Summary
מאמר זה מציג שיטה לאיסוף הדם באבי העורקים הגב של דג הזברה. כמו כן, מספק הוראות להשגת סרום לשימוש בניתוחים ביוכימיים, כגון בדיקות לקביעת רמות כולסטרול וטריגליצרידים.
Abstract
דג הזברה שימש במודל חיה ללימודים של מחלות אנושיות שונות. זה יכול לשמש פלטפורמה קליני רב עוצמה עבור מחקרים של אירועים מולקולריים ואסטרטגיות טיפוליות, כמו גם להערכת המנגנונים הפיזיולוגיים של כמה פתולוגיות 1.
קיימים פרסומים מעטים יחסית הקשורים לפיזיולוגיה דג הזברה הבוגרת של איברים ומערכות 2, דבר שעלול להוביל את החוקרים להסיק את הטכניקות הבסיסיות הנדרשות על מנת לאפשר בדיקה של מערכות דג הזברה חסרים 3. ערכים ביוכימיים המטולוגית של דג הזברה דווחו לראשונה על ידי Murtha ו 4 עמיתים שהעסיק איסוף דם הטכניקה שתוארה לראשונה בשנת 1999 על ידי Jagadeeswaran ועמיתיו בשנת 2003. בקצרה, הדם נאסף דרך עצה micropipette דרך חתך לרוחב, כ 0.3 ס"מ אורך, באזור של אבי העורקים הגב 5. בגלל הממדים הקטנים המעורבים, זההיא טכניקה דיוק גבוהה המחייבת רופא מיומן. טכניקה דומה שימשה באותה קבוצה בפרסום אחר באותה שנה 6. בשנת 2010, איימס ועמיתיו העריכו שלמים רמות הגלוקוז בדם על דג הזברה 7. הם קיבלו גישה דם על ידי ביצוע עריפות במספריים ולאחר מכן החדרת צינור heparinized אוסף microcapillary לשטף דיבור החזה. הם מזכירים קשיים המוליזה כי נפתרו עם טמפרטורת האחסון המתאים בהתבסס על העבודה קילפטריק et al. 8. כאשר מנסים להשתמש בטכניקה של Jagadeeswaran במעבדה שלנו, מצאנו כי זה היה קשה לבצע את החתך במקום הנכון בדיוק כפי שלא לאפשר כמות משמעותית של דם ללכת לאיבוד לפני האוסף אפשר להתחיל.
לאחרונה, גופטה et al. 9 תיאר כיצד לנתח איברים דג הזברה למבוגרים, Kinkle et al. 10 תיאר כיצד לבצע intraperitonזריקות EAL ו Pugach et al. 11 תיאר כיצד לבצע רטרו מסלול זריקות. עם זאת, יותר עבודה נדרשת כדי לחקור באופן מלא יותר טכניקות בסיסיות לחקר דג הזברה.
גודלו הקטן של דג הזברה מציב אתגרים לחוקרים להשתמש בו בתור מודל ניסיוני. יתר על כן, נתון זה המספר הקטן של הסקאלה, חשוב כי טכניקות פשוטות מפותחים כדי לאפשר לחוקרים לבחון את היתרונות של המודל דג הזברה.
Protocol
1. פרוטוקול טקסט
- לפני איסוף הדם דג הזברה, יש צורך להכין מים anesthetizing. יוצקים ~ 200 מ"ל של מים לתוך מיכל אקווריום עם קיבולת של 500 מ"ל. הוסף את ~ 200 גרם של קוביות קרח. הטמפרטורה צריכה להיות על 4 ° C. כמו קוביות קרח נמס, יהיה צורך להוסיף קוביות קרח יותר כדי לשמור על טמפרטורה קבועה ליד 4 ° C.
- כאשר המים anesthetizing מוכן, להכין את החומרים הדרושים לאיסוף דם. שים עצה השמירה נמוכה על pipettor P20 ולהשאיר pipettor שבו ניתן לגשת בקלות. אין לאפשר את קצה פיפטה ליצור קשר עם כל מקורות הזיהום.
- מכסים בצלחת פטרי עם פיסת גזה יבש. להב פלדה עוד פיסת גזה צריך להיות ממוקם במקום נגיש.
- צנטריפוגה להתאים צינורות פלסטיק יהיה צורך.
- כאשר החומרים הנ"ל מוכנים, לתפוס את דג הזברה 1 להיות שנינות הרדיםחה רשת דיג ולשחרר אותו למים כי הוכן הרדמה. דג הזברה דורשים 3-6 של במים צונן להיות מורדם, בהתאם דגים. שמור את הדגים במים קרים עד שהוא כבר לא מגיב לגירויים חיצוניים.
- באמצעות רשת דיג, הצב את הדג הרדים על דף שהוכן של גזה, והשאיר את הזנב של גזה. מקפלים את גזה על הראש של הדג והגוף משמיט רק את זנבו. מכניסים את הדג מכוסה גזה על צלחת פטרי.
- השתמש בלהב פלדה לעשות חתך אלכסוני רק בין סנפיר אנאלי סנפיר הזנב. הדם יתחיל לצאת. בשלב זה, יש צורך לפעול במהירות.
- שואפים בעדינות את הדם שיוצא עם pipettor P20 (טעון מראש עם הטיפ השמירה נמוכה). כמות הדם, כי ניתן לאסוף תלוי בגודל של הדג ועד כמה שזה היה מורדם כראוי. זה בדרך כלל נע בין 5 ל μl 20. כאשר הדם מפסיק גoming החוצה, בעדינות להעביר את הדם שאף לתוך הצינור.
- כדי למנוע המוליזה, זה קריטי, כי צינור עם דם זה יטופל בזהירות רבה, ללא כל תנועות דרסטיות עד מכניסים לצנטריפוגה.
- כדי למנוע המוליזה, חשוב גם כי דגימת דם להיות מאובטח בצנטריפוגה בתוך 10 דקות של איסוף הדם.
- במידת הצורך, ניתן לשלב בין דם חיה יותר, מה שהופך לבריכה. אספו דגימות יעבוד בסדר כל עוד עיכוב בין איסוף דם דגים צנטריפוגה הראשון אינו עולה על 10 דקות.
- לאחר איסוף הדם נעשה, בצנטריפוגה דם במשך 10 דקות על 0.5 גרם (צנטריפוגה Eppendorf 5415D).
- לאחר צנטריפוגה, סרום נמצא בשכבה העליונה של הצינור. עם פיפטה, לשאוב בדם, כדי לוודא לקבל רק את הסרום, תוך שמירה על שכבות הן חילקו גם ויציב.
- מעבירים את הנוזל לתוך microtube חדש והואהוא מוכן לשימוש בניתוחים ביוכימיים. הסרום ניתן לאחסן את הקרח בזמן שהוא מחכה בקוצר רוח להתחיל את ניתוח ביוכימיים.
- אם בסרום לא ישמש מיד, זה יכול להיות קפוא ב -18 ° C עד כ 3 חודשים.
2. נציג תוצאות
אפשר היה לאסוף 5-20 μl של דם מלא מדגים כל מה מייצג הדם ואפילו 4 פעמים יותר מאשר הטכניקות המתוארות לעיל (טבלה 2). ניתוח ביוכימי של כולסטרול כללי, HDL כולסטרול, LDL-כולסטרול, טריגליצרידים בוצעו לאחר איסוף הדם באמצעות טכניקה זו. שתי קבוצות של שני המינים היו דגים צם במשך 24 שעות לפני איסוף הדם, כדי למנוע התערבות צריכת מזון. הניתוחים נעשו עם קטן מדורגים בדיקות colorimetric (Labtest Diagnóstica SA, ברזיל) עבור סכום כולל ניתוחים כולסטרול וטריגליצרידים, 3 μl של בסרום היו בשימוש. על כולסטרול ה-LDL וה-HDL-כולסטרול, ניתוח 4 μl ו 10 μl של סרום שימשו, בהתאמה. ניתוחים אלו בוצעו על דגימות משולב של דג הזברה 10 לדגימה.
רמות בסרום lipidic הושוו בין דגים לגשת ביצים שלהם ואלה, באקווריום התחתון מכוסה, לא תהיה גישה הביצים שלהם למשך ניסיוני של 2 שבועות. ניתוח סרום הראו כי רמות בסרום של הכולסטרול הכללי (עם ביצים 362 ± 42 מ"ג / ד"ל, ללא ביצים 357 ± 13 מ"ג / ד"ל), HDL-כולסטרול (עם ביצים 91.22 ± 1.79 מ"ג / ד"ל, ללא ביצים 72.14 ± 2.89 מ"ג / ד"ל), ו-LDL-כולסטרול (עם ביצים 55.68 ± 10.88 מ"ג / ד"ל, ללא ביצים 44.18 ± 9.84 מ"ג / ד"ל) לא היו שונים משמעותית בין הקבוצות. עם זאת, רמות הטריגליצרידים היו נמוכים משמעותית בקבוצת הניסוי (ללא ביצים 292 ± 64 מ"ג / ד"ל) מאשר בקבוצת הביקורת (עם ביצים 457 ± 25 mg / dL, P = 0.03).
| & Nbsp; | עם גישה ביצים | ללא גישה ביצים |
| הכולסטרול הכללי (מ"ג / ד"ל) | 362.82 ± 73.11 | 357.69 ± 23.08 |
| LDL - כולסטרול (מ"ג / ד"ל) | 55.69 ± 18.84 | 44.19 ± 17.05 |
| HDL - כולסטרול (מ"ג / ד"ל) | 91.23 ± 3.11 | 72.14 ± 5.01 |
| טריגליצרידים (מ"ג / ד"ל) | 457.64 ± 43.78 * | 292.36 ± 111.28 |
טבלה 1. Seric רמות כולסטרול וטריגליצרידים עבור שתי הקבוצות שנחקרו (עם גישה ביצים ללא גישה ביצים) לידי ביטוי בסטיית תקן ממוצע ±.
* מובהק סטטיסטית (p = 0.03). מבחן t הסטודנטים.
| Aut הסוס של כבודו | מקום החתך | קציר השיטה | הרדמה | כמות הדם הנאסף |
| Jagadeeswaran et. al., 1999 Murtha et al., 2003 | דיסקציה מיקרו האחורי סנפיר הגב | Micropipette | לא הוזכר MS222 3% במים קרים | 1 μl 5 5 μl 10 |
| איימס et al., 2010 | עריפת ראש | מיקרו נימים צינור | MS222 0,02% 28 ° C מים | 5 μl 10 |
| המחקר הנוכחי | חתך בין סנפיר אנאלי סנפיר הזנב | Micropipette וטיפים שמירה נמוכים | מים וקרח שבבי | 5 μl 20 |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מאמר זה מציג טכניקה פשוטה המאפשרת דם נוספת וניתוח סרום בניסויים דג הזברה. טכניקה זו יש פוטנציאל לתרום בעתיד מחקרים דג הזברה המטולוגיות הדורשים פרמטרים נתונים דם. זה צריך גם לאפשר ליישומים יותר של דג הזברה כמודל ניסיוני.
טכניקה זו אינה דורשת כישורים מיוחדים או יישום של שיטה מדויקת. יתר על כן, היא מאפשרת את כמות כפולה של דם כדי לאסוף לעומת טכניקות אחרות, ובכך מאפשר שימוש של דגים פחות כדי להשיג את הסכום הדרוש של חומר ביולוגי. טכניקה יש 1 שלב קריטי, בו הוא כי דגימות דם להתנהל בזהירות דם דג הזברה יכול להיגרם המוליזה בקלות רבה. עיכוב הזמן בין איסוף דם צנטריפוגה חייב להיות מוגבל. מגבלה של 10 דקות צריך למנוע המוליזה. המהירות ואת משך הזמן של צנטריפוגה (0.5 גרם במשך 10 דקות) שוLD להיות גם אחריו בהחלט.
טכניקות אחרות איסוף דם נעשו ניסיונות לפני טכניקה זו פותחה. עם זאת, מספר בעלי החיים המשמשים היה סכומים גדולים וקטנים מאוד של דם נאספו דגים כל אחד. טכניקה חדשה זו אפשרה את השימוש בבעלי חיים פחות, הודגם להיות ריאלי עם מתרגלים ברמה נמוכה מיומנות, ונתן תוצאות טובות יותר מאשר שיטות אחרות מבחינת כמות הדם שנאסף דגים כל אחד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגוד עניינים הצהיר.
Acknowledgments
FIPE / HCPA - פונדו דה Incentivo דואר Pesquisa Eventos
שכמיות - Coordenação Aperfeiçoamento דה דה דה Pessoal Nível מעולה
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Low retention tips | Applied Biosystems | 022493020 | |
| Eppendorf Centrifuge 5415D | Eppendorf | Discontinued |
References
- Schneider, A. C. R., dos Santo, J. L., Porawski, M., Schaefer, P. G., Maurer, R. L., Matte, U., da Silveira, T. R. Implementação de um novo modelo de experimentação animal Zebrafish. Rev. HCPA. 29, 100-103 (2009).
- Briggs, J. P. The zebrafish: a new model organism for integrative physiology. Am. J. Physiol. Regulatory Integrative Comp. Physiol. 282, 3-9 (2002).
- Menke, A. L., Sptsbergen, J. M., Wolterbeek, A. P. M., Woutersen, R. A. Normal anatomy and histology of adult Zebrafish. Toxicologic Pathology. 000, 1-16 (2011).
- Murtha, J. M., Qi, W., Keller, E. T. Hematologic and serum biochemical values for Zebrafish. Comp. Med. 53, 37-41 (2003).
- Jagadeeswaran, P., Sheehan, J. P., Craig, F. E., Troyer, D. Identification and characterization of zebrafish thrombocytes. Br. J. Haematol. 107, 731-738 (1999).
- Jagadeeswaran, P., Sheehan, J. P. Analysis of blood coagulation in the zebrafish. Blood Cells Mol. Dis. 25, 239-249 (1999).
- Eames, S. C., Philipson, L. H., Prince, V. E., Kinkel, M. D. Blood sugar measurement in zebrafish reveals dynamics of glucose homeostasis. Zebrafish. 7, 205-213 (2010).
- Kilpatrick, E. S., Rumley, A. G., Rumley, C. N. The effect of haemolysis on blood glucose meter measurement. Diabet. Med. 12, 341-343 (1995).
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of Organs from the Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (37), e1717 (2010).
- Kinkel, M. D., Eames, S. C., Philipson, L. H., Prince, V. E. Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (42), e2126 (2010).
- Pugach, E. K., Li, P., White, R., Zon, L. Retro-orbital Injection in Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (34), e1645 (2009).
