הוספת בדיקות ביולוגיות Biosensors סיליקה אופטי באמצעות סוכני צימוד silane

Summary

Biosensors ממשק עם סביבות מורכבות ביולוגיות ולבצע איתור ממוקד על ידי שילוב של חיישנים רגישים מאוד עם בדיקות ספציפיות ביותר המחוברים חיישן באמצעות שינוי פני השטח. הנה, אנחנו מדגימים functionalization פני השטח של חיישנים אופטיים עם סיליקה ביוטין באמצעות סוכני צימוד silane לגשר על חיישן את הסביבה הביולוגית.

Abstract

על מנת ממשק עם סביבות ביולוגיים, פלטפורמות biosensor, כגון מערכת Biacore הפופולרי (מבוסס על משטח Plasmon תהודה (SPR) טכניקה), לעשות שימוש בטכניקות שונות שינוי פני השטח, זה יכול, למשל, למנוע עכירות פני השטח, לכוון את hydrophobicity / hydrophilicity של פני השטח, להתאים למגוון רחב של סביבות אלקטרוניים, לעתים קרובות ביותר, לגרום הספציפיות לקראת היעד של עניין. ^1-5 טכניקות אלו להרחיב את הפונקציונליות של biosensors אחרת רגישים מאוד של העולם האמיתי יישומים בסביבות מורכבות, כגון כמו דם, שתן, וניתוח שפכים. ^2,6-7 בעוד פלטפורמות biosensing מסחריים, כגון Biacore, יש להבין היטב, טכניקות סטנדרטיות לביצוע שינויים מסוג זה על פני השטח, טכניקות אלה לא תורגמו בצורה סטנדרטית אחרת תווית פלטפורמות biosensing בחינם, כמו לוחשים מצב גלריה (WGM) תהודה אופטי. ^8-9 < / P>

תהודה WGM אופטיים מייצגים טכנולוגיה מבטיחה לביצוע ללא תווית זיהוי של מגוון רחב של מינים ב נמוך במיוחד בריכוזים ^6,10-12 רגישות גבוהה של פלטפורמות אלה הוא תוצאה של אופטיקה גיאומטריות הייחודיות שלהם. WGM תהודה אופטי להגביל במחזור . אור, תדרים מסוימים תהודה אינטגרלי ¹³ כמו פלטפורמות SPR, בתחום האופטי אינו מוגבל לחלוטין למכשיר חיישן, אבל evanesces; זה "זנב חלוף" אז יכול לקיים אינטראקציה עם המין בתוך הסביבה. אינטראקציה זו גורמת מקדם השבירה יעילה של השדה האופטי לשנות, וכתוצאה מכך קל, אבל ניתן לגילוי, שינוי תדר התהודה של ההתקן. כי בתחום האופטי מסתובב, הוא יכול לתקשר עם הסביבה פעמים רבות, וכתוצאה מכך הגברה פנימית של האות, ואת רגישויות גבוהות מאוד לשינויים קלים בסביבה. ^2,14-15

אוהל "> כדי לבצע איתור ממוקד בסביבות מורכבות, פלטפורמות אלה חייבים להיות יחד עם מולקולת בדיקה (בדרך כלל 1 1/2 של זוג מחייב, למשל נוגדנים / אנטיגנים) באמצעות שינוי פני השטח. ² למרות תהודה WGM אופטיים יכול להיות מפוברק הגיאומטריות כמה מן מגוון רחב של מערכות גשמי, microsphere סיליקה היא הנפוצה ביותר. microspheres אלו מיוצרים בדרך כלל על קצה של סיב אופטי, המספק "גזע", שבאמצעותה microspheres ניתן לטפל במהלך הניסויים functionalization זיהוי. משטח chemistries סיליקה רשאי להיות מיושם לצרף מולקולות בדיקה כדי השטח שלהם, עם זאת, טכניקות מסורתיות שנוצר על מצעים מישוריים הם בדרך כלל לא מספיק אלה תלת ממדי מבנים, כמו כל שינוי פני השטח של microspheres (אבק, זיהום, ליקויים פני השטח, ציפוי אחיד) יכולות להיות חמורות, השלכות שליליות על יכולת הגילוי שלהן. הנה, אנחנו מדגימים את הגישה קלילעבור functionalization את פני השטח של microsphere תהודה סיליקה WGM אופטי באמצעות סוכני צימוד silane לגשר על פני אורגניים ואיכות הסביבה הביולוגית, על ידי הצמדת ביוטין אל פני השטח סיליקה. ^8,16 למרות שאנו משתמשים microsphere סיליקה תהודה WGM כמערכת חיישן בדוח זה, הפרוטוקולים הם כלליים וניתן להשתמש functionalize את פני השטח של כל מכשיר עם סיליקה ביוטין.

Protocol

1. רקע

ביוטין מחובר אל פני השטח של מכשירים אלו באמצעות תהליך פשוט בן שלושה שלבים (איור 1). ראשית, עלינו לנקות את משטח לאכלס את זה עם קבוצות הידרוקסיל על ידי חשיפת מכשירים פלזמה או חמצן או פתרון Piranha. שנית, אנו משתמשים שיקוע לצרף סוכן צימוד silane הסתיים עם אמין ראשוני לקבוצות הידרוקסיל באמצעות הידרוליזה עיבוי התגובה. שלישית, אנו מייחסים ביוטין אל פני השטח באמצעות N-hydroxysuccinimide (NHS) כימיה אסתר. אנו מפנים את הקורא מעוניין בעבודה הקודמת שלנו לקבלת מידע נוסף על פיתוח של שיטות אלו, כמו גם הסבר על המוטיבציה שלנו לבחור את הטכניקות הללו. ⁸

ההצלחה של תגובות אלה ניתן להעריך באמצעות מיקרוסקופיה אופטית הקרינה לאחר תוספת של אמין ראשוני, כמו גם לאחר תוספת של ביוטין. בעוד אופטי מ 'icroscopy ניתן להשתמש כדי לקבוע אם functionalization פרוטוקולים פני השטח גרמו נזק לפני השטח microsphere, או אפילו זיהום, מיקרוסקופ פלואורסצנטי משמש כדי לוודא את איכות ואחידות של כיסוי פני השטח של מולקולת ביוטין, כמו גם את היכולת של ביוטין על פני השטח להיקשר עם (strept) avidin. כדי להעריך את הכיסוי של אמינים על פני השטח, היינו isothiocyanate fluorescein (FITC) צבע פלואורסצנטי, אשר מגיב עם אמינים ראשוניים ליצירת קשר יציב, thiourea קוולנטיים כדי microsphere. טקסס צבע אדום ניאון כי כבר מצומדות כדי avidin משמש לתייג קבוצות ביוטין על פני השטח באמצעות אינטראקציה ביוטין, avidin. בשני המקרים, נבחרו צבעים שיכולים לתקשר (בין אם דרך רצפטור ליגנד אינטראקציות או צימוד קוולנטי) עם קבוצות פונקציונליות על פני השטח.

כאן, סוכן צימוד silane, שבו יש שלוש קבוצות קבוצה אחת עוזבת פונקציונלי, מספק בית גשרWeen משטח אורגניים ו מולקולה אורגנית בדיקה. פונקציונליות אמין ראשוני מגיב כמותית עם אסטרים של ביטוח הבריאות הלאומי כדי ליצור קשרים יציבים אמיד. במקרה זה, אנו משתמשים מולקולת ביוטין בדיקה אשר שרשרת הצד ולריו השתנה עם קבוצת שירותי הבריאות אסתר. באופן מעשי, כל מולקולה בדיקה לאיזו קבוצה אסתר שירותי הבריאות ניתן להוסיף על פני השטח תוך שימוש בפרוטוקולים הבאים. בנוסף, הפרוטוקולים האלה הם בכלל, ניתן להשתמש כדי functionalize כל משטח המכשיר עם סיליקה ביוטין.

האתגר העיקרי עם פרוטוקולים אלה לא ממש בכימיה עצמו, אלא בטיפול של סיליקה microspheres. שים לב, לאורך כל הפרוטוקולים, microspheres צריכים להיות מטופלים על ידי grapsing גבעוליהם קלות חדה שקצהו פינצטה. פעולה זו שומרת על פינצטה הרחק microspheres עצמם, ומאפשרת להעברת קל בין השלבים. צעדים רבים פרוטוקול להלן נועדו במיוחד כדי להתמודד עם עובדה זואו.

2. Microsphere ייצור

1. בניית דיור אחסון microspheres.
   1. באמצעות סכין Exacto, לחתוך ¼ בחתיכה עבה של קרטון לתוך 1 ב x 1 בכיכר, קלטת זו לשקופית רגיל בגודל הכוס, ולצרף בסעיף 1 של נייר דבק, עם קצותיו נפגשים כדי ליצור רול , כדי קרטון.
   2. זה יוצר פלטפורמה שעליה microsphere יכול להיות מורם ומבודד מן הסביבה, ומונע נזק פני השטח שלהם.
2. בעזרת מספריים, חותכים בסעיף 3 אינץ של סיבים אופטיים בין סליל של סיבים אופטיים.
3. שימוש חשפנית סיבים אף ניק, להפשיט ציפוי פולימרי הגנה מן 0.5 אינץ' האחרונות של סוף היצירה חתך של סיבים, והשאיר רק את הליבה סיליקה. יש לנקות את פני השטח של פולימר כל שנותר עם Kimwipe לחה עם מתנול ידי בעדינות לנגב עם סיבים Kimwipe.
4. באמצעות סיבים קופיץ חשוף, לקטום אותו חשוף כך הב רק על 1 מילימטר של סיבים הפשיטו נשאר בצד של סיבים.
5. מחברים את הקצה חשוף סיב אופטי לתוך הנתיב של לייזר ₂ CO, מקפיד ליישר אנכית סיבים כך בסוף הפשיטו שלה פונה כלפי מטה.
6. הפעל לייזר ₂ CO, ולכוון אותה אל פני השטח של קצה חשוף של סיב אופטי. לייזר יתמוססו בסוף גנבו לי את הסיב לתחום באמצעות כ 3.5% חשמל ב 2 שניות.
7. באמצעות פינצטה, בזהירות לתפוס את גזע (החלק הלא גנבו לי את סיב אופטי) של microsphere. צרף גזע להריץ את התמונות על דיור microsphere. שקופיות הזכוכית ניתן עצמו מאוחסן בצלחת פטרי. זה מאפשר אחסון בטוח של microsphere.

3. אכלוס שטח עם קבוצות הידרוקסיל

1. באמצעות פתרון Piranha:
   1. בבקבוקון פוליפרופילן 60 מ"ל עם מכסה צירים, להכין פתרון Piranha (70:30 לפי נפח רותח H 4: H ידי הוספת 5 מ"ל של מי חמצן כדי הבקבוקון, ואחריו 11.6 מ"ל של חומצה גופרתית רותחת ₂ O ₂ (30% wt)). זהירות: שחיקה חומצית עמידים כפפות.
   2. העברת שקופיות זכוכית, מחזיק לפחות 1 microsphere, על הבקבוקון. Microsphere צריך להיות במגע עם הנוזל, אבל הנוזל לא אמור לגעת קרטון. להתאים את עוצמת הקול של פתרון במידת הצורך.
   3. הוצא בעדינות את השקף זכוכית מבקבוקון, ולהכניס אותו לתוך בקבוקון פלסטיק ובו אחר DDI H ₂ O. בואו הדגימות לשבת פתרון במשך 5 דקות.
   4. הוצא בעדינות את השקף מבקבוקון זכוכית, ומניחים אותו בתנור על 80 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות כדי לייבש את פני השטח.
2. שימוש פלזמה טיפול חמצן:
   1. העברת שקופיות זכוכית המכיל לפחות microsphere לתאי פלזמה חמצן.
   2. קבע את לחץ החמצן mTorr 200, 120 W. הכוח לחשוף את המדגם כדי פלזמה חמצן 2 מיילnutes.
   3. להסיר את השקופית זכוכית חדר הפלזמה.

4. חיבור סוכני צימוד silane אל פני השטח

1. מניחים את שקף זכוכית, המכיל לפחות microsphere, לתוך תא ייבוש ואקום במנדף.
2. גם מכסה המנוע קטר, פתח את צימוד silane סוכן בקבוק (במקרה זה, aminopropyltrimethoxysilane (APTMS) שימש), ומניחים את הבקבוק נפתח תא ייבוש.
3. החזר את מכסה תא ייבוש ואקום, ולצרף את נמל המוצא כדי aspirator או ואקום קו הבית.
4. הפעל את אבק הבית או את קו המים, לפנות את תא ייבוש ואקום. לאחר חותם ואקום נוצר בין המכסה לבין הבסיס, מתחילים תזמון התגובה. זה יהיה להפקיד סוכן צימוד silane על פני השטח כמו סרט דק.
5. אחרי 15 דקות, לכבות את החלל, ולאט לאט לפתוח את הנמל לתת אוויר לתוך תא ייבוש. לסוכן זה צימוד, 15 דקות מספיקה כדי ליצור unifomonolayer RM על פני השטח. עבור סוכני צימוד אחרים, הפעם ייתכן שיהיה צורך להתאים.

5. הוספת ביוטין אל פני השטח

1. כשעה לפני הצמדת ביוטין, להכין פתרון 10 מ"מ N-hydroxylsuccinimide ביוטין (NHS-ביוטין) ב dimethylsulfoxide נטול מים (DMSO) בבקבוקון פוליפרופילן 60 מ"ל עם מכסה צירים.
   1. אם שירותי הבריאות, ביוטין אוחסן קר, לאפשר לו לאזן לטמפרטורת החדר לפני ריכוז זה.
   2. Sonicate פתרון לשעה 1 באופן מלא לפזר אבקת NHS-ביוטין ב ממס.
2. העברת שקופיות זכוכית המכיל microsphere לתוך בקבוקון פלסטיק אחר, עם microspheres בתחתית, והוא נובע בחלקו העליון של הבקבוקון.
3. העברה, באמצעות pipet פלסטיק, נפח מתאים של פתרון NHS-ביוטין למטה בצד של הבקבוקון, מאחורי שקופיות זכוכית (לכן הפתרון אינו נוגע microsphere כפי שהוא להתווסף בקבוקון).dd פתרון מספיק כדי לכסות את פני השטח microsphere.
4. מניחים את בקבוקונים המכילים עכשיו microspheres ו-NHS ביוטין בפתרון DMSO על החממה נדנדה (מגש הטיה) במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, עם מהירות וזווית ההטיה ב 5 סל"ד ו - 5 מעלות, בהתאמה.
5. הוצא בעדינות את השקף מבקבוקון זכוכית, בעדינות להחליק אותו לתוך בקבוקון נוסף מלא DDI H ₂ O. מניחים את הצנצנת על מגש להטות עוד 10 דקות באותה מהירות וזווית ההטיה כמו קודם. חזור על פעולה זו פעמיים עם מים טריים בכל פעם. זה עוזר להסיר DMSO עודף מפני השטח, ומסיר כל ביוטין פיזית-ספוחים לסחף נחלי כי לא שתל דווקא אל פני השטח.
6. להסיר את השקופית זכוכית מבקבוקון, ומניחים אותו בתנור על 80 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות, או עד שכל טיפות מים יוסרו מן השטח.

6. תיוג פלורסנט של סיליקה אמין, הסתיים

1. כדי לתייג קבוצות האמין הנוכחי לאחר treatmאף אוזן גרון עם APTMS, להכין את הפתרון FITC בחדר חשוך על ידי המסת 1 מ"ג FITC ב 1 מ"ל נטול מים DMSO.
2. לדלל את הפתרון ב 6.1 על ידי הוספת 50 μL של פתרון FITC ל 1 מ"ל של 0.1 חיץ ביקרבונט M נתרן.
3. מניחים את הפתרון בבקבוקון פוליפרופילן 60 מ"ל עם מכסה צירים, ואת החלק בעדינות את אמין, הסתיים microspheres, שכן שוב בשקופית זכוכית, לתוך בקבוקון.
4. מניחים את הבקבוקון באמבט קרח, ולתת דגימת להגיב עם פתרון FITC עבור מינימום של 4 שעות בחושך.
5. הסר fluorophore עודף באמצעות שני, 10 שטיפות זעירות של microspheres ב חיץ סודיום קרבונט. כמו בעבר, למלא הבקבוקון פוליפרופילן 60 מ"ל עם מכסה צירים עם חיץ, ואת החלק בעדינות את שקופיות זכוכית לתוך פתרון, טיפול שהפתרון מכסה רק את microsphere, ולא הדיור קרטון. מכסים את הצנצנת בנייר אלומיניום, ומניחים את הבקבוקון על מגש להטות נקבע על 5 מעלות ו -5 סל"ד, כמו קודם.
6. הוצא בעדינות את השקף מבקבוקון זכוכית, בעדינות להחליק אותו לתוך בקבוקון נוסף מלא DDI H ₂ O, מכוסה בנייר אלומיניום. מניחים את הצנצנת על מגש להטות עוד 10 דקות באותה מהירות וזווית ההטיה כמו קודם. חזור על פעולה זו פעמיים עם מים טריים בכל פעם. זה עוזר להסיר את עודפי הצבע מהמשטח.
7. הוצא בעדינות את השקף זכוכית מבקבוקון, ויבש בתנור בחום של C 80 למשך 10 דקות לפני הדמיה.

7. תיוג פלורסנט של סיליקה ביוטין, הסתיים

1. הכן פתרון 10 מיקרוגרם / מ"ל ​​של avidin טקסס האדום פוספט שנאגרו מלוחים.
2. הוסף הפתרון בקבוקון פוליפרופילן 60 מ"ל עם מכסה צירים, ואת החלק בעדינות את שקופית זכוכית המכיל microsphere ביוטין, הסתיים תוך פתרון, כך microsphere מכוסה רק על ידי פתרון.
3. להגיב במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
4. הסר fluorophore עודף באמצעות 2, 10 דקות ולשטוףים של microspheres ב PBS המאגר.
   1. כמו בעבר, למלא הבקבוקון פוליפרופילן 60 מ"ל עם מכסה צירים עם חיץ, ואת החלק בעדינות את שקופיות זכוכית לתוך פתרון, טיפול שהפתרון מכסה רק את microsphere, ולא הדיור קרטון.
   2. מכסים את הצנצנת בנייר אלומיניום, ומניחים את הבקבוקון על מגש להטות נקבע על 5 מעלות ו -5 סל"ד, כמו קודם.
5. הוצא בעדינות את השקף מבקבוקון זכוכית, בעדינות להחליק אותו לתוך בקבוקון נוסף מלא DDI H ₂ O, מכוסה בנייר אלומיניום. מניחים את הצנצנת על מגש להטות עוד 10 דקות באותה מהירות וזווית ההטיה כמו קודם. חזור על פעולה זו פעמיים עם מים טריים בכל פעם. זה עוזר להסיר את עודפי הצבע מהמשטח.
6. הוצא בעדינות את השקף זכוכית מבקבוקון, ויבש בתנור בחום של 80 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות לפני הדמיה.

8. נציג תוצאות

פונקציונליות נכונה microsphereזה יכול להיות מזוהה באמצעות מיקרוסקופ אופטי פלואורסצנטי. אם functionalization פני השטח נעשה בצורה נכונה, הוא צריך לגרום כיסוי צפוף אחיד של מולקולות ביוטין על פני השטח, ועל פני השטח צריך להישאר פגם ו המזהם ללא אחרי functionalization על מנת לשמור על רגישויות גבוהות שלהם במהלך הניסויים זיהוי. במיקרוסקופ אופטי ניתן להשתמש כדי לחקור את זו האחרונה, בעוד מיקרוסקופ פלואורסצנטי יכול לבחון את איכות ואחידות של כיסוי פני השטח. באיור 2, אנו מציגים דוגמאות של microspheres פונקציונליות נכונה. תמונות אלה עולה כי אין נזק או זיהום פני השטח בשל functionalization (איור 2 א), וכי microspheres להראות כיסוי אחיד, עקבי בין אם קבוצות האמין (איור 2 ב) או קבוצות ביוטין (איור 2 ג) על פני השטח .

אם microspheres שלא היה נכון, פונקציונליות microsphere אופטית תמונות של Wiיהיה להציג זיהום פני השטח, כיסוי clumping או לא אחידה, ועל ליקויים ברורים על פני השטח, כמו סדקים על פני השטח (איור 3). כאן, אנו רואים דוגמה נפוצה של זיהום פני השטח, כתוצאה clumping של חומרים כימיים על פני השטח.

באיור 1. 3 שלבים ערכת התגובה לחיבור מולקולות בדיקה לפני השטח של סיליקה microspheres. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה .

איור 2. סיליקה microspheres. מיקרוסקופ) אופטי של microsphere סיליקה מאוכלס קבוצות הידרוקסיל באמצעות חשיפה פלזמה חמצן, ב) מיקרוסקופ פלואורסצנטי microsphere סיליקה מאוכלס אמינים ראשוניים תווית עם FITC צבע, ג) מיקרוסקופ פלורסנט של סיליקה מיילcrosphere מאוכלס ביוטין ומסומן עם הצמוד טקסס אדום avidin. הודפס מחדש באישור Soteropulos, CE, האנט, HK & ארמני, AM קביעת קינטיקה מחייב שימוש לוחשים מצב microcavities הגלריה. Appl. Phys. לט. 99, 103,703-103,703 (2011). כל הזכויות שמורות 2011, במכון האמריקני לפיזיקה. ¹⁷

איור 3. מיקרוסקופ אופטי של כדור פונקציונליות כראוי. הנה, אתה יכול לראות את האבק על פני השטח את הפינה הימנית העליונה, כמו גם זיהום הארכת מעל פני השטח. בנוסף, הצד הימני של microsphere אופטי מראה divot קטן על פני השטח.

Discussion

כפי שמתואר בפרוטוקולים, יצרנו פלטפורמה הדיור שבו להעביר סיליקה microspheres מרגליהן לאורך כל תהליך functionalization. פלטפורמה זו הדיור נוצר כפתרון זיהום פני השטח ואת הנזק כתוצאה microsphere לבוא במגע עם קירות מכולות שונים המשמשים בתהליך functionalization. הבנו את הקושי העיקרי נבע מן הזמן מצרף ועל ניתוק microspheres האדם מכלים שונים במהלך תהליך functionalization. קשה היה להימנע צחצוח microsphere נגד אובייקט בעת מעבר בנפרד עם פינצטה על ידי לחיצה על הגבעולים. על ידי ייצוב מעמדה של microsphere כל שקופית זכוכית, היינו יכולים פשוט לעבור מספר microspheres פנימה והחוצה של מכולות שונות על ידי טיפול שקופיות זכוכית, ולא גזע של microsphere. בדרך זו, הצלחנו functionalize רבים dev אלהגלידה באותו זמן, ואנחנו לחסל זיהום ונזק נגרם על ידי משטח טיפול לא נכון, וכתוצאה מכך שיעור ההצלחה ~ 90% של יצירת ניזוק, microspheres פונקציונליות.

כאמור פרוטוקולים, אנחנו בחנו שתי שיטות שבו כדי hydroxylate סיליקה microspheres. בעוד הפתרון Piranha משמש בדרך כלל זה, זה יכול להימשך זמן רב, ודורש כימיה רטובה. כאשר עובדים עם microspheres, שציינו את עליונות hydroxylation דרך הטיפול פלזמה חמצן. פלזמה טיפול בחמצן דורש שום מגע עם פתרונות נזילים, לא מייבש, וללא טיפול של סיליקה microspheres. בנוסף, הוא תהליך הרבה יותר מהר כדי לאכלס את השטח עם קבוצות הידרוקסיל. עם זאת, אנו מודעים לכך שלא כל קבוצת המחקר תהיה גישה לציוד פלזמה חמצן, ולכן ייתכן שיהיה עליך להשתמש בפתרון Piranha כדי ליצור את הפונקציונליות הנדרשת הידרוקסיל. שימוש או תגרום להיווצרות של קבוצות הידרוקסיל עלאת פני השטח.

מניעת זיהום במהלך functionalization פני השטח היא בעיה רצינית, אך ניתן למזער על ידי היצמדות קפדנית את הפרוטוקולים. קרוב לוודאי הגורמים של זיהום מטפלים העניים במהלך functionalization, כמו גם שטיפת לא תקין או לא יסודית של פני השטח לאחר כל הצעדים התגובה. הדבר נכון במיוחד במקרה במהלך שלב התגובה הראשונה, שם את פני השטח מאוכלס עם קבוצות הידרוקסיל. אם הפתרון Piranha נבחר בשיטה זו, יש להקפיד באופן יסודי על מנת להסיר כל חומצה גופרתית מפני השטח, כדי לייבש היטב microsphere, כמשטח עכשיו הידרופילי מאוד, מים שטיפות את נצמדת אל פני השטח. אם חומצה גופרתית נשאר על פני השטח, microsphere הופך להיות "דביק" ואבק מהסביבה המעבדה אוספת על פני השטח ביתר קלות. בנוסף, טיפות מים על פני השטח גורמים סוכן צימוד silane להתאסף באזור וואטטיפות אה, יוצרים גוש סיליקה פולימריות, אשר נתפס בצעדים כבדים של micrographs ניאון. אם clumping השטח מתרחשת, היא מונעת microsphere עקב שימוש ניסויים זיהוי, בשל ירידה חדה של הרגישות של המכשיר. בדרך כלל, כאשר פלזמה טיפול חמצן משמש, clumping פני השטח, כמו גם זיהום, הוא ממוזער. עם זאת, לא בכל מעבדה יש ​​גישה לציוד זה, זאת באמצעות פתרון Piranha יכול להיות הכרח.

לבסוף, מצאנו היה צורך sonicate פתרון NHS-ביוטין לפני השימוש כדי לפזר באופן מלא שירותי הבריאות, ביוטין ב DMSO. כאשר שלב זה היה פסח, שירותי הבריאות, ביוטין היה להפקיד על משטח בגושים גדולים באמצעות ספיחה פיזית, ולא מחייב קוולנטית אל פני השטח. אלה גושים גדולים קשה מאוד להסיר במהלך השלבים כביסה, אך ניתן למנוע על ידי פיזור נאות במהלך פירוק ראשוני. שעה אחת מספיקה בדרך כלל למטרה זו;עם זאת, אם הליכים אלה מורחבות מולקולות בדיקה שונה עם קבוצות אחרות של ביטוח הבריאות הלאומי אסתר, מומלץ להעריך את הפתרון באמצעות פיזור אור דינאמי על מנת להבטיח פיזור מלא.

הפרוטוקולים המפורטים כאן מייצגים צעד קדימה בתרגום של פני השטח מישוריים chemistries סיליקה תלת ממדי, שבו מכשירים את איכות כיסוי פני השטח משטח המכשיר הם חשובים באותה מידה לשימוש הסופי של המכשירים. כאשר הפרוטוקולים הללו משמשים, הראה microspheres פונקציונליות מלאה כיסוי צפוף אחיד של מולקולת בדיקה, עם זיהום או לא בצעדים כבדים על פני השטח. זה כיסוי משטח אחיד מאפשרת תחזוקה של רגישויות גבוהות כאשר התקנים אלה משמשים בניסויים זיהוי. השימוש סוכני צימוד silane כגשר בין המצע לבין מולקולה אורגנית בדיקה ביולוגית הוא פשוט וברור, והוא יכול לשמש, במיוחד הבין היטב (ומאוד גommon) NHS אסתר כימיה, כדי לאכלס משטחים biosensor אופטיים עם מולקולות בדיקה של סוגים שונים.