Anbringen biologischen Sonden zur Silica Optische Biosensoren Mit Silane Coupling Agents

Summary

Biosensoren Verbindung mit komplexen, biologischen Umgebungen und führen gezielte Erkennung durch die Kombination von hochempfindlichen Sensoren mit sehr spezifischen Sonden, die an dem Sensor über Oberflächenmodifizierung. Hier zeigen wir die Funktionalisierung der Oberfläche von Silica optische Sensoren mit Biotin mit Silankupplungsmittel, um den Sensor und die biologische Umwelt zu überbrücken.

Abstract

Zur Schnittstelle mit biologischen Umgebungen, Biosensor-Plattformen, wie die beliebten Biacore-System (basierend auf der Surface Plasmon Resonance (SPR)-Technik), nutzen verschiedene Techniken Oberflächenmodifizierung, die zum Beispiel verhindern kann Oberflächenverschmutzung, stimmen die Hydrophobie / Hydrophilie der Oberfläche, auf eine Vielzahl von elektronischen Umgebungen anzupassen, und am häufigsten, induzieren Spezifität gegenüber einem Ziel von Interesse. ^5.1 Diese Techniken erweitern die Funktionalität von sonst hoch empfindliche Biosensoren zu realen Anwendungen in komplexen Umgebungen, wie z. wie Blut, Urin, Abwasser und Analyse. ^2,6-7 Während kommerzielle Biosensorik Plattformen wie Biacore, gut verstanden haben, Standard-Techniken zur Durchführung solcher Oberflächenmodifikationen, haben diese Techniken nicht in standardisierter Form wurden auf andere übersetzte Bezeichnung- frei Biosensorik Plattformen wie Whispering Gallery Mode (WGM) optischen Resonatoren. ^9.8 < / P>

WGM optischen Resonatoren stellen eine vielversprechende Technologie für die Durchführung markierungsfreie Detektion einer Vielzahl von Arten, bei extrem niedrigen Konzentrationen ^6,10-12 Die hohe Empfindlichkeit dieser Plattformen ist ein Ergebnis ihrer einzigartigen geometrischen Optik:. WGM optischen Resonatoren beschränken zirkulierenden . Licht an speziellen, Resonanzfrequenzen ¹³ Wie der SPR-Plattformen wird das optische Feld nicht völlig mit der Sensoreinrichtung beschränkt, sondern evanesces; diese "evaneszenten" kann dann mit Arten, die in der Umgebung zu interagieren. Diese Wechselwirkung führt zu dem effektiven Brechungsindex des optischen Feldes zu verändern, was zu einer leichten, aber nachweisbare, der Resonanzfrequenz der Vorrichtung zu verschieben. Da der optische Bereich zirkuliert, kann er viele Male mit der Umwelt interagieren, was zu einer inhärenten Verstärkung des Signals, und eine sehr hohe Empfindlichkeiten zu geringfügigen Änderungen in der Umwelt. ^2,14-15

Zelt "> Zur gezielten Erkennung in komplexen Umgebungen ausführen zu können, müssen diese Plattformen mit einer Sonde Molekül (in der Regel die Hälfte eines Bindepaares, z. B. Antikörper / Antigene) durch Oberflächenmodifizierung. ² gekoppelt werden zwar WGM optischen Resonatoren in mehreren Geometrien hergestellt werden können, von eine Vielzahl von Materialsystemen, ist das Silika Mikrokügelchen die häufigste. Diese Mikrokügelchen werden in der Regel am Ende einer optischen Faser, die einen "Stamm", mit dem die Mikrokügelchen bei der Funktionalisierung und Detektion Versuche gehandhabt werden kann, gibt hergestellt. Silica Oberflächenchemie kann Anwendung an Sondenmoleküle an deren Oberflächen zu befestigen, jedoch sind traditionelle Techniken zur ebenen Substraten erzeugt wurden, oft nicht für diese dreidimensionalen Strukturen ausreichend, da Änderungen an der Oberfläche der Mikrosphären (Staub, Schmutz, Oberflächendefekte und unebene Beschichtungen) kann schwerwiegende negative Folgen für ihre Erkennung Fähigkeiten haben. Hier zeigen wir einen einfachen Ansatzfür die Funktionalisierung der Oberfläche von Siliciumdioxid-Mikrokügelchen WGM optischen Resonatoren mit Silankupplungsmittel, um die anorganischen Oberfläche und die biologische Umwelt zu überbrücken, durch das Anbringen Biotin an die Silica-Oberfläche. ^8,16 Obwohl wir verwenden Kieselsäure Mikrosphäre WGM-Resonatoren als Sensor-System in diesem Bericht, die Protokolle allgemein und kann verwendet werden, um die Oberfläche jedes Siliciumdioxid Vorrichtung mit Biotin zu funktionalisieren.

Protocol

1. Hintergrund

Das Biotin ist an der Oberfläche dieser Geräte durch eine einfache Drei-Schritt-Verfahren (1) befestigt ist. Zuerst reinigen wir die Oberfläche und füllen Sie es mit Hydroxyl-Gruppen, indem die Geräte entweder Sauerstoff-Plasma oder Piranha-Lösung. Zweitens verwenden wir Dampfabscheidung, um das Silan-Kupplungsmittel mit einem primären Amin zu den Hydroxylgruppen durch Hydrolyse und Kondensation Reaktion beendet befestigen. Drittens legen wir Biotin an die Oberfläche über N-Hydroxysuccinimid (NHS)-Ester Chemie. Wir weisen den interessierten Leser zu unserer bisherigen Arbeit für mehr Informationen über die Entwicklung dieser Techniken, sowie eine Erklärung der unsere Motivation für die Wahl dieser Techniken. ⁸

Der Erfolg dieser Reaktionen kann durch optische und Fluoreszenzmikroskopie nach der Zugabe des primären Amins ausgewertet werden, als auch nach der Zugabe des Biotin. Während optische microscopy verwendet werden, um festzustellen, ob die Funktionalisierung der Oberfläche Protokolle in Folge Schäden zur Oberfläche der Mikrokugeln, oder Verunreinigungen, die Fluoreszenz-Mikroskopie verwendet werden, um die Qualität und Gleichmäßigkeit der Flächendeckung des Biotin-Molekül zu überprüfen sowie die Fähigkeit des Biotin auf die Oberfläche mit (Strept) Avidin binden. Um die Abdeckung von Aminen auf der Oberfläche zu beurteilen, verwendeten wir Fluoresceinisothiocyanat (FITC) Fluoreszenz-Farbstoff, die mit primären Aminen reagiert, um stabile, kovalente Thioharnstoffbindung der Mikrosphären zu bilden. Texas Red Fluoreszenzfarbstoff konjugiert an Avidin hat, verwendet wird, um die Biotin-Gruppen auf der Oberfläche durch die Biotin-Avidin-Wechselwirkung kennzeichnen. In beiden Fällen wurden Farbstoffe gewählt, die in Wechselwirkung treten kann (entweder durch Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen oder kovalente Bindung) mit den funktionellen Gruppen auf der Oberfläche.

Hier stellt das Silan-Kupplungsmittel, das drei Abgangsgruppen und eine funktionelle Gruppe hat, die Brücke Wetteschen dem anorganischen und organischen Oberfläche Sondenmolekül. Das primäre Amin-Funktionalität reagiert quantitativ mit NHS-Ester, stabile Amidbindungen zu bilden. In diesem Fall verwenden wir eine Biotin-Sondenmolekül, deren Valeriansäure Seitenkette mit einem NHS-Ester modifiziert sind. Realistisch einem Sondenmolekül, dem ein NHS-Ester-Gruppe kann an der Oberfläche mit den folgenden Protokollen zugesetzt werden. Zusätzlich sind diese Protokolle allgemein und kann mit einer beliebigen Vorrichtung Siliciumdioxid mit Biotin zu funktionalisieren.

Die größte Herausforderung mit diesen Protokollen ist tatsächlich nicht in der Chemie selbst, sondern in der Handhabung der Siliciumdioxid-Mikrokugeln. Bitte beachten Sie, dass überall in den Protokollen, die Mikrokugeln durch grapsing ihre Stiele leicht mit scharfer Spitze Pinzette behandelt werden sollen. Dies hält die Pinzette weit weg von den Mikrosphären selbst, und ermöglicht den einfachen Transport zwischen den Schritten. Viele Schritte im Protokoll unten sind speziell darauf ausgerichtet, diese Tatsache zu adressierenoder.

2. Microsphere Fabrication

1. Erstellen Sie das Speicher-Gehäuse für die Mikrosphären.
   1. Mit einem exacto Messer, schneiden Sie ein ¼ Zoll dicken Karton in eine 1 x 1 in in eckigen; diese Band auf eine normal große Glasplatte und befestigen Sie eine 1 im Schnitt von Tesafilm, mit seinen Enden Treffen zu einer Rolle , auf den Karton.
   2. Dies schafft eine Plattform, auf der die Mikrokügelchen erhöht und kann von der Umgebung isoliert werden, und verhindert eine Beschädigung ihrer Oberfläche.
2. , Mit einer Schere geschnitten ein 3 Zoll Abschnitt der optischen Faser von einer Spule der optischen Faser.
3. Mit einem No-Nik Faser-Stripper, Absetzen des schützenden Polymerbeschichtung aus den letzten 0,5 cm von dem Ende des geschnittenen Stücks der Faser, so dass nur die Siliciumdioxid-Kern. Reinigen Sie die Oberfläche von jedem verbleibenden Polymer mit einem Kimwipe gedämpft mit Methanol durch leichtes Abwischen der Faser mit dem Kimwipe.
4. Mit einer nackten Faser Cleaver, schneiden Sie das abisolierte Ende so thnur zu etwa 1 Millimeter abgezogenen Faser verbleibt auf dem Ende der Faser.
5. Legen Sie das abisolierte Ende der optischen Faser in der Bahn eines CO _2-Laser, wobei darauf geachtet senkrecht ausrichten Faser, so daß die abisolierten Ende nach unten zeigt.
6. Schalten der CO _2-Laser, und weist sie an der Oberfläche des abisolierten Endes der optischen Faser. Der Laser wird das abisolierte Ende der Faser in eine Kugel mit etwa 3,5% Leistung innerhalb von 2 Sekunden zu schmelzen.
7. Mit einer Pinzette, zu erfassen sorgfältig den Schaft (die nicht abisolierten Teil der optischen Faser) der Mikrokügelchen. Befestigen Sie den Vorbau auf das Band rollen auf der Mikrosphäre Gehäuse. Der Objektträger kann sich in einer Petrischale gespeichert werden. Dies ermöglicht eine sichere Lagerung der Mikrosphären.

3. Füllen Sie die Oberfläche mit Hydroxylgruppen

1. Mit Piranha-Lösung:
   1. In einem 60 ml Polypropylen-Röhrchen mit einem Klappdeckel, bereiten Sie einen Piranha-Lösung (70:30 Vol. rauchender H 4: H ₂ O ₂ (30 Gew.%)) durch Zugabe von 5 ml Wasserstoffperoxid in das Fläschchen, gefolgt von 11,6 ml rauchende Schwefelsäure. ACHTUNG: Tragen säurebeständige Handschuhe.
   2. Übertragen Sie die Objektträger aus Glas und hält mindestens 1 Mikrosphäre, in das Fläschchen geben. Die Mikrokügelchen sollten in Kontakt mit der Flüssigkeit ist, aber die Flüssigkeit nicht berühren Karton. Die Lautstärke der Lösung, wenn nötig.
   3. Entfernen Sie vorsichtig die Objektträger aus Glas aus der Flasche, und stecken Sie sie in einem anderen Kunststoff-Fläschchen mit DDI H ₂ O. Lassen Sie die Proben sitzen in der Lösung für 5 Minuten.
   4. Entfernen Sie vorsichtig die Objektträger aus Glas aus der Flasche, und legen Sie sie einem Ofen bei 80 ° C für 10 Minuten die Oberfläche zu trocknen.
2. Mit Sauerstoff-Plasma-Behandlung:
   1. Übertragen der Glasplatte, die mindestens eine Mikrokügelchen zu dem Sauerstoff Plasmakammer.
   2. Stellen Sie den Sauerstoffdruck bis 200 mTorr, und die Leistung bis 120 W. Setzen Sie die Probe auf die Sauerstoff-Plasma für 2 minuten.
   3. Nehmen Sie die Objektträger aus der Plasmakammer.

4. Anbringen Silane Coupling Agents an die Oberfläche

1. Das Glas Folie, mit mindestens einer Mikrokugel, in einem Vakuum-Exsikkator in einem Abzug.
2. Auch in der Abzugshaube, öffnen Sie das Silankupplungsmittel Flasche (in diesem Fall, Aminopropyltrimethoxysilan (APTMS) verwendet wurde), und legen Sie die geöffnete Flasche im Exsikkator.
3. Setzen Sie den Deckel auf dem Vakuumexsikkator, und befestigen Sie den Auslass zu einem Aspirator oder Haus Vakuumleitung.
4. Schalten Sie das Haus oder Vakuum der Wasser-Linie, und evakuieren Vakuumexsikkator. Sobald eine Vakuumdichtung zwischen dem Deckel und der Basis ausgebildet ist, beginnt das Timing der Reaktion. Dies wird das Silan-Kupplungsmittel auf die Oberfläche als dünne Schicht abzuscheiden.
5. Nach 15 Minuten schalten Sie das Vakuum, und langsam den Port öffnen, um Luft in den Exsikkator lassen. Aus diesem Haftvermittler, sind 15 Minuten ausreichend, um eine unifo bildenrm Monoschicht auf der Oberfläche. Für andere Haftmittel, kann die Zeit angepasst werden muss.

5. Anbringen Biotin an die Oberfläche

1. Etwa eine Stunde vor dem Anbringen des Biotin, bereiten eine 10 mM Lösung von N-Hydroxylsuccinimid Biotin (NHS-Biotin) in wasserfreiem Dimethylsulfoxid (DMSO) in einem 60 ml Polypropylen-Röhrchen mit einem aufklappbarem Deckel.
   1. Wenn der NHS-Biotin gespeichert worden ist Kälte, damit sie auf Raumtemperatur Massierung es sich ausgleichen lassen.
   2. Beschallen die Lösung für 1 Stunde, um Auflösung der NHS-Biotin-Pulver in dem Lösungsmittel.
2. Übertragen der Objektträger mit der Mikrokügelchen in einem anderen Kunststoff-Röhrchen, mit den Mikrosphären an der Unterseite, und Stielen von der Oberseite des Fläschchens.
3. Übertragen, mit einem Kunststoff-Pipette, ein geeignetes Volumen des NHS-Biotin-Lösung an der Seite der Ampulle hinter der Glasplatte (so dass die Lösung nicht berührt Mikrokügelchen, wie es zu dem Fläschchen gegeben wird). Eindd genug Lösung zur Oberfläche der Mikrokugeln zu decken.
4. Legen Sie die Fläschchen nun mit den Mikrosphären und NHS-Biotin in DMSO-Lösung auf einem Schaukelstuhl Inkubator (Tilt Tray) für 30 Minuten bei Raumtemperatur, mit der Geschwindigkeit und Neigungswinkel bei 5 Umdrehungen pro Minute und 5 Grad.
5. Entfernen Sie vorsichtig die Objektträger aus Glas aus der Flasche, und ziehen Sie sie vorsichtig in ein anderes Gefäß mit DDI H ₂ O gefüllt Die Küvette auf der Kippschale für weitere 10 Minuten bei der gleichen Geschwindigkeit und Neigungswinkel wie zuvor. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal mit frischem Wasser aus. Dies hilft bei der Entfernung überschüssigen DMSO von der Oberfläche, und entfernt die physikalisch adsorbierten Biotin, die nicht entweder tatsächlich Implantat an der Oberfläche.
6. Nehmen Sie die Objektträger aus Glas aus der Flasche, und legen Sie sie in einem Ofen bei 80 ° C für 10 Minuten, oder bis alle Wassertropfen von der Oberfläche entfernt werden.

6. Fluoreszenzmarkierung von Amin-terminierten Siliciumdioxid

1. Um die vorhandenen Amingruppen nach treatm beschriftenHNO mit APTMS, bereiten Sie das FITC-Lösung in einem abgedunkelten Raum durch Lösen von 1 mg FITC in 1 ml wasserfreiem DMSO.
2. Verdünnen Sie die Lösung in 6,1 durch Zugabe von 50 ul des FITC-Lösung zu 1 ml 0,1 M Natrium-Bicarbonat-Puffer.
3. Legen Sie die Lösung in einem 60 ml Polypropylen-Röhrchen mit einem aufklappbaren Deckel, und schieben Sie die Amin-terminierten Mikrokugeln, wieder auf dem Objektträger aus Glas untergebracht, in das Fläschchen.
4. Stellen Sie die Durchstechflasche in einem Eisbad, und lassen Sie die Probe mit dem FITC-Lösung für ein Minimum von 4 Stunden im Dunkeln reagieren.
5. Überschüssiges Fluorophor durch zwei, 10 Minuten Spülen der Mikrosphären in Natriumcarbonat-Puffer. Nach wie vor füllen einen 60 ml-Polypropylen-Röhrchen mit einem Klappdeckel mit dem Puffer, und schieben Sie die Objektträger in die Lösung und darauf achten, dass die Lösung deckt nur den Mikrokügelchen, und nicht das Gehäuse Karton. Decken Sie das Fläschchen mit Alufolie und legen Sie die Durchstechflasche auf einer Kippschale bei 5 Grad und 5 Umdrehungen pro Minute eingestellt, wie vorher.
6. Entfernen Sie vorsichtig die Objektträger aus Glas aus der Flasche, und ziehen Sie sie vorsichtig in ein anderes Gefäß mit DDI H ₂ O gefüllt und mit Alufolie bedeckt. Die Küvette auf der Kippschale für weitere 10 Minuten bei der gleichen Geschwindigkeit und Neigungswinkel wie zuvor. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal mit frischem Wasser aus. Dies hilft bei der Entfernung von überschüssigem Farbstoff von der Oberfläche.
7. Entfernen Sie vorsichtig die Objektträger aus Glas aus der Flasche, und trocken in einem Ofen bei 80 ° C für 10 Minuten vor Tomografie ermöglichen.

7. Fluoreszenzmarkierung von Biotin-terminierten Siliciumdioxid

1. Bereiten Sie eine 10 pg / ml-Lösung von Texas-Red Avidin in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung.
2. In der Lösung auf eine 60 ml Polypropylen Phiole mit einem Klappdeckel, und schieben die Objektträger mit einem Biotin-terminierten Mikrokügelchen in der Lösung, so daß die Mikrokügelchen nur von der Lösung bedeckt.
3. Reagieren für 30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln.
4. Entfernen Sie überschüssiges Fluorophor durch zwei gründlich 10 Minutens der Mikrosphären in PBS-Puffer.
   1. Nach wie vor füllen einen 60 ml-Polypropylen-Röhrchen mit einem Klappdeckel mit dem Puffer, und schieben Sie die Objektträger in die Lösung und darauf achten, dass die Lösung deckt nur den Mikrokügelchen, und nicht das Gehäuse Karton.
   2. Decken Sie das Fläschchen mit Alufolie und legen Sie die Durchstechflasche auf einer Kippschale bei 5 Grad und 5 Umdrehungen pro Minute eingestellt, wie vorher.
5. Entfernen Sie vorsichtig die Objektträger aus Glas aus der Flasche, und ziehen Sie sie vorsichtig in ein anderes Gefäß mit DDI H ₂ O gefüllt und mit Alufolie bedeckt. Die Küvette auf der Kippschale für weitere 10 Minuten bei der gleichen Geschwindigkeit und Neigungswinkel wie zuvor. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal mit frischem Wasser aus. Dies hilft bei der Entfernung von überschüssigem Farbstoff von der Oberfläche.
6. Entfernen Sie vorsichtig die Objektträger aus Glas aus der Flasche, und trocken in einem Ofen bei 80 ° C für 10 Minuten vor der Bildgebung.

8. Repräsentative Ergebnisse

Korrekt funktionalisiert Mikrosphäres kann durch optische und Fluoreszenzmikroskopie identifiziert werden. Wenn der Funktionalisierung von Oberflächen richtig gemacht wird, sollte es in einer gleichmäßig dichten Abdeckung der Biotin-Moleküle auf der Oberfläche zur Folge haben, und die Oberfläche sollte bleiben Defekt-und Schadstoff-frei nach der Funktionalisierung, um ihre hohe Empfindlichkeiten bei der Detektion Experimente zu erhalten. Optische Mikroskopie kann die letztere zu sondieren, während die Fluoreszenz-Mikroskopie, die Qualität und Einheitlichkeit der Flächendeckung Sonde kann. In Abbildung 2 zeigen wir Beispiele für korrekt funktionalisierten Mikrosphären. Diese Bilder zeigen, dass es keine Beschädigung der Oberfläche Verunreinigung durch Funktionalisierung (2a), und daß die Mikrokugeln eine einheitliche und konsistente Abdeckung entweder Amingruppen (2b) oder Biotin-Gruppen (2c) für auf der Oberfläche .

Wenn die Mikrosphären nicht korrekt funktionalisiert worden, die optische Bilder Mikrosphäre will Oberflächenkontamination, Verklumpung oder ungleichmäßige Deckung, und offensichtliche Mängel in der Oberfläche, wie Oberflächenrisse (Abbildung 3) zeigen. Hier sehen wir ein typisches Beispiel für Oberflächenkontamination, die sich aus Verklumpung von Reagenzien auf der Oberfläche.

1. 3-Schritt Reaktionsschema zur Befestigung Sondenmoleküle auf die Oberfläche des Siliciumdioxid-Mikrokugeln. Hier klicken, um größere Zahl kommen .

2. Silica-Mikrokugeln. a) Lichtmikroskopische Aufnahme von Silica-Mikrokugeln mit Hydroxyl-Gruppen durch Einwirkung von Sauerstoff-Plasma bevölkert; b) Fluoreszenz-Aufnahme von Silica-Mikrokugeln mit primären Aminen besiedelt und markiert mit FITC Farbstoff; c) Fluoreszenz-Aufnahme von Kieselsäure microsphere mit Biotin besiedelt und markiert mit Texas-Rot-Avidin-Konjugat. Nachdruck mit Genehmigung aus Soteropulos, AM CE, Hunt, HK & Armani, Bestimmung von Bindungskinetiken mit Whispering Gallery-Modus Mikrokavitäten. Appl. Phys. Lett. 99, 103.703 bis 103.703 (2011). Copyright 2011, American Institute of Physics. ¹⁷

Abbildung 3. Lichtmikroskopische Aufnahme unsachgemäß funktionalisiert Sphäre. Hier können Sie Staub auf der Oberfläche sehen, oben rechts, sowie Verunreinigungen von der Oberfläche erstreckt. Darüber hinaus zeigt die rechte Seite des optischen Mikrokügelchen einen kleinen Divot auf der Oberfläche.

Discussion

Wie in den Protokollen beschrieben, haben wir eine Plattform, mit dem Gehäuse, um den Silica-Mikrokugeln durch ihre Stämme zu transportieren in der gesamten Prozess-Funktionalisierung. Dieses Gehäuse Plattform wurde als Lösung auf die Oberfläche Verschmutzung und Beschädigung, die aus der Mikrokügelchen in Kontakt mit den Wänden der verschiedenen Behälter während der Funktionalisierung verwendet in Folge erstellt. Wir erkannten die größte Schwierigkeit ergab sich aus ständig Befestigen und Lösen einzelner Mikrosphären in andere Behälter während der Funktionalisierung Prozess. Es war schwer zu vermeiden Bürsten der Mikrokugeln gegen ein Objekt beim Verschieben jeweils einzeln mit einer Pinzette durch das Festhalten an den Stielen. Durch Stabilisieren der Position einer jeden Mikrokugel auf dem Objektträger konnten wir einfach um eine Reihe von Mikrokugeln in und aus verschiedenen Behältern durch Behandeln des Glas-Objektträger, und nicht die der Schaft des Mikrokügelchen. Auf diese Weise konnten wir viele dieser dev funktionalisierenICES zur gleichen Zeit, und wir beseitigt Verschmutzung und Beschädigung der Oberfläche durch unsachgemäße Behandlung verursacht, was zu einem ~ 90% Erfolgsquote bei der Schaffung unbeschädigt, funktionalisierten Mikrosphären.

Wie in den Protokollen erwähnt, untersuchten wir zwei Methoden, mit denen die Siliziumdioxid-Mikrokugeln hydroxylieren. Während Piranha-Lösung wird im Allgemeinen dafür verwendet, kann es sehr zeitaufwändig und erfordert Nasschemie. Bei der Arbeit mit Mikrosphären, stellten wir die Überlegenheit der Hydroxylierung durch Sauerstoff-Plasma-Behandlung. Sauerstoffplasma Behandlung erfordert keinen Kontakt mit flüssigen Lösungen, ohne Trocknung, und keine Handhabung der Siliciumdioxid-Mikrokugeln. Darüber hinaus ist es ein viel schnelleres Verfahren, um die Oberfläche mit Hydroxylgruppen zu füllen. Wir anerkennen jedoch, dass nicht jede Arbeitsgruppe wird den Zugang zu Sauerstoff-Plasma-Geräte haben, und deshalb muss möglicherweise Piranha-Lösung verwenden, um die erforderliche Hydroxylfunktionalität zu bilden. Die Verwendung von entweder in der Bildung von Hydroxylgruppen auf führendie Oberfläche.

Die Verhinderung von Kontamination während der Funktionalisierung von Oberflächen ist ein wichtiges Thema, aber sie kann durch sorgfältige Einhaltung der Protokolle minimiert werden. Die häufigsten Ursachen der Kontamination sind schlechte Handhabung bei der Funktionalisierung, sowie unsachgemäße oder gründliches Waschen der Oberfläche nach jedem der Reaktionsschritte. Dies ist insbesondere der Fall bei der ersten Reaktionsschritt, in dem die Oberfläche mit Hydroxylgruppen aufgefüllt wird. Wenn die Piranha-Lösung für dieses Verfahren gewählt wird, muss darauf geachtet werden gründlich zu entfernen, jede Schwefelsäure von der Oberfläche, und gründlich zu trocknen Mikrokügelchen, die Oberfläche ist nun sehr hydrophil und Wasser aus den Spülungen haftet an der Oberfläche. Wenn Schwefelsäure auf der Oberfläche verbleibt, wird die Mikrokügelchen "klebrig" und Staub aus der Laborumgebung sammelt sich auf der Oberfläche leichter. Darüber hinaus verursachen Wassertropfen auf der Oberfläche der Silan-Haftvermittler im Bereich der wat versammelner Tröpfchen, wodurch ein polymeres Siliciumdioxid Glob, die als Klumpen in den fluoreszierenden Aufnahmen zu entnehmen ist. Wenn die Oberfläche Verklumpung auftritt, verhindert, dass die Mikrokügelchen aus in Detektion Experimenten verwendet, aufgrund der großen Abfall der Empfindlichkeit der Vorrichtung. Typischerweise wird, wenn Sauerstoff-Plasmabehandlung verwendet wird, wird die Oberfläche Verklumpung, sowie Verunreinigungen, minimiert. Allerdings ist nicht jedes Labor hat Zugriff auf dieses Gerät, so mit dem Piranha-Lösung kann eine Notwendigkeit sein.

Schließlich fanden wir es notwendig war, um die NHS-Biotin-Lösung vor beschallen zu nutzen, um sich vollständig auflösen den NHS-Biotin in DMSO. Wenn dieser Schritt übersprungen wurde, würde der Server NHS-Biotin auf die Oberfläche in großen Klumpen über physikalische Adsorption, anstatt kovalente Bindung an der Oberfläche abzuscheiden. Diese großen Klumpen sind extrem schwierig zu während der Waschschritte zu entfernen, sondern kann durch die richtige Streuung während der anfänglichen Auflösung verhindert werden. Eine Stunde ist in der Regel reicht für diesen Zweck;Wenn jedoch diese Verfahren auf andere Sondenmoleküle mit NHS-Ester-Gruppen modifiziert werden verlängert, empfehlen wir die Bewertung der Lösung durch dynamische Lichtstreuung in voller Auflösung zu gewährleisten.

Die Protokolle detailliert hier ein Fortschritt in der Übersetzung von planaren Silica Oberflächenchemie auf dreidimensionale Geräte, bei denen die Qualität der Flächendeckung und der Oberfläche des Geräts sind ebenso wichtig für die endgültige Verwendung der Geräte. Wenn diese Protokolle verwendet werden, zeigte die Mikrokügelchen vollständig funktionalisierte gleichmäßig dichten Abdeckung der Sondenmolekül, ohne Kontamination oder Verklumpen auf der Oberfläche. Diese gleichmäßige Flächendeckung ermöglicht die Aufrechterhaltung eines hohen Empfindlichkeiten, wenn diese Geräte bei der Erfassung Experimenten verwendet werden. Die Verwendung von Silan-Haftvermittlern als Brücke zwischen dem anorganischen Substrat und der biologischen Sondenmolekül ist einfach und unkompliziert und kann verwendet werden, insbesondere mit dem gut verstanden (und sehr c werdenEMEINSAME) NHS-Ester Chemie, um optischen Biosensor Oberflächen mit Sondenmolekülen von verschiedenen Typen zu füllen.