Summary
Questo documento presenta una tecnica per la raccolta di sangue dall'aorta dorsale di Zebrafish. Esso fornisce inoltre le istruzioni per ottenere il siero per l'uso in analisi biochimiche, come i test per determinare i livelli di colesterolo e trigliceridi.
Abstract
Il pesce zebra è stato usato come modello animale per lo studio di varie malattie umane. Può servire come una potente piattaforma preclinico per studi di eventi molecolari e strategie terapeutiche nonché per valutare i meccanismi fisiologici di alcune patologie 1.
Ci sono relativamente poche le pubblicazioni relative alla fisiologia zebrafish adulto di organi e sistemi 2, che possono portare i ricercatori a concludere che le tecniche di base necessarie per consentire l'esplorazione di sistemi di zebrafish mancano 3. Ematologiche valori biochimici di zebrafish sono stati segnalati nel 2003 da Murtha e 4 colleghi che hanno impiegato una tecnica di prelievo di sangue prima descritta da Jagadeeswaran e colleghi nel 1999. Brevemente, il sangue è stato raccolto tramite una punta micropipetta attraverso un'incisione laterale, di circa 0,3 cm di lunghezza, nella zona dell'aorta dorsale 5. A causa delle dimensioni minime, anche questoè una tecnica di alta precisione che richiede un operatore molto esperto. La stessa tecnica è stata utilizzata dallo stesso gruppo in un'altra pubblicazione nello stesso anno 6. Nel 2010, Eames e colleghi ha valutato i livelli di glucosio nel sangue intero in zebrafish 7. Hanno ottenuto l'accesso al sangue eseguendo decapitazioni con le forbici e poi l'inserimento di un tubo di raccolta eparinizzata microcapillare nella articolazione pettorale. Essi indicano difficoltà con emolisi che sono stati risolti con una temperatura di conservazione appropriata in base al lavoro Kilpatrick et al. 8. Quando si tenta di usare la tecnica Jagadeeswaran nel nostro laboratorio, abbiamo scoperto che era difficile fare l'incisione in proprio il posto giusto per non permettere una notevole quantità di sangue da perdere prima della raccolta potrebbe essere avviato.
Recentemente, Gupta et al. 9 descritto come sezionare organi zebrafish adulto, Kinkle et al. 10 descritta come eseguire intraperitoniniezioni EAL, e Pugach et al 11. descritto come eseguire la retro-orbitali iniezioni. Tuttavia, più lavoro è necessario per esplorare più a fondo le tecniche di base per la ricerca in zebrafish.
Le dimensioni ridotte di zebrafish rappresenta una sfida per i ricercatori che lo utilizzano come modello sperimentale. Inoltre, data la piccolezza della scala, è importante che le tecniche semplici sono stati sviluppati per consentire ai ricercatori di esplorare i vantaggi del modello zebrafish.
Protocol
1. Protocollo di testo
- Prima di prelevare il sangue zebrafish, è necessario preparare acqua anestetizzante. Versare circa 200 ml di acqua dell'acquario in un contenitore con una capacità di 500 ml. Aggiungi ~ 200 g di cubetti di ghiaccio. La temperatura dovrebbe essere di circa 4 ° C. Poiché i frammenti di ghiaccio sciolgono, sarà necessario aggiungere altri frammenti di ghiaccio per mantenere una temperatura costante vicino 4 ° C.
- Quando l'acqua anestetizzante è pronto, preparare i materiali necessari per la raccolta del sangue. Metti una bassa ritenzione punta su una pipetta P20 e lasciare il pipettatore dove può essere facilmente accessibili. Non lasciare che la punta della pipetta per contattare tutte le fonti di contaminazione.
- Coprire una capsula di Petri con un pezzo di garza asciutta. Una lama in acciaio e un altro pezzo di garza deve essere collocato in un luogo facilmente accessibile.
- Una centrifuga adatta per tubi in plastica sarà necessario.
- Quando i suddetti materiali sono preparati, catturare il pesce zebra prima di essere anestetizzato witha rete da pesca e rilasciarlo in acqua che è stato preparato per l'anestesia. Zebrafish richiedono 3-6 s in acqua raffreddata per essere anestetizzato, a seconda del pesce. Conservare il pesce in acqua fredda fino a che non risponde più agli stimoli esterni.
- Utilizzando la rete da pesca, posizionare il pesce anestetizzato su un pezzo di garza preparata, lasciando la coda fuori della garza. Piegare la garza sopra la testa del pesce e il corpo lasciando solo la coda. Mettere il pesce coperto con della garza sulla piastra di Petri.
- Utilizzare la lama d'acciaio per fare un'incisione diagonale giusta tra la pinna anale e la pinna caudale. Il sangue inizia a venire fuori. A questo punto, è necessario lavorare velocemente.
- Delicatamente aspirare il sangue che esce con la pipetta P20 (pre-caricato con una punta bassa ritenzione). La quantità di sangue che può essere raccolto dipende dalle dimensioni del pesce e in quale misura che è stato anestetizzato correttamente. È solito varia dal 5-20 pl. Quando il sangue si ferma coming out, delicatamente trasferire il sangue aspirato in un tubo.
- Per evitare emolisi, è fondamentale che il tubo di sangue in esso essere maneggiato con estrema cura, senza movimenti drastiche finché non viene inserito nella centrifuga.
- Per evitare emolisi, è altresì importante che il campione di sangue essere fissato nella centrifuga entro 10 minuti dal prelievo di sangue.
- Se necessario, è possibile combinare sangue da più di un animale, facendo una piscina. Campioni compositi funziona bene fino a quando il ritardo tra la raccolta del sangue dal primo pesce e centrifugazione non superi i 10 minuti.
- Quando la raccolta del sangue è fatto, centrifugare il sangue per 10 minuti a 0,5 g (Eppendorf Centrifugare 5415D).
- Dopo centrifugazione, il siero è al livello superiore del tubo. Con una pipetta, aspirare il siero, avendo cura di ottenere solo il siero mantenendo entrambi gli strati ben divisi e stabili.
- Trasferire il siero in una nuova provetta eè pronto per essere usato in analisi biochimiche. Il siero può essere conservato in ghiaccio mentre l'ora di iniziare le analisi biochimiche.
- Se il siero non sarà utilizzato immediatamente, può essere congelato a -18 ° C fino a circa 3 mesi.
2. Risultati rappresentativi
È stato possibile raccogliere 5-20 pl di sangue intero da ogni pesce che rappresenta il sangue persino 4 volte più tecniche precedentemente descritte (Tabella 2). Analisi biochimica del colesterolo totale, HDL-colesterolo, LDL-colesterolo e trigliceridi sono stati eseguiti dopo la raccolta del sangue utilizzando questa tecnica. Due gruppi di entrambi i sessi pesci sono stati tenuti a digiuno per 24 ore prima del prelievo del sangue al fine di evitare interferenze assunzione di cibo. Le analisi sono state effettuate con i test colorimetrici piccola scala (Labtest Diagnostica SA, Brasile) per il totale le analisi del colesterolo e dei trigliceridi, 3 microlitri di siero sono stati utilizzati. Per LDL-colesterolo e HDL-colesteroloanalisi, 4 pl e 10 pl di siero sono stati utilizzati, rispettivamente. Queste analisi sono state effettuate su campioni aggregati di 10 zebrafish per campione.
I livelli sierici di lipidici sono stati confrontati tra i pesci da cui si accede le proprie uova e quelle che, in un acquario fondo coperto, non ha avuto accesso ai loro proprie uova per un periodo sperimentale di 2 settimane. L'analisi del siero ha mostrato che i livelli sierici di colesterolo totale (con le uova 362 ± 42 mg / dL e senza uova 357 ± 13 mg / dL), HDL-colesterolo (con le uova 91,22 ± 1,79 mg / dL e senza uova 72,14 ± 2.89 mg / dL), e di LDL-colesterolo (con uova 55,68 ± 10,88 mg / dL e senza uova di 44,18 ± 9,84 mg / dL) non differiva significativamente tra i gruppi. Tuttavia, i livelli di trigliceridi erano significativamente più bassi nel gruppo sperimentale (senza uova 292 ± 64 mg / dL) rispetto al gruppo di controllo (con uova 457 ± 25 mg / dL, p = 0,03).
| & Nbsp; | Con l'accesso alle uova | Senza l'accesso alle uova |
| Colesterolo totale (mg / dL) | 362,82 ± 73,11 | 357,69 ± 23,08 |
| LDL - Colesterolo (mg / dL) | 55,69 ± 18,84 | 44,19 ± 17,05 |
| HDL - Colesterolo (mg / dL) | 91,23 ± 3,11 | 72,14 ± 5,01 |
| Trigliceridi (mg / dL) | 457,64 ± 43,78 * | 292,36 ± 111,28 |
Tabella 1. I livelli sierici di colesterolo e trigliceridi per entrambi i gruppi studiati (con accesso alle uova e senza accesso alle uova), espressa in media ± deviazione standard.
* Statisticamente significativo (P = 0,03). Test t di Student.
| Aut hors | Luogo di incisione | Harvest metodo | Anestesia | Quantità di sangue raccolto |
| Jagadeeswaran et. al., 1999 Murtha et al., 2003 | Dissezione posteriore Micro pinna dorsale | Micropipetta | Non menzionato MS222 3% in acqua fredda | 1 a 5 microlitri 5 a 10 microlitri |
| Eames et al., 2010 | Decapitazione | Micro tubo di capillari | MS222 0,02% 28 ° C l'acqua | 5 a 10 microlitri |
| Presente studio | Incisione tra pinna anale e pinna caudale | Micropipetta e suggerimenti bassa ritenzione | Acqua e ghiaccio chip | 5 a 20 pl |
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Discussion
Questo documento presenta una tecnica semplice che permette un ulteriore analisi del sangue e siero in esperimenti zebrafish. Questa tecnica ha il potenziale per contribuire agli studi futuri zebrafish ematologiche che richiedono i dati dei parametri del sangue. Esso dovrebbe inoltre consentire di maggiori applicazioni del pesce zebra come modello sperimentale.
Questa tecnica non richiede competenze particolari o dell'attuazione di una tecnica precisa. Inoltre, essa consente a doppio della quantità di sangue da raccogliere rispetto ad altre tecniche, permettendo quindi l'utilizzo di meno pesci da ottenere la quantità necessaria di materiale biologico. La tecnica ha un passo cruciale, e cioè che i campioni di sangue devono essere manipolati con cura, come il sangue zebrafish può incorrere emolisi molto facilmente. Il ritardo di tempo tra la raccolta del sangue e la centrifugazione deve essere strettamente limitato. A 10 minuti di limite dovrebbe evitare l'emolisi. La velocità e la durata di centrifugazione (0,5 g per 10 minuti) should anche essere seguite scrupolosamente.
Altre tecniche di raccolta del sangue sono state tentate prima di questa tecnica è stata sviluppata. Tuttavia, il numero di animali utilizzati e grandi quantità molto piccole di sangue sono stati raccolti da ciascun pesce. Questa nuova tecnica ha permesso l'utilizzo di un minor numero di animali, ha dimostrato di essere fattibile con gli operatori di basso livello di abilità, e ha dato risultati migliori rispetto ad altre tecniche in termini di quantità di sangue raccolto da ogni pesce.
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Disclosures
Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.
Acknowledgments
FIPE / HCPA - Fundo de incentivo uno Pesquisa e Eventos
CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de pessoal de Nivel Superior
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Low retention tips | Applied Biosystems | 022493020 | |
| Eppendorf Centrifuge 5415D | Eppendorf | Discontinued |
References
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