Summary
Metisiline dirençli nedeniyle deneysel rat endokardit modeli
Abstract
Endokardit dahil Endovasküler enfeksiyonları, yaşamı tehdit eden enfeksiyon sendromdur 1-3. Staphylococcus aureus kabul edilemeyecek kadar yüksek morbidite ve hatta uygun antimikrobiyal ajan tedavileri 4-6 ile mortalite ile bu sendromun en yaygın dünya çapında nedenidir. Nedeniyle Metisiline dirençli S. için enfeksiyonlarda artış aureus (MRSA), vankomisin klinik tedavi başarısızlıkları ve linezolid ve daptomisin direnci artan sorunların yüksek oranda bu enfeksiyonu olan tüm hastalar daha karmaşık bir yönetim var ve yüksek sağlık masrafları 7, 8 yol açtı. Ayrıca, antibiyotik tedavisi sonuçları ile en son çalışmalarda klinik ortamlarda kurulmuştu ve bu nedenle de hasta-hasta arasında değişen ana faktörler tarafından etkilenir olabileceği vurgulanmalıdır. Bu nedenle, ana faktör hayvan-to-hayvana benzer olan endovasküler enfeksiyon ilgili bir hayvan modeli daha fazladırmikrobiyal patogenez yanı sıra, yeni antimikrobiyal ajanların etkinliğini araştırmak için çok önemlidir. Rat Endokardit yakın insan doğal kapak endokarditi yaklaşan köklü bir deneysel hayvan modelidir. Bu model özellikle stafilokok virulans faktörlerinin rolü ve stafilokok endokardit için antibiyotik tedavisi rejimlerinin etkinliğini incelemek için kullanılmıştır. Bu yazıda, bakteriyel patogenezi ve antibiyotik tedavisine yanıt araştırmak için kullanılan olabilir MRSA nedeniyle deneysel endokardit modeli açıklamak.
Protocol
1. Enfeksiyon için MRSA suşları hazırlanması
- Soya Agar (TSA) plaka Triptikaz bir koyun kanı (özel reaktifler ve ekipman Tablo bakınız) -80 bir stok tüp MRSA kültür loopful ° C inoküle ve 37 ° C'de bir gece inkübe edin.
- Hiçbir kir olmadığından emin olmak için kan agar (benzer koloni fenotipleri) üzerinde kültürün saflığı kontrol edin.
- Koyun kanlı TSA plakadan bir koloni seçin ve 15 ml ek kapaklı tüp içinde 5 ml Triptikaz Soya Broth (TSB) içine koloni aşılamak.
- 37 inkübe ° C'de 200 rpm'de sallayarak bir gecede.
2. Cerrahi Kateterler hazırlanması
10 cm uzunluğa ve steril bir forseps ile ucu basarak bir ucunu eritmek; polietilen boru (Becton Dickinson, sipariş no 427.401. PE10) kesin. Kateterin bir ucunu sızdırmazlık amacı kateterizasyon sırasında kanama kaçınmaktır.
3. Pre-surgery Hazırlık ve Anestezi
- Isofluorane-oksijen gaz karışımı (% 50:% 50) içeren bir odaya koyun Sprague-Dawley sıçan (Harlan, Indianapolis, Ind kadın, 250-300 gram) anestezik kadar (etkisi sürer örneğin kaslar gevşer ve pedal refleksleri vardır edilir ), ve gaz karışımı ile anesteziye cerrahisi sırasında bir durumda muhafaza hayvanlar.
- Çeneden sadece Betadine ve% 70 etanol ile sternum altındaki boyun bölgesi temizleyin.
4. Cerrahi Prosedür
- Ameliyat boyunca steril tekniği kullanın. Dikey olarak sternum yukarıda boyun sadece cilt katmanı üzerinden bir insizyon (1-15 cm) olun.
- Künt diseksiyon kullanarak, eğri dişli forseps 2 çift kullanılarak sağ karotis arter açığa fasya ayırın.
- Yavaşça boyun kavite arter dışarı çekin ve ipek sütür yerine iki adet 10 cm uzunlukta arter altında ve maruz sefalik sonunda arter kapalı kravat, arte bir klip yerleştirinkanamayı önlemek için ry.
- Bir kateter introducer (Becton Dickinson, sipariş no. 406.999) kullanarak arter üst küçük bir delik açın, arter delikten bir forseps ile bir kateter takmak, klibini kaldırmak ve kalp doğru kateter aşağı itmek kadar direniş karşılanmaktadır.
- Arterin kaudal ucu çevresinde gevşek dikiş bağlayın ve kateter tarafından belirlenen yerde olduğunda ipek sütür ile yerde kateter sabitleyin: i) kateteri uzunluğu (4-5 cm); daha fazla ilerlemesini ii) direnç ve iii) kalp atışı ile kateter pulsasyon. Deney kalanı için bir yerde kateter bırakın.
- Aşırı sütür ve kateter uçları kesilmiş ve kateter hiçbir kanama olmadığından emin olun. Boyun deri altında gevşek biter Tuck ve cilt klipler ile cilt kapatın.
- Anestezi kurtarıldı kadar ılık bir yerde kafeste sıçan yerleştirin ve yiyecek ve su sağlıyor. Sırasında sık sık kontrol edin ve sıçansonra anestezi kurtarma.
- Bu ameliyat bir "Kategori E" işlemdir. Ağrı üretilen prosedürleri hayvanlara sıkıntı eşlik MRSA enfeksiyonlarının beri analjezikler tarafından hafiflememiş olduğunu.
5.. MRSA enfeksiyonu
- Enfeksiyon 1 ile 7 gün ameliyat sonrası arasında yapılan, ancak deneyler içinde tutarlı devam edilebilir.
- Temiz sıçan% 70 etanol ile kuyruk ve istenilen hücre sayımı (10 4 - En S. aureus için 10 6 kob / hayvan) 0.5 ml MRSA enjekte. Kuyruk damarından intravenöz G 1/2 inç iğne 27 ile Dikkat : MRSA kültür biyogüvenlik düzeyi 2 (BSL2) ait personel ve çevre için potansiyel tehlike ılımlı vardır.
- Hemostaz kafesine sıçan dönmeden önce oluşana kadar yerinde basınç tutun.
6. Kurban Sıçanlar ve Kültür Hedef Dokular
- Sodyum pentobarbital (200 mg ip enjeksiyonu ile sıçan Kurban/ Kg) 1-6 gün post-enfeksiyonu sonrası.
- Sırtında sıçan yerleştirin ve% 70 etanol ile göğüs silin.
- Sternum altındaki göğüs V şeklinde bir kesi yapın ve kalp maruz sternumun her iki tarafındaki kaburga kıkırdağı kesti.
- Kadar yavaşça kalp çekin ve klip aorta yakın kalp dokusu ile ve kalp kurtarmak kadar incelemek.
- 4x4 inç gazlı bez içinde bir steril Petri tabağına yerleştirin kalp, sol ventrikül iç duvarından bir kesim yapmak ve sol taraflı odası açın.
- Kateter yerleştirme için görsel olarak kontrol edin. Inceleyin ve makas ve forseps ile valfinden vejetasyonlar kaldırın.
- Tartılır ve homojenize vejetasyon ve kantitatif kültür için PBS ile seri dilüsyonlar olun.
7. Temsilcisi Sonuçlar
Hemen artere kateter takılması ve kalp yönüne doğru 4-5 cm kateter aşağı iterek sonra, bir direnç experien olacakdüşürebilmiştir. Herhangi bir direnç hissedilen edilirse, kateter başarıyla kateterin yerleştirilmesi etkileyebilecek, kalp odasının sol tarafında içine yerleştirilir edilmemiş olabilir. Daha önce yayınlanmış 9 doğru bir kateter Şekil 1 'de gösterilmiştir.
MRSA örnekleri parçası enfeksiyonu numunenin enfeksiyonu ile saflık için tam canlı bakteri sayısı emin niceliksel kültürlenebilir gerekir. Buna ek olarak, vejetasyonlar kurtarıldı organizmalar inokulum kullanılanlar ile aynı olmalıdır.
Tablo 1, bir S. nin ölümcüllüğünün bir örnek sunar Daha önce 9 yayımlandı sıçan endokardit modelinde aureus suşu. Tüm hayvanlar 10 5 ve 10 6 cfu inokulum ile meydan ve 3 ile 6 gün yüksek S. ile enfeksiyonların geliştirilen endocardits sonra sakrifiye kardiyak vejetasyon yanı sıra böbrek ve dalak aureus yoğunlukları ( Bir SD, standart sapma. P 10 5 veya 10 6 CFU-meydan hayvanlar ile ilgili <0.001. Tablo 1. S. rat endokardit model 9 farklı inokulum ile kardiyak vejetasyonların aureus yoğunluğu. 
Şekil 1. Kateter doğru bir yerde (kalp odasının sol tarafında) olduğunu, ve çok sayıda vejetasyon aort kapakları 9 civarında görülebilir. Ekim (Animas sayısı) Doku 10 CFU / g ± SD bir oturum Ortalama: Bitki örtüsü Böbrek Dalak 10 6 CFU / hayvan (9) 10.36 ± 0.85 7.30 ± 0.64 6.70 ± 0.57 10 5 CFU / hayvan (8) 9.93 ± 0.53 7.14 ± 0.53 6.44 ± 0.63 10 4 CFU / hayvan (7) 3.46 ± 0.50 * 1.81 ± 0.74 * 1.58 ± 0.59 *
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sıçan endokarditi bakteriyel enfeksiyonların 9-11 tedavisinde patogenezine ve antimikrobiyal ajanlar in vivo çalışmalar için önemli ve iyi karakterize hayvan modeli. Ayrıca, sıçan endokardit modelinde akut ve sub-akut enfeksiyonların bir kompozit temsil eder ve yakından insan meslektaşı ve insan doğal kapak endokarditi taklit eder. Ayrıca, bir de konut kateter eşliğinde, klasik bir biyofilm ilişkili enfeksiyon, klinik ortamlarda 12 ortak ve zor bir mesele temsil eder. En önemlisi, sıçan endokardit modeli ile elde ettiğiniz sonuçları son derece tekrarlanabilir.
S. ve patojenisite rat endokardit modelinde aureus, diğer hayvan modelleri gibi, inokulum dozu, bakteriyel büyüme fazı (log vs durağan), hayvanların yaş ve hayvan genetik arka plan 9, 13 de dahil olmak üzere parametreleri, bir dizi bağlı olarak değişebilir. Cerrahi başarı oranları h vardıraraştırmacı teknik uzmanlık ve cerrahi becerileri üzerine ayli bağımlı. Tedavinin başarısı ile ölçülebilir: 1) ameliyatın, hayvan sayısı, 2) kurban zamanda doğru yerde kateter ve 3) vejetasyon kalp kapakçıklarının mevcut.
Özet olarak, sıçan endokardit yakından klinik durum taklit eden bir uygulanabilir, tekrarlanabilir ve önemli bir modeldir. Bu nedenle, bu deney endokarditi sendromlarının tedavi antimikrobiyal ajanlar mikrobik patogenezine ve etkinlik de dahil olmak üzere sepsis araştırma bütün alanları için uygundur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma Sağlık ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenen [hibe ASB R01AI-39.108] ve Amerikan Kalp Derneği [hibe SDG 0630219N ve YQX için YARDIM 09GRNT2180065].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blood agar plate, 5% sheep blood in Trypticase Soy agar(TSA) | Hardy Diagnostics | A10BX | |
| Trypticase Soy broth (TSB) | BD Biosciences | 211825 | |
| Shaking incubator | Labnet International | I5311-DS | |
| Polyethylene tubing | BD Biosciences | 427401 | |
| Catheter introducer | BD Biosciences | 6999 | |
| Isofluorance | Western Medical Suppy, Inc | 2147 | Follow safety and handling information |
| Surgical Instruments | Fine Science Tools and Biomedical Research Instruments, Inc. | Find the instruments from the two companies for your needs |
References
- Petti, C. A., Fowler, V. G. Staphylococcus aureus bacteremia and endocarditis. Cardiol. Clin. 21, 219-233 (2003).
- Bashore, T. M., Cabell, C., Fowler, V. Update on infective endocarditis. Curr. Probl. Cardiol. 31, 274-352 (2006).
- Fowler, V. G. Jr, Justice, A., Moore, C. Risk factors for hematogenous complications of intravascular catheter-associated Staphylococcus aureus bacteremia. Clin. Infect. Dis. 17, 313-320 (1993).
- Wisplinghoff, H., Bischoff, T., Tallent, S. M., Seifert, H., Wenzel, R. P., Edmond, M. B. Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study. Clin. Infect. Dis. 39, 309-317 (2004).
- Hoen, B. Special issues in the management of infective endocarditis caused by gram-positive cocci. Infect Dis. Clin. North Am. 16, 437-452 (2002).
- Moise, P. A., Hershberger, E., Amodio-Groton, M. I., Lamp, K. C. Safety and clinical outcomes when utilizing high-dose (> or =8 mg/kg) daptomycin therapy. Ann. Pharmacother. 43, 1211-1219 (2009).
- Sakoulas, G., Brown, J., Lamp, K. C., Friedrich, L. V., Lindfield, K. C. Clinical outcomes of patients receiving daptomycin for the treatment of Staphylococcus aureus infections and assessment of clinical factors for daptomycin failure: a retrospective cohort study utilizing the Cubicin Outcomes Registry and Experience. Clin. Ther. 31, 1936-1945 (2009).
- Xiong, Y. Q., Willard, J., Kadurugamuwa, J. L., Yu, J., Francis, K. P., Bayer, A. S. Real-time in vivo bioluminescent imaging for evaluating the efficacy of antibiotics in a rat Staphylococcus aureus endocarditis model. Antimicrob. Agents Chemother. 49, 380-387 (2005).
- Peerschke, E. I., Bayer, A. S., Ghebrehiwet, B., Xiong, Y. Q. gC1qR/p33 blockade reduces Staphylococcus aureus colonization of target tissues in an animal model of infective endocarditis. Infect. Immun. 74, 4418-4423 (2006).
- Ganesh, V. K., Rivera, J. J., Smeds, E. A structural model of the Staphylococcus aureus ClfA-fibrinogen interaction opens new avenues for the design of anti-staphylococcal therapeutics. PLoS Pathog. 4, e1000226 (2008).
- Boles, B. R., Horswill, A. R. Staphylococcal biofilm disassembly. Trends Microbiol. , (2011).
- Tseng, C. W., Sanchez-Martinez, M., Arruda, A., Liu, G. Y. Subcutaneous Infection of Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus (MRSA). J. Vis. Exp. (48), e2528 (2011).
