Summary
Um sistema de cultura rotativa célula que permite que as células epiteliais de crescer sob condições fisiológicas, resultando em 3-D formação de agregados celulares é descrito. Os agregados gerado visor
Abstract
Células e tecidos nas condições corporais experiência ambientais que influenciam sua arquitetura, comunicação intercelular e funções gerais. Para nos modelos de cultura in vitro de células com precisão imitar o tecido de interesse, o ambiente de crescimento da cultura é um aspecto crítico a considerar. Comumente utilizados sistemas de cultura de células convencionais propagar células epiteliais em planos bidimensionais (2-D) superfícies impermeáveis. Embora muito tenha sido aprendido a partir de sistemas de cultivo convencional de células, muitos achados não são reprodutíveis em ensaios clínicos humanos ou explantes de tecido, potencialmente como um resultado da falta de um microambiente fisiologicamente relevante.
Aqui, nós descrevemos um sistema de cultura que ultrapassa muitas das fronteiras de cultura de condição de 2-D culturas de células, usando o inovador rotativa parede do vaso (RWV) tecnologia bioreactor. Nós e outros mostraram que organotípicas RWV derivados modelos podem recapitular estruturaçãofunção e, autênticos e respostas humanas a estímulos externos de forma semelhante aos tecidos humanos explante 1-6. O bioreactor RWV é um sistema de cultura em suspensão que permite o crescimento de células epiteliais sob baixas condições de cisalhamento de fluidos fisiológicos. Os biorreactores vêm em dois formatos diferentes, uma alta aspecto recipiente rotativo (HARV) ou de um navio lento-girando lateral (STLV), em que diferem pela sua fonte de arejamento. As células epiteliais são adicionados ao bioreactor de escolha em combinação com colagénio grânulos porosos, revestidos microcarregador (Figura 1A). As células utilizam os talões como um crescimento andaime durante a queda livre constante no bioreactor (Figura 1B). O microambiente fornecido pelo bioreactor permite que as células para formar agregados tridimensionais (3-D) exibem in vivo características semelhantes muitas vezes não observada sob a norma 2-D condições de cultura (Figura 1D). Estas características incluem junções, MUCnos de produção, apical / basal orientação, in vivo de localização de proteínas, e adicionais epiteliais célula do tipo de propriedades específicas.
A progressão de uma monocamada de células epiteliais para um totalmente diferenciados agregado 3-D varia dependendo do tipo de célula 1, 7-13. Amostragem periódica do bioreactor permite a monitorização da formação de agregado epitelial, marcadores de diferenciação celular e viabilidade (Figura 1D). Uma vez que a diferenciação celular e formação de agregados é estabelecida, as células são colhidas a partir do biorreactor, e ensaios semelhantes realizadas em 2-D células pode ser aplicado aos agregados 3-D com algumas considerações (Figura 1E-G). Neste trabalho, nós descrevemos passos detalhados de como a cultura em 3-D agregados de células epiteliais no sistema de bioreactor de RWV e uma variedade de ensaios e análises potenciais que podem ser executados com os agregados 3-D. Estas análises incluem, mas não estão limitados a, estruturais / manálise orphological (confocal, varredura e microscopia eletrônica de transmissão), citocina / quimiocina secreção e sinalização celular por citometria de talão (matriz e análise de Western blot), análise de expressão gênica (PCR em tempo real), toxicológicas / droga análise e agentes patogénicos. A utilização destes ensaios definir as bases para estudos mais aprofundados e expansivo como metabolômica, transcriptômica, proteômica e outras baseadas em arrays aplicações. Nosso objetivo é apresentar meios não-convencionais de cultivo de células epiteliais humanas para produzir organotípicas modelos 3-D que recapitulam o ser humano no tecido vivo, em um sistema fácil e robusto para ser utilizado por pesquisadores com diferentes interesses científicos.
Protocol
Todas as etapas devem ser executadas sob condições BSL-2 em uma capela de fluxo laminar.
1. Preparando o biorreator STLV
- Montar o bioreactor STLV de acordo com o protocolo do fabricante e realizar protocolo de desintoxicação para assegurar a esterilidade do bioreactor. Cobrir as portas abertas com tampas luer e encher o STLV com etanol a 95% durante 24 h.
- Remover o etanol e encher o STLV com água destilada esterilizada durante 24 h.
- Repita o passo 1.2 com água destilada esterilizada só.
- Com a ferramenta fornecida pelo fornecedor, solte todos os parafusos, cápsulas e tampão central a partir da STLV, e autoclave a 110 ° C durante 20 min numa bolsa de esterilização.
- Uma vez que o STLV é resfriado, aperte os parafusos e repita os passos de 1,1-1,4 para garantir a esterilidade e desintoxicação completa.
- Aperte os parafusos de arrefecido o STLV e parafuso na pré-esterilizados one-way torneiras para cada porta.
- Torneira aberta através do posicionamento dos botões verticalmente.
- Remover os êmbolos a partir de uma de 10 mL e 5 mL de seringa Luer-Lock e re-luva êmbolos de volta em invólucros para manter a esterilidade. Parafuso seringas em torneiras (seringas luer-lock de ponta são necessários para esta etapa).
- Adicionar Dulbecco tamponada com fosfato salino (DPBS) para a seringa de 10 mL até que o STLV está cheio e começa a encher a seringa de 5 ml.
- Substitua os êmbolos estéreis em cada seringa e remover as bolhas residuais que ocorrem no biorreator, alternando entre a condução êmbolos das seringas.
- Deixar as seringas ligados a bioreactor após a remoção de todas as bolhas. Fechar torneiras e anexar o STLV para a plataforma rotativa vertical e girar para um mínimo de 24 h para monitorar vazamentos.
2. Preparando Beads microcarregador
- Adicionar 15 mL de DPBS ~ 250 mg grânulos microcarregador Cytodex em um tubo cónico de 50 ml e autoclave sob condições idênticas às da STLV (1,4).
- Após arrefecimento, remove DPBS, adicionar meios utilizados para crescer epitheliai célula de interesse, e tubo de turbulência para ressuspender as esferas.
- Repita os passos de lavagem com a mídia duas vezes mais. Após a lavagem final adicionar 15 mL de meio de crescimento grânulos.
3. Semeando Células Epiteliais e Contas para o biorreator STLV
- Cultivar células epiteliais de interesse como monocamadas em frascos de cultura de tecidos até obter igual ou superior a 1x10 7 células. Remover as células do frasco (trypinsization isto é, EDTA), contagem de células para estabelecer concentração celular, e determinar a viabilidade celular por exclusão com azul de tripano coloração 1.
- Para o tubo cónico contendo contas preparadas (ver 2.3), adicionar concentração desejada de células (2x10 5-1x10 7 células epiteliais) 2, 8, dependendo do tipo de célula epitelial de intenção (Figura 1A). Assegurar que todas as células são transferidas por lavagem do tubo cónico.
- Remover DPBS e seringas da STLV.
- Retire a ficha da porta de centro e adicione o c epitelialell / suspensão de esferas na STLV utilizando 10 mL de pipeta serológica. Lavar tubo cónico para assegurar que todas as células / contas de vidro são transferidos para o STLV e substituir centro tampão da ligação.
- Remover êmbolos a partir de um 5 e 10 seringas mL e re-luva êmbolos de volta em invólucros para manter a esterilidade. Parafuso seringas em portos com torneiras abertas. Preencha o STLV com a mídia, substituir êmbolos e torneiras próximas.
- Coloque a STLV recém semeadas em um incubador a 37 ° C durante 30 min sem rotação.
- Torneiras abertas, remova as bolhas usando êmbolos, em seguida, torneiras próximas.
- Coloque a STLV em um 37 ° C, 5% de CO 2 humidificada incubadora rotativo a 20 rpm (Figura 1B). As culturas devem ser rodado continuamente ha 24 dias, excepto quando de amostragem, alteração de mídia, ou agregados de colheita (ver próxima seção).
4. Cultura, Amostragem, Documentação Foto e das Culturas
- Depois de um h 96-120 inicial de cultura de células no bioreactor, meios de comunicação de mudança de STLV a inclinação e permitindo que as células / contas para resolver. Remover seringas, abra ambas as torneiras, e despeje ~ 75% dos meios de comunicação de bombordo (Figura 1C). Baseado no metabolismo celular dos meios de comunicação, troca de mídia todos os dias ou a cada dois dias após a semeadura inicial e 96-120 período cultura h.
- Parafuso de 5 e 10 mL de vazio seringas êmbolos e seguir o protocolo realimentação, como descrito acima (1,7-1,11), então o parafuso fechada a parte de trás STLV no lugar em rotação da plataforma.
- Monitorar o crescimento e viabilidade de agregados a cada 5-7 dias após a sementeira no STLV pela remoção cuidadosa de uma pequena quantidade de agregados (~ uL 200) a partir do centro da porta em dois tubos de 1,5 ml. Para evitar cisalhamento agregado, para todas as transferências de agregação utilizar uma ponta de pipeta 1000 uL que tenha sido cortado ~ 2 centímetros a partir do ponto e esterilizado.
- Substituir o tampão central, permuta com seringas novas, adicionar meios frescos para o STLV como descrito acima (1,7-1,11), e colocar a parte traseira STLV noincubadora com rotação (ver 3.8).
- Para monitorizar a viabilidade celular, utilizar uma das duas 1,5 mL agregados tubo alíquotas no passo 4.3, e remover as células a partir de grânulos da mesma maneira as células epiteliais são removidos a partir de frascos de cultura de tecidos (ou seja, tripsinização). Monitorar viabilidade por coloração azul tripan exclusão 1.
- Para os agregados celulares de imagem, adicionar 0,5-1 mL de mídia para o segundo alíquota mL 1,5 agregar e transferir para uma placa de Petri pequena usando um corte de 1000 ponteira uL. Agregados imagem usando um microscópio de luz invertida (Figura 1D).
5. Transferência e colheita Agregados
- Para alguns modelos de células epiteliais é necessário transferir os agregados de uma HARV descartável para aumentar a aeração cultura 2. Aproximadamente uma semana antes da colheita para análise de agregados, remova seringas e torneiras da STLV e despeje ~ 50% dos meios de comunicação de porta lateral.
- Remove conecte o STLV do centro e despeje cuidadosamente todo o conteúdo em um tubo cônico de 50 mL de orifício central (Figura 1E). Lavar as BTN duas vezes com 5 ml de meio e combinar lavar com o resto dos agregados.
- Continuar com a transferência dos agregados, como descrito em 5.2, mas agregados de transferência a partir do tubo de 50 mL cónica para o HARV.
- Agregados cuidadosamente colheita a partir do HARV após ~ semana 1 ou a partir do STLV (com base no tipo de célula) como foi realizada acima (5,2). Veja abaixo para formatos de ensaio potenciais, ensaios e análises após a colheita agregado.
6. Análise de potencial, Aplicações e ensaios realizados com agregados
- Agregados de sementeira para vários formatos experimentais. Transferir a quantidade desejada de agregados a partir do tubo cónico de 50 ml para um tubo de 1,5 ml, 24 chapa bem, ou placa de 96 poços utilizando um cut-off esterilizado 1000 ponta de pipeta uL (Figura 1F).
- Lavagem e preparação agregados para análise. Remova a mídia depois de ter resolvido agregados. Dispensar DPBS diretamente para o centro do tubo ou bem, para todos os agregados são despertou. Uma vez que os agregados se instalaram para baixo, remover DPBS e repita quantas vezes forem necessárias.
- Agregados de transporte para fora do local de experimentação e análise. Adicionar a quantidade desejada de agregados para um tubo de 50 mL e lavar os agregados como em 6,2. Encher completamente 50 mL do tubo com a mídia, boné, e parafilme em volta da tampa para evitar vazamentos. Firmemente enviar agregados para o local desejado durante a noite à temperatura ambiente.
- Agregados de fixação para microscopia electrónica (Figura 2). Scanning transmissão, ou imuno-microscopia electrónica pode ser conduzida através da transferência de 150-300 uL agregados para um tubo de 1,5 ml e lavagem agregados 3 vezes com DPBS (6,2). Adicionar 200 mL de aplicação específica fixadora de microscopia de varredura (MEV, MET, imuno-EM, etc) de elétrons para o período de incubação desejado. Remover fixar, lavar Aggregates 2 vezes com DPBS, e proceder conforme descrito no Hjelm et al. de 2010, para varredura e microscopia eletrônica de transmissão 2.
- Imagens de microscopia de imunofluorescência (Figura 3). Transferência ~ 100 ul e agregados de um tubo de 1,5 ml e agregados de lavagem (6.2). Corrigir e agregados de etiquetas com títulos de anticorpos em condições semelhantes às com monocamadas, exceto em um tubo de 1,5 mL. Para montar, coloque 1 gota de meios de montagem em lâmina de microscópio, transferir agregados marcados em cima do meio de montagem com um corte de ponta da pipeta 1000 uL, lamela lugar mais agregados, selo lamela com unha polonês, e slide seca durante a noite 2.
- Medindo a viabilidade celular / proliferação utilizando ensaios de MTT (Figura 4). Agregados de transferência para uma placa de 24 poços e substituir meios de comunicação com 625 uL vermelho de fenol meios livres. Adicionar 62,5 uL de 5 mg / mL tiazolilo azul de tetrazólio (MTT) a cada poço e incubar durante 4 horas a 37 ° C. Adicionar 625 uL de 100 mg / mL de SDS-,01M HCl a cada poço e incubar durante a noite. Leia a absorvância a 570 nm e obter% de viabilidade celular utilizando a equação:
- Os estudos toxicológicos. Transfira a 24 agregados placa bem e realizar a exclusão de tripan azul no ≥ 2 poços para a viabilidade celular inicial / concentração. Adicionar composto de teste a concentrações variando a poços duplicados. Para a viabilidade das células (Figura 5A), lavar agregados e realizar exclusão de azul de tripano após o tratamento. Para TC 50 (Figura 5B), tomar a viabilidade celular de poços duplicados para cada concentração ao longo do tempo e usar Reed método Muench para determinar a concentração tóxica de 50% 2, 15.
- Matriz do grânulo citometria (CBA) ou ELISA. Sobrenadantes celulares podem ser tomadas após sementeira de células em qualquer formato experimental diagramado. Estimular agregados semeados como com as células cultivadas comomonocamadas, recolher os sobrenadantes (≥ uL 120), e armazenar a -80 ° C para análise por ELISA ou CBA (Figura 6).
- RNA análise. Transferência ≥ uL 500 de agregados para 1,5 mL tubo e agregados de lavagem com DPBS. Continuar extracção utilizando Qiagen kit RNAeasy e protocolo para células animais com homogeneização de lisado usando 20-agulha de calibre. Assegure-se para deixar grânulos se depositam no fundo do tubo, antes de transferir o sobrenadante, e não transferem pérolas vazias para a coluna de spin (esferas vão entupir membrana coluna resultante com um rendimento de RNA baixo) (Figura 7).
- Análise de proteínas. Agregados Colheita sob os mesmos métodos que com monocamadas usando um tubo de 1,5 ml ou maior formato experimental. No entanto, após a lise dos agregados, permitir que os grânulos para resolver e transferir lisado para um tubo separado antes da execução de um gel de proteína ou outra forma de análise de proteína (Figura 8).
- Infecçãoestudos. agregados de semente em formato desejado experimental. Utilizar pelo menos dois poços / amostras para trypsinizing células a partir de grânulos para enumerar número de células e quantificar a viabilidade celular. Infect agregados com agente patogénico de interesse a multiplicidade de infecção seleccionada como realizado com células cultivadas em monocamadas (Figura 9). As etapas de lavagem deve ser executada como em 6.2.
- Citometria de fluxo: agregados de Sementes em 50 mL de tubo, os agregados de lavagem (6.2), e adicionar EDTA 2 mM durante 5-10 min a 37 ° C. Adicionar meios 5-10 mL de células e as células passam através de um filtro de célula. Alíquotas 1x10 6 células para um tubo de polipropileno e as células de lavagem em solução de bloqueio frio (1% de FBS em PBS). Ressuspender as células com o anticorpo e incubar acordo com o fabricante. Lave as células por centrifugação, resuspender em PBS e as células de transferência para filtrar tubo para análise (Figura 10).
7. Os resultados representativos
Um exemplo deum agregado humano diferenciada epitelial crescido no sistema de bioreactor de STLV pode ser visto na Figura 2. As imagens de MEV e MET são coletados a partir de células vaginais cultivadas no STLV por 39 dias, onde micropregas e invaginações, vesículas secretoras intracelulares, e microvilosidades na superfície apical podem ser observados. Demonstração adicional da in vivo semelhantes características de células epiteliais cultivadas no bioreactor pode ser observada por confocal imagens de microscopia de imunofluorescência (Figura 3) de 3-D células que expressam vaginais mucina (MUC1) e marcadores específicos para células epiteliais (ESA) e diferenciação terminal (involucrina; INV).
Como mostrado, 3-D agregados exibir características ultra-estruturais semelhantes aos tecidos, no entanto os seus fenótipos mais fisiologicamente relevantes também servir como um excelente plataforma para avaliar a toxicidade de compostos. O ensaio de MTT, um ensaio comumente utilizado para medir a viabilidade das células, metabolismo ou proliferaçãoção, pode ser usado para medir a toxicidade para os vários produtos químicos e os compostos (Figura 4). Triton X-100, um detergente que destrói as membranas celulares, foi utilizado como um controlo positivo para validar o ensaio MTT. Um método adicional para medir a toxicidade após o tratamento com compostos de teste é de exclusão de azul de tripano (Figura 5). Após o tratamento com o nonoxinol-9 (N-9), os agregados vaginais demonstraram uma resposta toxicidade similar ao de modelos de explante cervicais, mas sim um perfil diferente em comparação com monocamadas 2, 16.
Estudos adicionais que demonstram a capacidade das células epiteliais, cultivada no bioreactor, para funcionar de forma semelhante e sinalizar a tecidos in vivo, pode ser observado na Figura 6. Após a estimulação com moléculas derivadas de micróbios que são reconhecidos pelos receptores Toll-like (TLR), os agregados responder e secretar citocinas pró-inflamatórias, incluindo IL-6 1.Expressão do receptor de progesterona (PR), um receptor que responde à estimulação hormonal, também pode ser observado nas células vaginais tanto no RNA e os níveis de proteína (Figura 7 e Figura 8, respectivamente). Os agregados 3-D, não só tem a capacidade de responder a moléculas de agentes patogénicos e hormonal, mas também são capazes de suportar funcionalmente um vírus herpes simplex tipo 2 (HSV-2) a infecção. Uma imagem de microscopia confocal de HSV-2 infectadas em 3-D agregados vaginais (Figura 9) demonstra a infecção. Paralelas 2-D vaginais culturas de células epiteliais não são mostrados como um resultado da destruição grave celular causada por infecção HSV-2. RWV derivados 3-D agregados também têm sido utilizados para quantificar a replicação bacteriana e virai através de curvas de crescimento intracelular e ensaios em placa, respectivamente 8, 9. Por último, as propriedades físicas e funcionais de células individuais dentro dos agregados podem também ser quantificada por citometria de fluxo. Para example, empregamos um ensaio de citometria de fluxo para medir MUC1 expressão de superfície em células individuais vaginais (Figura 10). Vaginais agregados em 3-D expressa uma menor percentagem de MUC1 (27,7%) em comparação com monocamadas (67,2%). A menor percentagem de MUC1 na superfície agregados 3-D em relação ao monocamadas pode ser um resultado da maioria dos MUC1 sendo secretada a partir das células, como observado no tracto vaginal 17, 18.
Figura 1. Esquemático para cultura de células epiteliais humanas em RWV e aplicações potenciais utilizando RWV derivados agregados. A) As células epiteliais são inicialmente crescidas como monocamadas em um balão de cultura de tecidos. Uma vez que confluentes, as células são removidas do frasco e combinado com os grânulos de microcarregador no bioreactor STLV. Barra de escala: 80. MM B) O STLV gira em torno de uma plataforma para criar um ambiente de constante queda livre de f baixoLUID cisalhamento, permitindo que as células de unir e crescer em grânulos, formando assim visíveis agregados celulares. C) Após 96 h, os meios de comunicação no STLV deve ser alterado para acomodar para o metabolismo celular. Os meios de comunicação é derramada de uma porta lateral, meios frescos é substituído por meio de uma seringa em anexo mL 10 (êmbolo removido), e êmbolos das seringas são substituídos e usado para bolhas de extrusão. D) Depois de ~ 5 dias (d) os agregados começam a formar . Os agregados são recolhidos a cada 7 dias e fotografada por microscopia de luz para controlar a sua progressão do desenvolvimento (ampliação de 20x de 3-D humanos células epiteliais vaginais). E) Uma vez completa a formação de agregados e diferenciação celular tenha ocorrido, os agregados são colhidas a partir do bioreactor e transferidos para um tubo cónico de 50 ml. F) Os agregados podem ser semeadas em um tubo de 1,5 ml ou um formato de placa multi-poços para realizar uma análise experimental e ensaios. G) do esboço de pote Os ensaios ntial e análises que podem ser realizados sobre os agregados. Esta lista representativa das análises não pretende ser um catálogo exaustivo de todas as aplicações potenciais a jusante.
Figura 2. Examinando as características morfológicas e estruturais de 3-D agregados de células epiteliais, usando microscopia eletrônica. (A) microscopia eletrônica de varredura (SEM) imagem de um agregado de células em 3-D humana epitelial vaginal. Barras de escala: 200 mM (100X), 100 mM (200X), 50 mM (500x). Transmissão de electrões de microscopia de imagem (TEM) de um agregado de células em 3-D humana epitelial vaginal com setas apontando para (B) vesículas secretoras intracelulares e microvilosidades ou (c) "" processos citoplasmáticos. Barras de escala: 2 micra (modificado a partir do Hjelm et al 2010.) 2.
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Figura 3. Microscopia de imunofluorescência confocal usado para identificar a diferenciação juncional e marcadores de proteína em 3-D agregados de células epiteliais. Humanos 3-D células vaginais colhidos a partir de bioreactor após 32 dias, fixos, e coradas com (A) anticorpo mucina MUC1, (B) um anticorpo específico para células epiteliais, ESA, ou (C) anti-involucrina de anticorpos (INV) que reconhece terminalmente diferenciadas células epiteliais. Agregados foram indiretamente marcado com anticorpo Alexa 488 secundário (verde). Barra de escala: 60 um (modificado de Hjelm et al 2010). 2.
Figura 4. Ensaio MTT é usado para medir a viabilidade celular. Humanos 3-D agregados vaginais foram semeadas numa placa de 24 poços e tratadas com os meios de sozinho (não tratado) ou 0,01%, 0,1% ou 1,0% de Triton X-100 detergente durante 1 h, a 37 ° C. Followin g de tratamento, meios de comunicação foi removido eo ensaio de MTT foi realizada para medir a viabilidade celular. Representa ** p <0,001; unicaudal teste t de Student comparando Triton X-100 células tratadas com os controles.
Figura 5. Utilizando 3-D agregados de células epiteliais para a toxicidade composto tela. (A) Nonoxynol-9 (N-9) da curva dose-dependente da viabilidade 24 h pós-tratamento de 3-D modelo de célula humana vaginal epitelial (linha vermelha / barras) em comparação com mesmo tipo de célula cultivada como monocamadas confluentes (linha preta / bares). (B) N-9 TC 50 níveis de vaginais culturas de células epiteliais em (A) em 1,5 h, 4 h, 8 h, e 24 h pós-tratamento. * Representa p <0,05;-tailed um teste t de Student-comparando monocamadas de células em 3-D em cada tempo de exposição. (Modificado de Hjelm et al. 2010) 2.
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Figura 6. A análise da produção de citocinas em 3-D células epiteliais em resposta a portagem-like receptor (TLR) estimulação agonista. Três-D humanos células vaginais foram estimuladas com FSL-1 (TLR2 / 6), PIC (TLR3), FLAG (TLR5) , e CL097 (TLR7 / 8) durante 24 horas e citocinas secretadas foram medidos por citometria de matriz do grânulo. IL-6 é mostrada como uma citoquina pró-inflamatória representante produzido e medido. * Representa p <0,05; unicaudal teste t de Student, comparando amostras estimulados a PBS grupo. (Modificado de Hjelm et al. 2010) 2.
Figura 7. Monitorização da expressão dos genes em 3-D células epiteliais. Semi-quantitativa análise de RT-PCR de receptor de progesterona (PR) expressão em monocamada (ML) ou 3-D humanos vaginais células epiteliais. GAPDH é mostrado como um controle de carregamento. Os produtos de amplificaçãomostrados são um resultado de expressão transcrição ocorrendo após 30 ciclos de PCR. seta cabeças ponto de bandas de RP só ocorrem na amostra 3-D.
Figura 8. Análise de proteínas expressão de 3-D células epiteliais. Análise de Western blot de monocamada e 3-D humanos vaginais das células epiteliais lisados de células inteiras (30μg) sondado com um anti-receptor de progesterona (PR) de anticorpo. β-tubulina foi utilizado como uma sonda para o carregamento de controlo.
Figura 9. Três-D modelo de célula epitelial humana suporta uma infecção produtiva viral. Imagem de microscopia confocal de imunofluorescência de 3-D agregado celular humana vaginal epitelial infectadas com HSV-2. As células foram infectadas a uma MOI de 1,0, durante duas horas, lavada, fixo 24 h após a infecção (4% PFA), e coradas com uma HSV-2 específico VP5 capsid anticorpo (verde) e DAPI o nuclear mancha (azul). Barra de escala: de 50 um.
Figura 10. Análise célula individual em 3-D modelo de célula epitelial humana por citometria de fluxo. (A) monocamada ou (b) 3-D humanos vaginais agregados epiteliais foram dissociadas com EDTA, marcado com um anticorpo conjugado com FITC MUC1 (azul), um controlo de isotipo (verde), ou PBS (vermelho), e de expressão FITC foi quantificada por citometria de fluxo. Números representam a percentagem de células coradas que positivo para o anticorpo de mucina que permaneceu após gating fluorescência de fundo para fora a partir das células do isotipo de controlo coradas. Não uniformes picos são um resultado da multiplicidade de padrões glycosolation e níveis variados de MUC1 na superfície destas células.
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Discussion
Utilização da tecnologia de bio-reactor RWV aqui apresentado pode fornecer investigadores com a capacidade para fazer avançar o seu sistema de cultura de células de corrente para um modelo de cultura mais fisiologicamente relevante organotípico célula. O bioreactor RWV sistema de cultura celular fornece um microambiente de baixo cisalhamento que permite que as células para formar 3-D agregados celulares in vivo com características semelhantes, incluindo junções apertadas, a produção de mucina, processos extracelulares (ie microvilosidades), e de polaridade celular. A maioria dos dados e exemplos aqui apresentados são usando vaginais células epiteliais cultivadas no sistema RWV, no entanto, o sistema de RWV também tem sido utilizado para a cultura de outros tipos de células epiteliais, incluindo intestino delgado e grosso, pulmão, bexiga, fígado, e as células epiteliais da amígdala para formar modelos 3-D organotípicas 1, 7-13, 18. Além disso, este sistema tem sido utilizado para tipos de cultura de células que não as células epiteliais, e actualmente, o desenvolvimento de complexo, multicelintracelular modelos de cultura organotípicas estão em andamento 2, 18.
Os protocolos descritos aqui são destinadas a servir de guia, e pode necessitar de ser modificado com base no tipo celular de interesse. As modificações mais comuns para o protocolo para a cultura de células epiteliais no sistema RWV incluem a duração do tempo, as células são cultivadas na STLV, a decisão e de temporização de transferência de agregados do STLV ao HARV, ea razão de célula / grânulo para o inicial sementeira no STLV. Uma modificação mais especializados que podem ser considerados para a formação de agregados com sucesso são as propriedades do grânulo microcarregador ou andaime, tais como área de superfície, o diâmetro, a forma, revestimentos de superfície, a densidade, a carga, o material do núcleo, e porosidade. Além disso, os ajustes do meio de cultura de base, formulação, ou suplementos, pode ser necessário para optimizar as condições de cultura e maximizar a formação de agregados. Os ajustes podem também ser feitos para o sistema de bioreactor e seus componentes, emcluindo o tamanho da embarcação biorreactor ea velocidade de rotação. Para uma avaliação melhorada do microambiente dentro do biorreactor, um sistema de cultura de perfundido está também disponível que permite a monitorização contínua do pH, oxigénio, e níveis de glucose no interior do vaso de cultura assegurar um ambiente prolífico para a formação de agregados. O tempo potencialmente longo para optimizar as condições de cultura, a formação de agregados, a diferenciação celular e para caracterizar cada sistema novo modelo, bem como o custo inicial do sistema de bioreactor, são inconvenientes notáveis para o presente sistema. No entanto, qualquer sistema de cultura de novo implementado num laboratório terá desvantagens semelhantes.
Nós e outros mostraram que RWV derivados modelos que utilizam células humanas pode ser uma ferramenta valiosa para a previsão da eficácia, toxicidade e farmacocinética de vacinas, microbicidas, agentes biológicos e produtos farmacêuticos em uma forma que é relevante para os seres humanos 1, 2, 18. Com o sucesso do thé o sistema de biorreator de cultura para produzir autênticos respostas humanas, combinada com a sua flexibilidade, as aplicações do sistema de biorreator RWV está sendo ampliado para áreas como a modelagem de tumor, medicina regenerativa e engenharia tecidual 2, 18-23. Para avançar nossos RWV modelos gerados mucosas estamos trabalhando para criar um sistema mais complexo multicelular que replica a estrutura e função do tecido humano da mucosa. No entanto, os autores reconhecem que pode ser necessário utilizar ou integrar múltiplas sistemas modelo para reproduzir as interacções complexas que as drogas ou vacinas têm com humanos sistemas fisiológicos. Em geral, nosso objetivo de utilizar o biorreator RWV e suas aplicações experimentais é entender melhor a biologia dos tecidos da mucosa e as respostas celulares às agressões ambientais em modelos humanos organotípicas.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer a Brooke Hjelm por sua perícia técnica e Larsen Andrew para a sua análise de proteínas. Este trabalho foi financiado em parte pela Alternativas de Pesquisa Fundação para o Desenvolvimento (MMHK) Grant eo NIH NIAID Infecções Sexualmente Transmissíveis e microbicidas tópicos Cooperativa Centro de Pesquisa IU19 AI062150-01 (MMHK). Agradecemos Biologia da Reprodução para a reutilização de números.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21131 | Used at 1:500 dilution |
| FACSDiva | BD Biosciences | Flow cytometer | |
| β-tublin antibody | Calbiochem | 654162 | Used at 1:5000 dilution |
| Bio-Plex 2000 | Bio-Rad | 171-000205 | v5 software |
| Bioreactor and components | Synthecon | RCCS-4 | |
| Cell strainer | BD Biosciences | 352340 | 40μm pore size |
| Conical tube (50mL) | Corning | 5-538-60 | |
| Coverslips | VWR international | 48366067 | |
| Cytokine bead array kits | Bio-Rad | Custom human kit | |
| Cytodex beads | Sigma-Aldrich | C3275 | |
| DPBS | GIBCO, by Life Technologies | 14190 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | ED-500G | Ethylenediaminetetraacetic acid |
| Epithelial specific antibody (ESA) | Chemicon International | CBL251 | Used at 1:50 dilution |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | GIBCO, by Life Technologies | 10438 | Heat inactivated |
| HARV (Disposable) | Synthecon | D-405 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | 37% |
| Involucrin antibody | Sigma-Aldrich | I 9018 | |
| Microscope slides | VWR international | 16004-368 | |
| MTT reagent | MP Biomedicals | 194592 | 3-(4,5-Dimethylthiazolyl 1-2)-2,5-Diphenyl Tetrazolium Bromide |
| MUC1 antibody (microscopy) | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | Sc-7313 | Used at 1:50 dilution |
| MUC1 antibody (flow cytometry) | BD Biosciences | 559774 | Also called CD227, use 20μL per test |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Diluted to 4% in DPBS |
| Petri dish (small) | BD Biosciences | 353002 | |
| Polystyrene tube with filter | BD Biosciences | 352235 | |
| Polystyrene flow tube | BD Biosciences | 352058 | |
| PR antibody | Dako | M3569 | Used at 1:100 dilution |
| ProLong Gold | Invitrogen | P36931 | Mounting media with DAPI |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74903 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | 71725 | |
| Sterilization pouch | VWR international | 11213-035 | |
| Stopcocks (one-way) | MedexSupply | MX5061L | |
| Syringe (10mL) | BD Biosciences | 309604 | Luer-lock tip |
| Syringe (5mL) | BD Biosciences | 309603 | Luer-lock tip |
| Trypan Blue | Invitrogen | T10282 | |
| Vp5 antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-13525 | HSV-2 antibody Clone 6F10; used at 1:5000 dilution |
References
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