大人のゼブラフィッシュの生化学的解析のための採血

Summary

本論文では、ゼブラフィッシュの背側大動脈から採血するためのテクニックを紹介します。それはまた、コレステロールとトリグリセリドのレベルを決定するためのテストとして生化学的解析に使用するための血清を得る方法について説明します。

Abstract

ゼブラフィッシュは、いくつかのヒト疾患の研究のための動物モデルとして使用されています。それは分子事象の研究と治療戦略のためにだけでなく、いくつかの病態¹の生理学的メカニズムを評価するための強力な前臨床試験のプラットフォームとして機能することができます。

研究者は、ゼブラフィッシュ系の探査を可能にするために必要な基本的なテクニックは³欠けていることを推測する可能性がある臓器やシステム²の成人のゼブラフィッシュの生理機能に関連した比較的少数の出版物があります。ゼブラフィッシュの血液生化学値は、最初1999年に初めてJagadeeswaranらによって記述された採血技術を採用したマーサと同僚⁴で2003年に報告されました。簡単に言うと、血液は背大動脈⁵の領域では、長さ約0.3センチ、横方向の切開口からマイクロピペットチップを介して収集されました。関与分寸法、これのために熟練した医師を必要とする高精度な技術である。同じ手法は同年⁶の別のパブリケーションで同じグループによって使用されていました。 2010年、イームズらは、ゼブラフィッシュ⁷の全血ブドウ糖のレベルを評価した。彼らは、はさみでdecapitationsを実行して、胸の関節にヘパリンマイクロキャピラリーコレクションチューブを挿入することにより、血液へのアクセスを獲得しました。彼らは労働キルパトリックらに基づいて、適切な保存温度で解決された溶血の困難に言及^8。我々の研究室でJagadeeswaranのテクニックを使用しようとすると、我々は、コレクションが開始される前に失われる血液かなりの量のを許可しないように、それが正確に適切な場所に切開を行うことが困難であることがわかった。

最近、グプタら⁹大人ゼブラフィッシュの臓器、もつれらを分析する方法を説明しました^。10 intraperitonを実行する方法を説明しましたEAL注射、Pugachら^11は、眼窩の注入を実行する方法について説明します。しかし、より多くの作業がより完全にゼブラフィッシュの研究のための基本的な技術を探求するために必要です。

ゼブラフィッシュのサイズが小さい実験モデルとして使用する研究者のための課題を提示します。さらに、規模の小ささ、この与えられた、それは単純な手法が研究者は、ゼブラフィッシュモデルの利点を探求できるようにするために開発されていることが重要です。

Protocol

1。プロトコルのテキスト

1. ゼブラフィッシュの血液を採取する前に、麻酔水を準備する必要があります。 500mlの容量の容器に水槽の水〜200mlを注ぎます。氷のチップ〜200グラムを追加します。温度は、約4℃でなければなりません氷片が溶けたように、それは4℃付近の一定温度を維持するために、より多くの氷のチップを追加する必要があります
2. 麻酔水の準備が整うと、血液採取のために必要な材料を準備します。 P20ピペッターの低リテンションチップを入れて、それが簡単にアクセスすることができピペッターのままにしておきます。ピペットの先端が汚染の源に連絡することはできません。
3. 乾いたガーゼでペトリ皿をカバーしています。鋼の刃とガーゼの別の部分は簡単にアクセスできる場所に配置する必要があります。
4. プラスチックチューブに適合した遠心分離機が必要になります。
5. 上記の材料は用意されている場合、麻酔ウィットを最初のゼブラフィッシュを捕獲haの漁網と麻酔のために準備された水の中にそれを解放します。ゼブラフィッシュは、魚に応じて、冷水で3月6日Sは麻酔であることが必要です。それはもはや外部からの刺激に応答しなくなるまで冷水の魚を保管してください。
6. 漁網を使用して、ガーゼの尾を切り残して、ガーゼの準備部分に麻酔をかけた魚を置きます。唯一の尾を残して魚の頭と体の上にガーゼを折る。ペトリ皿の上にガーゼで覆われた魚を入れてください。
7. ちょうど臀鰭と尾鰭の間に斜めの切開を作るために鋼の刃を使用しています。血が出てくるが開始されます。この時点では、迅速に作業する必要があります。
8. 優しくP20のピペッター（低リテンションチップで事前にロードされた）で出てくる血を熱望する。収集することができる血液の量は、魚の大きさとそれが正常に麻酔をかけたこと程度に依存しています。これは通常、5〜20μlに異なります。血液は、cを停止したとき外oming、優しくチューブに熱望血液を転送します。
9. 溶血を避けるために、それが遠心分離機内に配置されるまでの血液チューブは、任意の抜本的な動きをすることなく、非常に慎重に処理することが重要です。
10. 溶血を回避するために、血液サンプルは採血後10分以内に遠心分離器で保護されることも重要です。
11. 必要に応じて、プールを作り、複数の動物から血液を組み合わせることが可能です。プールされたサンプルは、最初の魚や遠心分離から血液採取の間の遅延が10分を超えない限り、正常に動作します。
12. 採血が行われると、0.5グラム（エッペンドルフ遠心機5415D）で10分間、血液を遠心します。
13. 遠心分離後、血清は、チューブの最上位層である。ピペットで、よく分割され、安定した両方のレイヤーを維持しながら、単に血清を取得していることを確認し、血清を吸引除去する。
14. 新しいマイクロチューブに血清を転送し、それ生化学的な分析に使用できるようになりました。それは生化学的解析を開始するために待っている間に血清を氷中で保存することができます。
15. 血清はすぐに使用されません場合は、-18℃で約3ヶ月までのCで凍結することができます。

2。代表的な結果

それは、以前説明したテクニック（ 表2）よりも4倍以上の血液を何を表しているか、各魚から全血5〜20μlを収集することが可能であった。総コレステロール、HDL-コレステロール、LDL-コレステロール、トリグリセリドの生化学的解析は、この手法を用いて採血した後に行われた。男女とも魚の二つのグループが、食物摂取の干渉を避けるために、採血前24時間絶食させた。分析は、総コレステロールおよびトリグリセリドの分析のための小さなスケールの比色試験（LabtestダイアグSA、ブラジル）で行われた、血清中の3μlを使用しました。 LDL-コレステロールとHDL-コレステロール分析は、4μlの血清10μlをそれぞれ用いた。これらの分析は、サンプルあたり10ゼブラフィッシュのプールされたサンプルで実施されました。

血清脂質レベルは、自分の卵とボトムカバー水族館で、2週間の実験期間中に自分の卵へのアクセス権を持っていなかったこと、それらにアクセスした魚の間で比較した。血清分析したところ、血清総コレステロールのレベル（卵362±42 mg / dLのと、卵なし357±13 mg / dL）を、HDL-コレステロール（卵91.22±1.79 mg / dLのと、卵なしで72.14±2.89ミリグラム/ dL以上）、および（卵55.68±10.88 mg / dLのと、卵44.18±9.84 mg / dLのなし）LDL-コレステロールは両群間に有意差は認められなかった。ただし、トリグリセリドのレベルは、対照群に比べ実験群（卵292±64 mg / dLのなし）（P = 0.03卵457±25 mg / dL）を有意に低かった。

＆ニッポン放送P;	卵へのアクセス権を持つ	卵へのアクセスなし
総コレステロール（mg / dL）を	362.82±73.11	357.69±23.08
LDL - コレステロール（mg / dL）を	55.69±18.84	44.19±17.05
HDL - コレステロール（mg / dL）を	91.23±3.11	72.14±5.01
トリグリセリド（mg / dL）を	457.64±43.78 *	292.36±111.28

表1。両方の研究グループのコレステロールおよびトリグリセリドsericレベル（卵へのアクセス権を持つと卵へのアクセスなし）平均値±標準偏差で表されます。

*統計的に有意（P = 0.03）。 Student t検定。

AUTオードブル	切開の場所	収穫法	麻酔	採取した血液の量
Jagadeeswaranら。ら、1999マーサら、2003	背びれの後方にマイクロ解剖	マイクロピペット	記載されていない 冷たい水でMS222 3パーセント	1〜5μL 5 10μL
イームズら、2010	断頭術	マイクロキャピラリーチューブ	MS222 0.02％ 28°Cの水	5 10μL
本研究	臀鰭と尾鰭の間に切開	マイクロピペットおよび低リテンションのヒント	水と氷のチップ	5 20μlの

e_content "> 表2。前述の採血技術と本研究では説明したものとの比較。

Discussion

本論文では、ゼブラフィッシュの実験ではさらに、血液や血清分析を可能にする単純な手法を提示します。この手法では、血液パラメータのデータを必要とする将来のゼブラフィッシュ血液の研究に貢献する可能性を秘めています。また、実験モデルとしてのゼブラフィッシュの大きいアプリケーションを許可する必要があります。

この手法は、特別なスキルや正確な技術の実装を必要としません。また、それによって生物学的物質の必要量を得るために少数の魚を使用することを可能にし、他の技術に対して相対的に収集される血液の量を倍にアップできます。技術は、ゼブラフィッシュの血液は非常に容易に溶血が発生する場合がありますように血液サンプルを慎重に処理されることが1つの重要なステップがあります。採血し、遠心の間の時間遅延が厳密に制限する必要があります。 10分の制限が溶血を防止する必要があります。遠心分離の速度と持続時間（10分間0,5 g）の寿ldは、厳密に従うこと。

この技術が開発される前に他の血液収集技術が試みられた。しかし、使用される動物の数が大きく、血中の非常に小さな量は、各魚から採取した。より少ない動物の使用を許可し、この新しい技術は、低スキルレベルの実務で可能であることが示され、各魚から採取した血液の量の面で他の手法よりも良い結果を与えた。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Low retention tips	Applied Biosystems	022493020
Eppendorf Centrifuge 5415D	Eppendorf	Discontinued