Summary
Experimentell rått endokardit modellen på grund av meticillin-resistenta
Abstract
Endovaskulära infektioner, inklusive endokardit, är livshotande infektioner syndrom 1-3. Staphylococcus aureus är den vanligaste världen orsaken till dessa syndrom med oacceptabelt hög sjuklighet och dödlighet även med lämplig antimikrobiell agent behandlingar 4-6. Ökningen i infektioner orsakade av meticillinresistenta S. aureus (MRSA), de höga vankomycin kliniska misslyckade behandlingar och växande problem med linezolid och daptomycin motståndet har alla mer komplicerade behandling av patienter med sådana infektioner, och ledde till höga sjukvårdskostnader 7, 8. Dessutom bör det framhållas att de senaste studierna med antibiotikabehandling resultat har sin bas i kliniska miljöer, och därmed kan mycket väl påverkas av värd faktorer varierar från patient till patient. Därför är en relevant djurmodell för endovaskulära infektion som värd faktorer är likartade från djur till djur meravgörande för att undersöka Microbial Pathogenesis, såväl som effekten av nya antimikrobiella medel. Endokardit i råtta är en väletablerad experimentell djurmodell som nära approximerar mänskliga infödda ventil endokardit. Denna modell har använts för att undersöka betydelsen av särskilda stafylokock virulensfaktorer och effekt av antibiotika behandlingsregimer för stafylokock endokardit. I denna rapport beskriver vi den experimentella endokardit modellen på grund av MRSA som kan användas för att undersöka bakteriell patogenes och svar på antibiotikabehandling.
Protocol
1. Förbereda MRSA-stammar för Infection
- Ympa en full ögla av MRSA kultur från en lager rör vid -80 ° C till en fårblod Trypticase Soy Agar (TSA)-platta (se tabell av specifika reagens och utrustning) och inkubera vid 37 ° C under natten.
- Kontrollera renheten av kulturen på blodagarplatta (liknande koloni fenotyper) se till att det inte finns någon förorening.
- Välja en koloni från fårblod TSA plattan och inokulera kolonin i 5 ml trypticase sojabuljong (TSB) i en 15 ml snäpp-provrör.
- Inkubera vid 37 ° C över natten med skakning vid 200 rpm.
2. Förbereda kirurgi Katetrar
Skära polyetenslang (PE10;. Becton Dickinson, order nr 427.401) till 10 cm längder och smälta en ände genom att trycka spetsen med en steril pincett. I syfte att täta en ände av katetern är att undvika blödning under kateterisering.
3. Pre-Surgery Förberedelser och anestesi
- Placera Sprague-Dawley råtta (Harlan, Indianapolis, Ind kvinna, 250-300 gram) i en kammare som innehåller isofluoran-syre gasblandning (50%: 50%) tills bedövningen träder i kraft (t.ex. muskler är avslappnade och pedal reflexer är frånvarande ), och bibehålla djur i en bedövad tillstånd under kirurgi med gasblandningen.
- Rengör nacken från haka till strax under bröstbenet med Betadine och 70% etanol.
4. Kirurgisk procedur
- Använd steril teknik i hela operationen. Göra ett snitt (1-1,5 cm) vertikalt genom endast ytskiktet av halsen ovan bröstbenet.
- Med hjälp av trubbig dissektion, separera den fascia för att exponera den högra halspulsådern med användning av 2 par krökta tandad tång.
- Dra försiktigt artären upp ur halsen hålrum, och placera två 10 längder cm av silke sutur i artären och fästa artären vid den exponerade cefaliska slutet, placera ett klipp på artery för att förhindra blödning.
- Gör ett litet hål i toppen av artären med hjälp av en kateter införare (Becton Dickinson, best.nr. 406.999), föra in en kateter med en tång genom hålet i artären, ta bort klämman och tryck ner katetern mot hjärtat tills ett motstånd är uppfyllt.
- Knyt den lösa suturen runt kaudala slutet av artär och säkra katetern på plats med silkesutur när katetern är på plats som bestäms av: i) Längden av kateter insatt (4-5 cm), ii) motstånd mot ytterligare framsteg och iii) pulsering av katetern med hjärtslag. Lämnar katetern på plats under återstoden av experimentet.
- Klipp över sutur och slutar kateter, och se till att det inte finns någon blödning från katetern. Stoppa de lösa ändarna under huden på halsen och stäng huden med huden klipp.
- Placera råttan i buren på ett varmt ställe tills återhämtat sig från anestesi och ge mat och vatten. Kontrollera råtta ofta under ochEfter återhämtning från anestesi.
- Denna operation är en "kategori E" förfarande. De förfaranden som produceras smärta är oförlöst med analgetika sedan MRSA-infektioner som åtföljer lidande för djuren.
5. MRSA-infektion
- Infektion kan utföras mellan 1 och 7 dagar efter kirurgi, men håll konsekvent inom experiment.
- Ren råttsvans med 70% etanol och injicera 0,5 ml MRSA vid en önskad celltal (10 april - 10 juni cfu / djur för de flesta S. aureus-stammar). Med 27 G 1/2 tum nål intravenöst från svansvenen Försiktighet : MRSA kulturen hör till skyddsnivå 2 (BSL2) och har måttlig potential fara för personal och miljö.
- Håll trycket på platsen tills hemostas sker innan han återvände råttan till buren.
6. Offer Råttor och kultur målvävnader
- Offra råttor genom ip-injektion av natriumpentobarbital (200 mg/ Kg) efter 1 till 6 dagar efter infektion.
- Placera råttan på rygg och torka bröstet med 70% etanol.
- Gör en V-formad snitt i bröstet nedan bröstbenet och skär brosket av ribbor på varje sida av bröstbenet att exponera hjärtat.
- Dra hjärta upp försiktigt och klipp genom hjärtvävnaden nära aorta och dissekera för fri hjärtat.
- Placera hjärta på en steril petriskål med 4x4 tums gasbinda inne, gör ett snitt genom den vänstra ventrikulära innervägg och öppna vänstersidig kammare.
- Kontrollera visuellt för kateter placering. Undersök och ta bort vegetation från ventilen med sax och pincett.
- Väg och homogenisera vegetation och göra seriella spädningar med PBS för kvantitativ kultur.
7. Representativa resultat
Omedelbart efter insättning av katetern in i artären och trycka ner katetern ca 4-5 cm mot hjärtat, kommer en resistans vara experienced. Om inget motstånd avkänns, kan katetern inte har med framgång införas i vänster sida av hjärtkammaren, som kan påverka placeringen av katetern. En korrekt placering av katetern tidigare publicerade 9 visas i figur 1.
En del av MRSA-infektion prover behöver vara kvantitativa odlas på att se exakt livskraftiga bakterier för infektionen och renhet av infektion prov. Dessutom bör de organismer som återvunnits från vegetationer vara samma som de som används i inokulum.
Tabell 1 visar ett exempel på virulens hos en S. aureus stam i råttan endokardit modell som publicerades tidigare 9. Alla djur utmanades med inokula av 10 5 och 10 6 cfu och avlivades mellan 3 till 6 dagar efter infektion utvecklades endocardits med hög S. aureus densiteter i hj vegetationer samt njurar och mjälte ( en SD, standardavvikelse. P <0,001 med avseende på 10 5 eller 10 6 CFU-utmanade djur. Tabell 1. S. aureus densitet i hjärtat vegetation med olika inokula i rått endokardit modellen 9. 
Figur 1. Katetern är i en korrekt plats (vänster sida av hjärtat kammare), och ett flertal vegetationer är synliga runt aorta ventilerna 9. Inokulat (antal Animas) Medelvärde log 10 CFU / g vävnad ± SD en i: Vegetation Njure Mjälte 10 6 CFU / djur (9) 10,36 ± 0,85 7,30 ± 0,64 6,70 ± 0,57 10 5 CFU / djur (8) 9,93 ± 0,53 7,14 ± 0,53 6,44 ± 0,63 10 4 CFU / djur (7) 3,46 ± 0,50 * 1,81 ± 0,74 * 1,58 ± 0,59 *
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Råttan endokardit är en viktig och väl karakteriserad djurmodell för in vivo-studier i patogenes och antimikrobiella medel vid behandling av bakteriella infektioner 9-11. Dessutom representerar rått endokardit modellen en komposit av akut och subakut infektioner och nära efterliknar mänskliga motsvarighet och mänskliga infödda ventil endokardit. Dessutom åtföljas av en bostad kateter, innebär det en klassisk biofilm-associerad infektion, en vanlig och svår fråga i kliniska situationer 12. Viktigast resultat som erhållits med råttan endokardit modellen är mycket reproducerbara.
Patogeniteten av S. aureus hos råtta endokardit modellen, som andra djurmodeller, kan variera beroende på ett antal parametrar, bland annat inokulum dos bakteriell tillväxtfas (log mot stationär), djurens ålder, och djur genetisk bakgrund 9, 13. Kirurgiska framgångsrika är highly beroende av teknisk expertis och kirurgisk kompetens för forskaren. Framgång i kirurgi kan mätas med: 1) det antal djur som återhämtar sig från operationen, 2) kateter i en rätt ställe vid tiden för avlivning, och 3) vegetation som finns på hjärtklaffar.
Sammanfattningsvis är råttan endokardit ett praktiskt, reproducerbar och viktig modell som efterliknar den kliniska situationen noga. Därför är det lämpligt att alla områden sepsis forskning, inklusive mikrobiell patogenes och effekt av antimikrobiella medel vid behandling av experimentella endokardit syndrom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av amerikanska National Institutes of Health [bidraget R01AI-39.108 till ASB] och American Heart Association [bidrag SDG 0630219N och biståndseffektivitet 09GRNT2180065 till YQX].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blood agar plate, 5% sheep blood in Trypticase Soy agar(TSA) | Hardy Diagnostics | A10BX | |
| Trypticase Soy broth (TSB) | BD Biosciences | 211825 | |
| Shaking incubator | Labnet International | I5311-DS | |
| Polyethylene tubing | BD Biosciences | 427401 | |
| Catheter introducer | BD Biosciences | 6999 | |
| Isofluorance | Western Medical Suppy, Inc | 2147 | Follow safety and handling information |
| Surgical Instruments | Fine Science Tools and Biomedical Research Instruments, Inc. | Find the instruments from the two companies for your needs |
References
- Petti, C. A., Fowler, V. G. Staphylococcus aureus bacteremia and endocarditis. Cardiol. Clin. 21, 219-233 (2003).
- Bashore, T. M., Cabell, C., Fowler, V. Update on infective endocarditis. Curr. Probl. Cardiol. 31, 274-352 (2006).
- Fowler, V. G. Jr, Justice, A., Moore, C. Risk factors for hematogenous complications of intravascular catheter-associated Staphylococcus aureus bacteremia. Clin. Infect. Dis. 17, 313-320 (1993).
- Wisplinghoff, H., Bischoff, T., Tallent, S. M., Seifert, H., Wenzel, R. P., Edmond, M. B. Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study. Clin. Infect. Dis. 39, 309-317 (2004).
- Hoen, B. Special issues in the management of infective endocarditis caused by gram-positive cocci. Infect Dis. Clin. North Am. 16, 437-452 (2002).
- Moise, P. A., Hershberger, E., Amodio-Groton, M. I., Lamp, K. C. Safety and clinical outcomes when utilizing high-dose (> or =8 mg/kg) daptomycin therapy. Ann. Pharmacother. 43, 1211-1219 (2009).
- Sakoulas, G., Brown, J., Lamp, K. C., Friedrich, L. V., Lindfield, K. C. Clinical outcomes of patients receiving daptomycin for the treatment of Staphylococcus aureus infections and assessment of clinical factors for daptomycin failure: a retrospective cohort study utilizing the Cubicin Outcomes Registry and Experience. Clin. Ther. 31, 1936-1945 (2009).
- Xiong, Y. Q., Willard, J., Kadurugamuwa, J. L., Yu, J., Francis, K. P., Bayer, A. S. Real-time in vivo bioluminescent imaging for evaluating the efficacy of antibiotics in a rat Staphylococcus aureus endocarditis model. Antimicrob. Agents Chemother. 49, 380-387 (2005).
- Peerschke, E. I., Bayer, A. S., Ghebrehiwet, B., Xiong, Y. Q. gC1qR/p33 blockade reduces Staphylococcus aureus colonization of target tissues in an animal model of infective endocarditis. Infect. Immun. 74, 4418-4423 (2006).
- Ganesh, V. K., Rivera, J. J., Smeds, E. A structural model of the Staphylococcus aureus ClfA-fibrinogen interaction opens new avenues for the design of anti-staphylococcal therapeutics. PLoS Pathog. 4, e1000226 (2008).
- Boles, B. R., Horswill, A. R. Staphylococcal biofilm disassembly. Trends Microbiol. , (2011).
- Tseng, C. W., Sanchez-Martinez, M., Arruda, A., Liu, G. Y. Subcutaneous Infection of Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus (MRSA). J. Vis. Exp. (48), e2528 (2011).
