Summary
Экспериментальная модель эндокардит крысы из-за метициллин-резистентные
Abstract
Эндоваскулярная инфекций, в том числе эндокардит, являются опасными для жизни инфекционных синдромах 1-3. Золотистый стафилококк является наиболее распространенным мире причиной такого синдрома с недопустимо высокой заболеваемости и смертности, даже с соответствующими антимикробных агентов лечения 4-6. Рост инфекций, вызванных метициллин-резистентные S. стафилококк (MRSA), высокие темпы ванкомицин клинических неудач лечения и растущих проблем линезолид и даптомицина сопротивление все еще более осложняется при лечении пациентов с такими инфекциями, и привело к высокой стоимости медицинских 7, 8. Кроме того, следует подчеркнуть, что последние исследования с антибиотиками результаты лечения были основаны в клинических условиях, и, следовательно, вполне может оказывать влияние множество факторов варьируется от пациента к пациенту. Таким образом, соответствующие животной модели эндоваскулярной инфекции, в котором множество факторов аналогичные от животного к животному большерешающее значение для расследования микробного патогенеза, а также эффективность новых антимикробных препаратов. Эндокардита у крыс является хорошо установленным экспериментальным модель животного, близкое человека родной эндокардитом клапана. Эта модель была использована для изучения роли частности стафилококковой факторов вирулентности и эффективности антибиотиков для лечения стафилококкового эндокардита. В этом докладе мы описываем экспериментальную модель эндокардита, вызванного MRSA, которые могут быть использованы для исследования бактериальной патогенеза и ответ на лечение антибиотиками.
Protocol
1. Подготовка MRSA штаммов инфекции
- Инокулировать loopful культуры MRSA из запаса труб при температуре -80 ° С до бараньей крови Trypticase соевый агар (TSA) пластины (см. таблицу конкретных реагентов и оборудования), и инкубировать при температуре 37 ° С в течение ночи.
- Проверьте чистоту культуры на тарелку кровяной агар (как фенотип колонии), чтобы убедиться в отсутствии загрязнения.
- Выберите один из колонии овец пластины крови TSA и привить колонии в 5 мл соевого Trypticase бульона (TSB) в 15 мл оснастки вершинами трубы.
- Инкубировать при температуре 37 ° С в течение ночи при встряхивании на 200 оборотов в минуту.
2. Подготовка хирургия Катетеры
Вырезать полиэтиленовых труб (PE10,. Becton Dickinson, порядок не 427 401) до 10 см длиной, и расплавить один конец, нажимая кончиком стерильной щипцами. Цель запечатывания одного конца катетера, чтобы избежать кровотечения во время катетеризации.
3. Предварительно сПодготовка urgery и анестезии
- Место Sprague-Dawley крыс (Харлан, Индианаполис, штат Индиана женщины, 250-300 граммов) в камеру, содержащую isofluorane-кислородной газовой смеси (50%: 50%) до анестезии вступает в силу (например, мышцы находятся в расслабленном состоянии и педали рефлексы отсутствуют ), а также поддерживать животных в состоянии наркоза во время операции на газовой смеси.
- Очистите область шеи от подбородка до чуть ниже грудины с Бетадин и 70% этанола.
4. Хирургические процедуры
- Использование стерильных всей операции. Сделайте разрез (1-1,5 см) по вертикали только через скин-слоя шейки над грудиной.
- Используя тупой диссекции, разделить лицевой панели подвергать правой сонной артерии с помощью 2 пар зубчатых изогнутый пинцет.
- Осторожно потяните вверх из артерии шеи полости, а за два 10 см длины шва шелком по артерии и галстук от артерии подвергаются головной конец, поставить клип на артеры, чтобы предотвратить кровотечение.
- Сделайте небольшое отверстие в верхней части артерии с помощью катетера интродьюсер (Becton Dickinson, порядка нет. 406 999), вставить катетер с пинцетом через отверстие в артерии, снять клип и надавите катетер по направлению к сердцу, пока сопротивление выполняется.
- Галстук свободно шва вокруг хвостовой конец артерии и обеспечить катетер на месте шва шелком, когда катетер находится в месте, определенном: а) длина катетера (4-5 см), II), устойчивость к дальнейшему развитию и III), пульсация катетер с сердцебиением. Оставьте катетер на месте до конца эксперимента.
- Сокращение избыточных шва и катетер концов, и убедитесь, что нет кровотечения из катетера. Заправьте концы под кожу шеи и закрыть с кожей клипов.
- Положите крысу в клетку в теплом месте, пока не оправилась от наркоза, а также обеспечить пищей и водой. Проверьте крысы часто во время ипосле выздоровления от наркоза.
- Эта операция является "Категория Е" процедуры. Процедура производится боль беспросветной анальгетиками, так как инфекции MRSA сопровождающих страдания животных.
5. MRSA инфекция
- Инфекция может быть выполнена от 1 до 7 дней после операции, но поддерживать постоянный в течение эксперимента.
- Чистый хвост крысы с 70% этанола, и ввести 0,5 мл MRSA в нужном клеток (10 4 - 10 6 КОЕ / животное большинства штаммов золотистого стафилококка). С 27 G 1/2 дюйма иглы внутривенно из хвостовой вены Внимание : MRSA культура относится к биобезопасности 2-го уровня (BSL2) и имеет умеренную потенциальную опасность для персонала и окружающей среды.
- Держите давление на сайте, пока гемостаза происходит перед возвращением крысы в клетке.
6. Жертва Крысы и тканей культуры Целевая
- Жертвоприношение крыс ф инъекции натрия фенобарбитала (200 мг/ Кг) после 1 до 6 дней после заражения.
- Положите крысу на спину и протрите грудь на 70% этанола.
- Сделать V-образный разрез на груди под грудиной, а также сокращение хрящи ребер с каждой стороны от грудины раскрыть сердце.
- Потяните вверх сердце мягко, и клип в сердце ткани близко к аорте и анализировать до освобождения сердца.
- Поместите сердце в стерильную чашку Петри с 4x4 дюйм в марлю, сделать разрез через левого желудочка внутренней стене и открыть левосторонний камеры.
- Проверьте визуально для катетера. Проверьте и удалите растительность из клапана с ножницами и щипцами.
- Взвесьте и гомогенизации растительности, и сделать серийных разведений PBS с количественной культуры.
7. Представитель Результаты
Сразу после установки катетера в артерию и нажимает катетер 4-5 см по направлению к сердцу, сопротивление будет experienКНИ. Если нет сопротивления почувствовал, катетер не может успешно вставлена в левой части сердца камеры, которые могут повлиять на размещение катетера. Правильное размещение катетера, опубликованных ранее 9 показано на рисунке 1.
Часть образцов MRSA инфекции должны быть количественные культурный убедитесь, что точное количество жизнеспособных бактерий в заражении и чистоту инфекции образца. Кроме того, организм оправился от растительности должна быть такой же, как те, которые используются в посевной.
В таблице 1 приведен пример вирулентности S. золотистого напряжения в модели крысы эндокардит, который был опубликован ранее 9. Все животные сталкиваются с проблемой посевного материала из 10 5 10 6 КОЕ и принес от 3 до 6 дней после инфекции, разработанных endocardits с высоким С. золотистого плотности в сердечной растительности, а также почек и селезенки ( SD, стандартное отклонение. р <0,001 по отношению к 10 5 или 10 6 КОЕ-вызов животных. Таблица 1. С. золотистого плотности в сердечной растительности с различными посевного материала в модели крысы эндокардит 9. 
Рисунок 1. Катетер находится в правильном месте (левая сторона сердца камеры), а также многочисленные растительности видны всем аортального клапана 9. Посевной (количество Animas) Средний войти 10 КОЕ / г ткани ± стандартное отклонение в: Растительность Почка Селезенка 10 6 КОЕ / животных (9) 10,36 ± 0,85 7,30 ± 0,64 6,70 ± 0,57 10 5 КОЕ / животных (8) 9,93 ± 0,53 7,14 ± 0,53 6,44 ± 0,63 10 4 КОЕ / животных (7) 3,46 ± 0,50 * 1,81 ± 0,74 * 1,58 ± 0,59 *
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Крыса эндокардит является важным и хорошо изученных животных моделей для прижизненного исследования патогенеза и противомикробные препараты для лечения бактериальных инфекций 9-11. Кроме того, модель крысы эндокардит представляет собой композицию острые и подострые инфекции, и точно имитирует человеческий коллега и родной человек эндокардитом клапана. Кроме того, в сопровождении катетер в жилище, оно представляет собой классический биопленки-ассоциированной инфекции, общий и сложный вопрос в медицинских учреждениях 12. Самое главное, результаты, полученные с моделью эндокардит крысы являются высокая воспроизводимость.
Патогенности С. золотистый в модели эндокардит крысы, как и другие модели на животных, могут варьироваться в зависимости от ряда параметров, в том числе посевной дозы бактериальной фазе роста (журнал против стационарных), возраста животных, и животных, генетический фон 9, 13. Хирургическое ставки успеха чighly зависит от технических знаний и хирургических навыков исследователя. Успех в операции может быть измерен: 1) количество животных, что восстановление после операции, 2) катетера в нужное место во время жертвоприношения, и 3) растительность присутствует на клапанах сердца.
Таким образом, крысы эндокардита возможно, воспроизводимые и важные модель, которая имитирует клиническую ситуацию внимательно. Таким образом, он подходит для всех сфер сепсис исследований, в том числе микробного патогенеза и эффективности антимикробных препаратов при лечении экспериментального синдрома эндокардита.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа выполнена при финансовой поддержке американского Национального института здоровья [грант R01AI-39108 для ASB] и Американской ассоциации сердца [гранты SDG 0630219N и AID 09GRNT2180065 в YQX].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blood agar plate, 5% sheep blood in Trypticase Soy agar(TSA) | Hardy Diagnostics | A10BX | |
| Trypticase Soy broth (TSB) | BD Biosciences | 211825 | |
| Shaking incubator | Labnet International | I5311-DS | |
| Polyethylene tubing | BD Biosciences | 427401 | |
| Catheter introducer | BD Biosciences | 6999 | |
| Isofluorance | Western Medical Suppy, Inc | 2147 | Follow safety and handling information |
| Surgical Instruments | Fine Science Tools and Biomedical Research Instruments, Inc. | Find the instruments from the two companies for your needs |
References
- Petti, C. A., Fowler, V. G. Staphylococcus aureus bacteremia and endocarditis. Cardiol. Clin. 21, 219-233 (2003).
- Bashore, T. M., Cabell, C., Fowler, V. Update on infective endocarditis. Curr. Probl. Cardiol. 31, 274-352 (2006).
- Fowler, V. G. Jr, Justice, A., Moore, C. Risk factors for hematogenous complications of intravascular catheter-associated Staphylococcus aureus bacteremia. Clin. Infect. Dis. 17, 313-320 (1993).
- Wisplinghoff, H., Bischoff, T., Tallent, S. M., Seifert, H., Wenzel, R. P., Edmond, M. B. Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study. Clin. Infect. Dis. 39, 309-317 (2004).
- Hoen, B. Special issues in the management of infective endocarditis caused by gram-positive cocci. Infect Dis. Clin. North Am. 16, 437-452 (2002).
- Moise, P. A., Hershberger, E., Amodio-Groton, M. I., Lamp, K. C. Safety and clinical outcomes when utilizing high-dose (> or =8 mg/kg) daptomycin therapy. Ann. Pharmacother. 43, 1211-1219 (2009).
- Sakoulas, G., Brown, J., Lamp, K. C., Friedrich, L. V., Lindfield, K. C. Clinical outcomes of patients receiving daptomycin for the treatment of Staphylococcus aureus infections and assessment of clinical factors for daptomycin failure: a retrospective cohort study utilizing the Cubicin Outcomes Registry and Experience. Clin. Ther. 31, 1936-1945 (2009).
- Xiong, Y. Q., Willard, J., Kadurugamuwa, J. L., Yu, J., Francis, K. P., Bayer, A. S. Real-time in vivo bioluminescent imaging for evaluating the efficacy of antibiotics in a rat Staphylococcus aureus endocarditis model. Antimicrob. Agents Chemother. 49, 380-387 (2005).
- Peerschke, E. I., Bayer, A. S., Ghebrehiwet, B., Xiong, Y. Q. gC1qR/p33 blockade reduces Staphylococcus aureus colonization of target tissues in an animal model of infective endocarditis. Infect. Immun. 74, 4418-4423 (2006).
- Ganesh, V. K., Rivera, J. J., Smeds, E. A structural model of the Staphylococcus aureus ClfA-fibrinogen interaction opens new avenues for the design of anti-staphylococcal therapeutics. PLoS Pathog. 4, e1000226 (2008).
- Boles, B. R., Horswill, A. R. Staphylococcal biofilm disassembly. Trends Microbiol. , (2011).
- Tseng, C. W., Sanchez-Martinez, M., Arruda, A., Liu, G. Y. Subcutaneous Infection of Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus (MRSA). J. Vis. Exp. (48), e2528 (2011).
