- Fowler, V. G. Jr, Justice, A., Moore, C. Risk factors for hematogenous complications of intravascular catheter-associated Staphylococcus aureus bacteremia. Clin. Infect. Dis. 17, 313-320 (1993).
- Wisplinghoff, H., Bischoff, T., Tallent, S. M., Seifert, H., Wenzel, R. P., Edmond, M. B. Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study. Clin. Infect. Dis. 39, 309-317 (2004).
- Hoen, B. Special issues in the management of infective endocarditis caused by gram-positive cocci. Infect Dis. Clin. North Am. 16, 437-452 (2002).
- Moise, P. A., Hershberger, E., Amodio-Groton, M. I., Lamp, K. C. Safety and clinical outcomes when utilizing high-dose (> or =8 mg/kg) daptomycin therapy. Ann. Pharmacother. 43, 1211-1219 (2009).
- Sakoulas, G., Brown, J., Lamp, K. C., Friedrich, L. V., Lindfield, K. C. Clinical outcomes of patients receiving daptomycin for the treatment of Staphylococcus aureus infections and assessment of clinical factors for daptomycin failure: a retrospective cohort study utilizing the Cubicin Outcomes Registry and Experience. Clin. Ther. 31, 1936-1945 (2009).
- Xiong, Y. Q., Willard, J., Kadurugamuwa, J. L., Yu, J., Francis, K. P., Bayer, A. S. Real-time in vivo bioluminescent imaging for evaluating the efficacy of antibiotics in a rat Staphylococcus aureus endocarditis model. Antimicrob. Agents Chemother. 49, 380-387 (2005).
- Peerschke, E. I., Bayer, A. S., Ghebrehiwet, B., Xiong, Y. Q. gC1qR/p33 blockade reduces Staphylococcus aureus colonization of target tissues in an animal model of infective endocarditis. Infect. Immun. 74, 4418-4423 (2006).
- Ganesh, V. K., Rivera, J. J., Smeds, E. A structural model of the Staphylococcus aureus ClfA-fibrinogen interaction opens new avenues for the design of anti-staphylococcal therapeutics. PLoS Pathog. 4, e1000226 (2008).
- Boles, B. R., Horswill, A. R. Staphylococcal biofilm disassembly. Trends Microbiol. , (2011).
- Tseng, C. W., Sanchez-Martinez, M., Arruda, A., Liu, G. Y. Subcutaneous Infection of Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus (MRSA). J. Vis. Exp. (48), e2528 (2011).
