Summary
Système de pile à rotation culture qui permet aux cellules épithéliales de croître dans des conditions physiologiques résultant en 3-D formation d'agrégats cellulaires est décrite. Les agrégats généré affichage
Abstract
Les cellules et les tissus dans les conditions de l'expérience du corps de l'environnement qui influent sur leur architecture, les communications intercellulaires et les fonctions globales. Pour des modèles in vitro de cultures cellulaires avec précision imiter le tissu d'intérêt, le milieu de croissance de la culture est un aspect essentiel à considérer. Couramment utilisés les systèmes classiques de culture cellulaire de propager des cellules épithéliales sur le plat en deux dimensions (2-D) des surfaces imperméables. Bien que beaucoup ait été tirées de systèmes classiques de culture cellulaire, de nombreuses conclusions ne sont pas reproductibles dans des essais cliniques humains ou des explants de tissus, ce qui pourrait à la suite de l'absence d'un micro-physiologiquement pertinent.
Ici, nous décrivons un système de culture qui permet de surmonter bon nombre des limites des conditions de culture de 2-D des cultures de cellules, en utilisant la rotation innovant paroi de la cuve (RWV) la technologie des bioréacteurs. Nous et d'autres ont montré que organotypiques RWV dérivés des modèles peut récapituler structure, la fonction et authentiques réactions humaines à des stimuli externes de même pour les tissus humains explants 1-6. Le bioréacteur RWV est un système de culture en suspension qui permet la croissance des cellules épithéliales dans des conditions de cisaillement faible physiologiques fluide. Les bioréacteurs sont de deux formats différents, un récipient à haute élément rotatif (HARV) ou un navire rotation lente latérale (STLV), dans laquelle ils diffèrent par leur source d'aération. Cellules épithéliales sont ajoutés au bioréacteur de choix en combinaison avec poreux, des billes microsupports revêtus de collagène (figure 1A). Les cellules utilisent les perles comme un échafaudage de croissance au cours de la baisse constante gratuitement dans le bioréacteur (figure 1B). Le microenvironnement fournies par le bioréacteur permet aux cellules de former des agrégats tridimensionnels (3-D) présentant in vivo des caractéristiques similaires souvent pas respectées en vertu de la norme 2-D des conditions de culture (figure 1D). Ces caractéristiques comprennent des jonctions serrées, le MUCnous la production, apicale / basale d'orientation, dans la localisation des protéines in vivo, ainsi que d'autres cellules épithéliales de type des propriétés spécifiques.
La progression d'une monocouche de cellules épithéliales à un totalement différenciées en 3-D agrégat varie en fonction de type 1 de cellules, 7-13. Échantillonnage périodique du bioréacteur permet de surveiller la formation d'agrégats épithéliale, marqueurs de différenciation cellulaire et la viabilité (figure 1D). Une fois la différenciation cellulaire et la formation d'agrégats est établi, les cellules sont récoltées à partir du bioréacteur, et des tests similaires réalisés sur 2 D-cellules peuvent être appliqués aux agrégats 3-D avec quelques considérations (figure 1E-G). Dans ce travail, nous décrivons les étapes détaillées de la façon dont la culture en 3-D des agrégats de cellules épithéliales dans le système de bioréacteur RWV et une variété de dosages potentiels et des analyses qui peuvent être exécutées avec les agrégats 3-D. Ces analyses comprennent, mais ne sont pas limités à, structurel / manalyse orphological (confocale, de numérisation et microscopie électronique à transmission), cytokine / chimiokine sécrétion et la signalisation cellulaire (cytométrie tableau talon et à l'analyse Western blot), l'analyse d'expression génique (PCR en temps réel), toxicologiques / analyse des médicaments et interactions hôte-pathogène. L'utilisation de ces tests a jeté les bases pour des études plus approfondies et expansive comme la métabolomique, la transcriptomique, la protéomique et d'autres applications basées sur réseau. Notre objectif est de présenter des moyens non conventionnels de la culture de cellules épithéliales humaines pour produire organotypiques modèles 3-D qui récapitulent l'humain dans des tissus in vivo, dans un système facile et robuste pour être utilisé par les chercheurs avec les divers intérêts scientifiques.
Protocol
Toutes les mesures doivent être effectuées sous BSL-2 conditions dans une hotte à flux laminaire.
1. Préparation de la Bioréacteur STLV
- Assembler le bioréacteur STLV selon le protocole du fabricant et effectuer le protocole de désintoxication pour assurer la stérilité du bioréacteur. Couvrir les ports ouverts avec des bouchons Luer et remplir le STLV avec de l'éthanol 95% pendant 24 h.
- Retirer l'éthanol et de remplir le STLV avec de l'eau distillée stérilisée pendant 24 h.
- Répétez l'étape 1.2 avec de l'eau distillée stérilisée seulement.
- Avec l'outil fourni par le vendeur, desserrer toutes les vis, casquettes et plug centre de la STLV et autoclave à 110 ° C pendant 20 min dans une poche de stérilisation.
- Une fois que le STLV est refroidi, serrez les vis et répétez les étapes 1.1-1.4 pour garantir la stérilité et la désintoxication complète.
- Serrer les vis de la température de la STLV et vis sur la pré-stérilisés à sens unique robinets à chaque port.
- Ouvrir le robinet en positionnant les boutons à la verticale.
- Retirez les plongeurs à partir de 10 ml et 5 ml luer-lock seringue et ré-manches plongeurs de retour dans des enveloppes pour maintenir la stérilité. Visser seringues SUR DES robinets (seringues embout luer-lock sont requises pour cette étape).
- Ajouter Dulbecco tampon phosphate salin (DPBS) à la seringue de 10 ml jusqu'à ce que le STLV est plein et commence à remplir la seringue de 5 ml.
- Remplacer les pistons stériles dans chaque seringue et éliminer les bulles d'résiduels survenant dans un bioréacteur en alternant entre la conduite pistons des seringues.
- Laisser les seringues attachées à bioréacteur après avoir enlevé toutes les bulles. Robinets de fermeture et fixez le STLV à la plate-forme tournante verticale et le faire tourner pendant un minimum de 24 h pour surveiller les fuites.
2. Préparation billes microsupports
- Ajouter 15 ml de DPBS ~ 250 mg perles Cytodex microsupports dans un tube conique de 50 ml et autoclave dans les mêmes conditions que le STLV (1,4).
- Après refroidissement, retirez DPBS, ajouter des médias utilisés pour faire pousser epithelial de cellules d'intérêt, et le tube tourbillon de remettre en suspension des billes.
- Répétez les étapes laver avec les médias deux fois de plus. Après le lavage finale, on ajoutera 15 ml des milieux de croissance à des billes.
3. Ensemencement cellules épithéliales et des perles dans le bioréacteur STLV
- Cultiver les cellules épithéliales de l'intérêt que monocouches dans des flacons de culture de tissus jusqu'à ce que vous obtenir de ≥ 1x10 7 cellules. Supprimer des cellules de la fiole (c.-à-trypinsization, EDTA), compter les cellules d'établir la concentration cellulaire, et de déterminer la viabilité cellulaire par coloration exclusion au bleu trypan 1.
- Pour le tube conique contenant des billes de préparation (voir 2.3), ajouter la concentration désirée de cellules (2x10 1x10 5-7 cellules épithéliales) 2, 8, en fonction de votre type de cellules épithéliales de l'intention (figure 1A). S'assurer que tous les cellules sont transférées par rinçage du tube conique.
- Retirer du DPBS et des seringues de la STLV.
- Enlevez le bouchon du port centre et ajouter le épithéliale cell / suspension de billes dans le STLV en utilisant 10 ml pipette sérologique. Rincer tube conique pour assurer toutes les cellules ou des perles sont transférées à l'STLV et remplacer le bouchon orifice central.
- Retirer plongeurs à partir d'un 5 et 10 ml seringues et re-manches pistons arrière dans des emballages pour maintenir la stérilité. Visser seringues dans les ports avec robinets ouverts. Remplissez le STLV avec les médias, remplacer plongeurs et robinets proches.
- Placez le nouvellement ensemencé STLV dans un incubateur à 37 ° C pendant 30 min sans rotation.
- Robinets ouverts, enlever les bulles d'aide des plongeurs, et puis les robinets proches.
- Placez le STLV à 37 ° C, 5% de CO 2 humidifié rotation incubateur à 20 tours par minute (figure 1B). Les cultures doivent être en rotation continue 24 heures par jour, sauf lors de l'échantillonnage, les médias changent, ou des agrégats de récolte (voir la section suivante).
4. La culture, l'échantillonnage, de la documentation photo et des cultures
- Après une période initiale de 96 à 120 h de culture de cellules dans la bioreactor, support à changement de l'inclinaison du STLV et permettant aux cellules de Geisha à régler. Retirer les seringues, ouvrez les deux robinets d'arrêt, et verser environ 75% des médias à partir du port côté (figure 1C). Basé sur le métabolisme cellulaire des médias, changer de support tous les jours ou tous les deux jours après le semis initial et 96-120 période de culture h.
- Visser les 5 et 10 ml vide seringues de plongeurs et de suivre le protocole de réalimentation que décrit ci-dessus (1.7 à 1.11), puis vissez fermée à l'arrière STLV en place sur la plate-forme tournante.
- Surveiller la croissance et la viabilité des agrégats tous les 5-7 jours après le semis dans le STLV en enlevant soigneusement une petite quantité d'agrégats (~ 200 pi) à partir du port centre en deux tubes de 1,5 mL. Pour éviter le cisaillement global, pour tous les transferts globaux utiliser un embout de pipette 1000 pi qui a été coupée environ 2 cm du point et stérilisés.
- Remettre le bouchon centre, l'échange de seringues, d'ajouter du milieu frais à l'STLV tel que décrit ci-dessus (1.7 à 1.11), et placez le dos dans le STLVincubateur avec une rotation (voir 3.8).
- Pour la surveillance viabilité cellulaire, utilisez l'une des deux agrégats 1,5 ml tube aliquotés à l'étape 4.3, et éliminer les cellules à partir de perles de la même manière les cellules épithéliales sont retirés de flacons de culture tissulaire (c.-à-trypsinisation). Surveiller la viabilité par exclusion du bleu trypan coloration 1.
- Pour les agrégats d'imagerie cellulaire, ajoutez 0,5-1 ml de support à la seconde partie aliquote 1,5 ml global et le transfert à une petite boîte de Petri en utilisant une teneur de coupure 1000 pointe de la pipette ul. Agrégats image en utilisant un microscope à lumière inversée (figure 1D).
5. Transfert et récolte Granulats
- Pour certains modèles de cellules épithéliales, il est nécessaire de transférer les agrégats à une HARV jetable pour augmenter de 2 aération de la culture. Environ une semaine avant la récolte des agrégats pour l'analyse, retirer les seringues et les robinets de la STLV et verser environ 50% des médias à partir du port côté.
- Remove prise le centre de la STLV et versez délicatement tout le contenu dans un tube de 50 ml conique à partir de l'orifice central (figure 1E). Rincer les deux fois avec 5 STLV médias mL et de combiner avec le reste de rincer les agrégats.
- Continuer avec le transfert des agrégats comme décrit en 5.2, mais des agrégats de transfert à partir du tube de 50 ml conique à la HARV.
- Agrégats de récolte soigneusement de la HARV après ~ 1 semaine ou de la STLV (en fonction du type de cellule) comme ci-dessus a été réalisée (5.2). Voir ci-dessous pour les formats de dosage potentiels, les tests et analyses après la récolte totale.
6. Analyse des possibilités, applications et essais réalisés avec des agrégats
- Agrégats de semis pour différents formats expérimentaux. Introduire la quantité voulue d'agrégats à partir du tube conique de 50 ml dans un tube de 1,5 ml, 24 plaques à puits, ou plaque de 96 puits en utilisant une teneur de coupure stérilisés 1000 pipette ul (figure 1F).
- Lavage et de préparationIng agrégats pour l'analyse. Retirez le support après agrégats se sont installés. Distribuer DPBS directement à centre du tube ou bien si tous les agrégats sont agités jusqu'à. Une fois que les agrégats se sont installés en bas, retirez DPBS et répéter autant de fois que nécessaires.
- Agrégats d'expédition pour les hors-site d'expérimentation et d'analyse. Ajouter la quantité désirée d'agrégats dans un tube de 50 ml et laver des agrégats comme en 6.2. Remplissez complètement tube de 50 ml avec les médias, casquette, et parafilm autour du bouchon pour éviter les fuites. Solidement expédier agrégats à l'endroit désiré une nuit à température ambiante.
- Agrégats de fixation pour la microscopie électronique (figure 2). Balayage, transmission ou immuno-microscopie électronique peut être effectuée par le transfert de 150-300 agrégats pi à un tube de 1,5 ml et de lavage des agrégats 3 fois avec du DPBS (6.2). Ajouter 200 ul d'application spécifique (MEB, MET, immuno-EM, etc) fixateur microscopie électronique pour la période d'incubation désirée. Retirer fixer, laver aggrégates 2 fois avec du DPBS, et procéder comme indiqué dans Hjelm et al. 2010 pour la numérisation et la microscopie électronique à transmission 2.
- Imagerie par microscopie en immunofluorescence (Figure 3). Transfert ~ 100 agrégats pi à un tube de 1,5 ml et de granulats de lavage (6.2). Fixer et agrégats d'étiquettes avec des anticorps dans des conditions similaires à celles avec des monocouches, sauf dans un tube de 1,5 ml. Pour monter, placez 1 goutte de milieu de montage sur lame de microscope, de transférer des agrégats marqués sur le dessus de milieu de montage avec une coupure 1000 pointe de la pipette ul, lamelle lieu au cours des agrégats, joint lamelle avec du vernis à ongles, et glissade sèche durant la nuit 2.
- Mesure la viabilité cellulaire / prolifération en utilisant un test MTT (Figure 4). Agrégats de transfert à une plaque à 24 puits et remplacer le support avec 625 ul de phénol rouge des médias libres. Ajouter 62,5 ul de 5 mg / ml thiazolyl bleu tétrazolium (MTT) à chaque puits et incuber pendant 4 h à 37 ° C. Ajouter 625 ul de 100 mg / ml SDS-0.01M HCl à chaque puits et incuber pendant la nuit. Lire l'absorbance à 570 nm et obtenir% de viabilité cellulaire en utilisant l'équation:
- Les études toxicologiques. Transfert des agrégats à 24 plaques à puits et effectuer exclusion au bleu trypan sur ≥ 2 puits pour la viabilité cellulaire initiale / concentration. Ajouter composé d'essai à des concentrations allant de puits en double. Pour la viabilité cellulaire (figure 5A), se laver les agrégats et d'effectuer exclusion au bleu trypan après le traitement. Pour TC 50 (figure 5B), prendre la viabilité cellulaire des puits en double pour chaque concentration dans le temps et utiliser Reed Muench méthode pour déterminer la concentration toxique 50% 2, 15.
- Cytométrie en réseau talon (ABC) ou ELISA. Surnageants cellulaires peuvent être prises après l'ensemencement des cellules dans n'importe quel format expérimental schématisé. Stimuler agrégats ensemencées avec des cellules cultivées en tant quemonocouches, recueillir des surnageants (≥ 120 pi), et conserver à -80 ° C pour l'analyse par ELISA ou ABC (figure 6).
- Analyse de l'ARN. Transfert ≥ 500 uL d'agrégats de tube de 1,5 ml et de granulats de lavage avec du DPBS. Continuer l'extraction à l'aide Qiagen RNAeasy kit et protocole pour les cellules animales avec l'homogénéisation des lysat à l'aide de calibre 20 de l'aiguille. Assurez-vous de laisser perles se déposent au fond du tube, avant de transférer le surnageant, et ne transfèrent pas des billes vides dans la colonne de spin (perles se bouchent membrane de la colonne résultant de l'ARN à faible rendement) (Figure 7).
- L'analyse des protéines. Agrégats de récolte sous les mêmes méthodes que les monocouches avec l'aide d'un tube de 1,5 ml ou un plus grand format expérimental. Cependant, après la lyse des agrégats, permettre aux billes de s'installer et de transférer lysat dans un tube séparé avant d'exécuter un gel de protéine ou une autre forme de l'analyse des protéines (figure 8).
- Infectionétudes. agrégats de semences dans le format désiré. expérimentale Utilisez au moins deux puits et les échantillons pour trypsinizing cellules à partir de perles d'énumérer le nombre de cellules et de quantifier la viabilité des cellules. Infect agrégats avec des agents pathogènes d'intérêt à la multiplicité d'infection sélectionné comme effectuée avec des cellules cultivées en monocouche (figure 9). Étapes de lavage doit être effectué que dans 6.2.
- La cytométrie en flux: les agrégats de semences dans tube de 50 ml, les agrégats de lavage (6.2), 2 mM EDTA et ajouter pendant 5-10 min à 37 ° C. Ajouter des médias mL 5-10 pour les cellules et les cellules passent à travers un tamis cellulaire. Aliquotes 1x10 6 cellules dans un tube en polypropylène et les cellules de lavage dans une solution de blocage froid (1% de FBS dans du PBS). Remettre en suspension les cellules avec l'anticorps et incuber selon le fabricant. Laver les cellules par centrifugation, remettre en suspension dans du PBS et les cellules de transfert pour filtrer le tube pour l'analyse (figure 10).
7. Les résultats représentatifs
Un exemple deune approche différenciée agrégat humain épithéliale cultivée dans le système de bioréacteur STLV peut être vu dans la figure 2. Les images MEB et TEM sont collectées à partir des cellules vaginales cultivés dans le STLV pendant 39 jours, où, les invaginations microridges, des vésicules de sécrétion intracellulaires, et microvillosités sur la surface apicale peuvent être observés. Confirmation de l'in vivo-comme les caractéristiques des cellules épithéliales cultivées dans le bioréacteur peut être observée par immunofluorescence des images de microscopie confocale (figure 3) de 3-D dans les cellules vaginales exprimant la mucine (MUC1) et des marqueurs spécifiques des cellules épithéliales (ESA) et de la différenciation terminale (involucrine; INV).
Comme le montre, 3-D des agrégats présentent des caractéristiques ultrastructurales similaires aux tissus, mais leurs phénotypes physiologiquement pertinents servent aussi une excellente plateforme pour évaluer la toxicité des composés. Le test MTT, un test couramment utilisé pour mesurer la viabilité cellulaire, le métabolisme ou la proliférationtion, peut être utilisé pour mesurer la toxicité de différents produits chimiques et composés (figure 4). Triton X-100, un détergent qui détruit les membranes cellulaires, a été utilisé comme contrôle positif pour valider le test MTT. Un procédé supplémentaire pour mesurer la toxicité à la suite du traitement avec des composés d'essai est le bleu trypan l'exclusion (figure 5). Après le traitement avec le nonoxynol-9 (N-9), les agrégats vaginales fait preuve d'une réponse toxicité similaire à celle de modèles d'explants cervicales, mais un profil différent par rapport aux monocouches 2, 16.
D'autres études qui démontrent la capacité des cellules épithéliales, cultivé dans le bioréacteur, à fonctionner et à signaler de même pour les tissus in vivo, on peut observer dans la figure 6. Lors de la stimulation avec des molécules dérivées de microbes qui sont reconnus par les récepteurs Toll-like (TLR), les agrégats de répondre et de sécréter des cytokines pro-inflammatoires, y compris IL-6 1.Expression des récepteurs de la progestérone (PR), un récepteur qui répond à la stimulation hormonale, peut également être observé dans les cellules vaginales, tant au niveau de l'ARN et de protéines (Figure 7 et Figure 8, respectivement). Les agrégats 3-D, non seulement ont la capacité de répondre à des molécules pathogènes et de l'hormone, mais sont également capables de soutenir une fonctionnellement l'herpès simplex virus type 2 (HSV-2) l'infection. Une image de microscopie confocale du HSV-2 infectées en 3-D des agrégats vaginales (Figure 9) montre une infection. 2-D parallèles cultures de cellules épithéliales vaginales ne sont pas représentés par suite de la destruction grave cellulaires provoqués par l'infection de HSV-2. RWV dérivés de 3-D des agrégats ont également été utilisés pour quantifier la réplication bactérienne et virale dans les courbes de croissance et des dosages intracellulaires plaque, respectivement 8, 9. Enfin, les propriétés physiques et fonctionnelles des cellules individuelles au sein des agrégats peut également être quantifiée par cytométrie en flux. Pour example, nous avons utilisé un test de cytométrie de flux pour mesurer expression de MUC1 surface sur des cellules individuelles vaginales (Figure 10). Vaginaux agrégats 3-D a exprimé un pourcentage inférieur de MUC1 (27,7%) par rapport à des monocouches (67,2%). Le pourcentage inférieur de protéine MUC1 sur la surface 3-D par rapport à agrégats monocouches peut être le résultat de la majorité de protéine MUC1 étant sécrété par les cellules comme observé dans la voie vaginale tractus 17, 18.
Figure 1. Schéma pour la culture des cellules épithéliales humaines dans RWV et les applications potentielles en utilisant RWV dérivés agrégats. A) Les cellules épithéliales sont initialement développé sous forme de monocouches dans un flacon de culture tissulaire. Une fois confluentes, les cellules sont retirées de ballon et combiné avec billes microsupports dans le bioréacteur STLV. La barre d'échelle:. 80 um B) Le STLV tourne sur une plate-forme pour créer un environnement libre de baisse constante f à faiblecisaillement LUID, permettant aux cellules de se fixer et se développer sur des billes en formant ainsi des agrégats cellulaires visibles. C) Après 96 h, les médias dans le STLV doit être modifié pour tenir compte du métabolisme cellulaire. Les médias se répand d'un port côté, les médias frais est remplacé par un joint seringue de 10 mL (plongeur enlevé), et pistons de la seringue sont remplacés et utilisé à des bulles d'extrusion. D) Après ~ 5 jours (d) les agrégats commencent à se former . Les agrégats sont prélevés tous les 7 jours et imagées par microscopie optique pour surveiller la progression de leur développement (grossissement de 20x 3-D de l'homme les cellules épithéliales vaginales). E) Une fois terminée la formation d'agrégats et la différenciation cellulaire a eu lieu, les agrégats sont récoltées à partir du bioréacteur et transférés dans un tube conique de 50 ml. F) Les agrégats peuvent être ensemencées dans un tube de 1,5 ml ou un format de plaque multi-puits pour mener à bien l'analyse expérimentale et des essais. G) Schéma de pote dosages ntial et analyses qui peuvent être menées sur les agrégats. Cette liste représentative des analyses n'est pas destiné à être un catalogue exhaustif de toutes les applications possibles en aval.
Figure 2. L'examen des caractéristiques morphologiques et structurales de la 3-D des agrégats de cellules épithéliales utilisant la microscopie électronique. (A) microscopie électronique à balayage (MEB) d'un 3-D agrégat humain de cellules épithéliales vaginales. Barres d'échelle: 200 um (100x), 100 um (200x), 50 um (500x). La microscopie électronique à transmission (MET) l'image d'un 3-D agrégat humain de cellules épithéliales vaginales avec des flèches pointant vers (B) vésicules de sécrétion intracellulaires et microvillosités ou (c) «processus cytoplasmiques". Barres d'échelle: 2 pm (modifié à partir de Hjelm et al 2010). 2.
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Figure 3. La microscopie confocale à immunofluorescence utilisée pour identifier la différenciation de jonction et des marqueurs protéiques en 3-D des agrégats de cellules épithéliales. De l'homme en 3-D dans les cellules vaginales récoltés à partir de bioréacteur après 32 jours, fixes, et colorées avec (A) antibody mucine MUC1, (B) anticorps spécifique pour les cellules épithéliales, l'ASE, ou (C) anti-involucrine (INV) anticorps qui reconnaît définitivement différenciées des cellules épithéliales. Les agrégats ont été marqué indirectement avec Alexa 488 anticorps secondaire (vert). La barre d'échelle: 60 um (modifié à partir de Hjelm et al 2010). 2.
Figure 4. Test MTT est utilisé pour mesurer la viabilité cellulaire. De l'homme en 3-D des agrégats vaginales ont été ensemencées dans une plaque 24 puits et traités avec les médias seuls (non traitée) ou 0,01%, 0,1% ou 1,0% Triton X-100 de détergent pendant 1 h à 37 ° C. Followin g un traitement, les médias a été retiré et le test MTT a été réalisée pour mesurer la viabilité cellulaire. ** Représente p <0,001; unilatéral de Student-test comparant Triton X-100 cellules traitées au témoin non traité.
Figure 5. Utilisant 3-D des agrégats de cellules épithéliales de toxicité du composé écran. (A) Le nonoxynol-9 (N-9) la courbe dose-dépendante la viabilité 24 h post-traitement de la 3-D modèle humain de cellules épithéliales vaginales (ligne rouge / bars) par rapport à même type de cellule cultivée comme monocouches confluentes (ligne noire / bars). (B) N-9 TC 50 niveaux de cultures de cellules épithéliales vaginales dans (A) à 1,5 h, 4 h, 8 h, et 24 h après le traitement. * Représente p <0,05; unilatéral de Student-test comparant monocouches de cellules en 3-D à chaque temps d'exposition. (Mise à jour de Hjelm et al. 2010) 2.
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Figure 6. Analyse de la production de cytokines dans les 3-D des cellules épithéliales, en réponse à récepteurs toll-like (TLR) de stimulation agoniste. Trois-D de l'homme les cellules vaginales ont été stimulées avec FLS-1 (TLR2 / 6), PIC (TLR3), FLAG (TLR5) , et CL097 (TLR7 / 8) pendant 24 h et les cytokines sécrétées ont été mesurés par cytométrie en réseau talon. IL-6 est montré comme une cytokine pro-inflammatoire produite représentant et mesuré. * Représente p <0,05; unilatéral de Student t-test comparant des échantillons stimulés pour PBS groupe. (Mise à jour de Hjelm et al. 2010) 2.
Figure 7. L'expression des gènes de suivi en 3-D des cellules épithéliales. Semi-RT-PCR quantitative d'analyse des récepteurs de la progestérone (PR) d'expression en monocouche (ML) ou 3-D de l'homme cellules épithéliales vaginales. GAPDH est montré comme un contrôle de chargement. Les produits d'amplificationmontré sont le résultat de l'expression transcription survenant après 30 cycles de PCR. Flèche dirige point à bandes PR ne se produisent dans l'échantillon 3-D.
Figure 8. Analyse de l'expression protéique de 3-D des cellules épithéliales. Analyse par Western blot de la monocouche et 3-D de l'homme par voie vaginale épithéliales lysats cellulaires de cellules entières (30μg) sondé avec un anti-récepteur de la progestérone (PR) d'anticorps. β-tubuline est utilisé comme sonde pour le chargement de commande.
Figure 9. Three-D modèle humain de cellules épithéliales prend en charge une infection productive virale. Confocale image de microscopie à immunofluorescence de la 3-D global de cellules humaines infectées par voie vaginale épithéliale HSV-2. Les cellules ont été infectées à une MOI de 1,0 pour deux heures, lavé, fixe 24 h après l'infection (4% PFA), et colorées avec un HSV-2 spécifique VP5 cAPSID anticorps (vert) et le nucléaire au DAPI tache (bleu). La barre d'échelle: 50 um.
Figure 10. L'analyse des cellules individuelles en 3-D modèle cellulaire épithéliale humaine par cytométrie de flux. (A) monocouche ou (B) 3-D de l'homme par voie vaginale agrégats épithéliales ont été dissociées avec de l'EDTA, marqué avec un anticorps conjugué FITC MUC1 (bleu), un contrôle isotypique (vert), ou de PBS (rouge), et l'expression FITC a été quantifiée par cytométrie en flux. Les chiffres représentent le pourcentage de cellules qui maculait positif pour les anticorps de mucine qui restait après déclenchement sur la fluorescence de fond à partir des cellules de contrôle isotype colorées. Non-uniformes pics sont le résultat de la multitude de modèles de glycosolation et divers niveaux de protéine MUC1 sur la surface de ces cellules.
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Discussion
L'utilisation de la technologie du bioréacteur RWV présenté ici peut fournir aux chercheurs la capacité de faire progresser leur système actuel de culture cellulaire à un modèle plus physiologiquement pertinente des cellules organotypique culture. Le bioréacteur RWV système de pile à la culture offre un microenvironnement faible cisaillement qui permet aux cellules de former en 3-D agrégats cellulaires in vivo avec des caractéristiques similaires, y compris les jonctions serrées, la production de mucine, les processus extracellulaires (c.-à-microvillosités) et la polarité cellulaire. La majorité des données et des exemples présentés ici sont à l'aide cellules épithéliales vaginales cultivés dans le système RWV, cependant le système RWV a également été utilisé pour la culture d'autres types de cellules épithéliales, notamment l'intestin grêle et du gros, du poumon, de la vessie, le foie et les cellules épithéliales des amygdales pour former modèles 3-D organotypiques 1, 7-13, 18. En outre, ce système a été utilisé pour les types de cellules de culture autres que les cellules épithéliales, et actuellement le développement du complexe, multicellume des modèles de culture organotypiques sont en cours 2, 18.
Les protocoles décrits ici sont destinés à servir de guide, et peut-être besoin d'être modifié en fonction du type cellulaire d'intérêt. Les modifications les plus communs au protocole de culture de cellules épithéliales dans le système RWV comprennent la longueur de temps les cellules sont cultivées dans l'STLV, la décision et le moment de transfert globale du STLV à l'HARV, et le rapport de cellules / bourrelet pour la première ensemencement dans le STLV. Une modification plus spécialisé qui peut être pris en considération pour la formation d'agrégats de succès sont les propriétés de la bille microsupport ou échafaudage, comme surface, le diamètre, la forme, les revêtements de surface, la densité, la charge, la matière de base, et la porosité. En outre, des ajustements au milieu de culture de base, la formulation, ou les suppléments, peut-être nécessaire d'optimiser les conditions de culture et de maximiser la formation d'agrégats. Les réglages peuvent également être apportées au système de bioréacteur et de ses composantes, eny compris la taille du récipient bioréacteur et la vitesse de rotation. Pour une meilleure évaluation du microenvironnement dans le bioréacteur, un système de culture perfusé est également disponible qui permet une surveillance continue des niveaux de pH, l'oxygène et du glucose dans le récipient de culture en assurant un environnement prolifique pour la formation d'agrégats. Le temps peut s'avérer très long pour optimiser les conditions de culture, de la formation d'agrégats, la différenciation cellulaire et de caractériser chaque système nouveau modèle, ainsi que la dépense initiale du système de bioréacteur, sont remarquables inconvénients à ce système. Cependant, tout nouveau système de culture mis en œuvre dans un laboratoire aura des inconvénients similaires.
Nous et d'autres ont montré que RWV dérivés des modèles utilisant des cellules humaines peuvent être un outil précieux pour prédire l'efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique de vaccins, les microbicides, les produits biologiques et des produits pharmaceutiques d'une manière qui est pertinente pour les humains 1, 2, 18. Avec le succès de eest le système de la culture bioréacteur pour produire les réactions humaines authentiques, combinée à sa flexibilité, les applications du système de bioréacteur RWV est actuellement étendu à des domaines tels que la modélisation des tumeurs, la médecine régénérative, et 2 l'ingénierie tissulaire, 18-23. Pour faire avancer nos RWV modèles générés par la muqueuse, nous travaillons à créer un système plus complexe multicellulaire qui reproduit à la fois la structure et la fonction du tissu humain de la muqueuse. Toutefois, les auteurs reconnaissent qu'il peut être nécessaire d'utiliser ou d'intégrer des systèmes modèles multiples de reproduire les interactions complexes que les médicaments ou vaccins ont avec l'homme des systèmes physiologiques. Dans l'ensemble, notre objectif d'utiliser le bioréacteur RWV et de ses applications expérimentales est de mieux comprendre la biologie du tissu des muqueuses et les réponses cellulaires aux agressions de l'environnement dans des modèles humains organotypiques.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier Brooke Hjelm pour son expertise technique et Andrew Larsen pour son analyse des protéines. Ce travail a été financé en partie par la Fondation Alternatives recherches pour le développement (MMHK) et le NIH Grant NIAID infections sexuellement transmissibles et les microbicides topiques Cooperative Research Centre IU19 AI062150-01 (MMHK). Nous tenons à remercier Biologie de la Reproduction pour la réutilisation des chiffres.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21131 | Used at 1:500 dilution |
| FACSDiva | BD Biosciences | Flow cytometer | |
| β-tublin antibody | Calbiochem | 654162 | Used at 1:5000 dilution |
| Bio-Plex 2000 | Bio-Rad | 171-000205 | v5 software |
| Bioreactor and components | Synthecon | RCCS-4 | |
| Cell strainer | BD Biosciences | 352340 | 40μm pore size |
| Conical tube (50mL) | Corning | 5-538-60 | |
| Coverslips | VWR international | 48366067 | |
| Cytokine bead array kits | Bio-Rad | Custom human kit | |
| Cytodex beads | Sigma-Aldrich | C3275 | |
| DPBS | GIBCO, by Life Technologies | 14190 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | ED-500G | Ethylenediaminetetraacetic acid |
| Epithelial specific antibody (ESA) | Chemicon International | CBL251 | Used at 1:50 dilution |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | GIBCO, by Life Technologies | 10438 | Heat inactivated |
| HARV (Disposable) | Synthecon | D-405 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | 37% |
| Involucrin antibody | Sigma-Aldrich | I 9018 | |
| Microscope slides | VWR international | 16004-368 | |
| MTT reagent | MP Biomedicals | 194592 | 3-(4,5-Dimethylthiazolyl 1-2)-2,5-Diphenyl Tetrazolium Bromide |
| MUC1 antibody (microscopy) | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | Sc-7313 | Used at 1:50 dilution |
| MUC1 antibody (flow cytometry) | BD Biosciences | 559774 | Also called CD227, use 20μL per test |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Diluted to 4% in DPBS |
| Petri dish (small) | BD Biosciences | 353002 | |
| Polystyrene tube with filter | BD Biosciences | 352235 | |
| Polystyrene flow tube | BD Biosciences | 352058 | |
| PR antibody | Dako | M3569 | Used at 1:100 dilution |
| ProLong Gold | Invitrogen | P36931 | Mounting media with DAPI |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74903 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | 71725 | |
| Sterilization pouch | VWR international | 11213-035 | |
| Stopcocks (one-way) | MedexSupply | MX5061L | |
| Syringe (10mL) | BD Biosciences | 309604 | Luer-lock tip |
| Syringe (5mL) | BD Biosciences | 309603 | Luer-lock tip |
| Trypan Blue | Invitrogen | T10282 | |
| Vp5 antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-13525 | HSV-2 antibody Clone 6F10; used at 1:5000 dilution |
References
- Herbst-Kralovetz, M. M., et al. Quantification and comparison of toll-like receptor expression and responsiveness in primary and immortalized human female lower genital tract epithelia. Am. J. Reprod. Immunol. 59 (3), 212-224 (2008).
- Hjelm, B. E., Berta, A. N., Nickerson, C. A., Arntzen, C. J., Herbst-Kralovetz, M. M. Development and characterization of a three-dimensional organotypic human vaginal epithelial cell model. Biol. Reprod. 82, 617-627 (2009).
- Bibliography of Research Publications [Internet]. , Synthecon. Houston, Texas. Available from: http://www.synthecon.com/bibliography.html (2012).
- Khaoustov, V. I., et al. Induction of three-dimensional assembly of human liver cells by simulated microgravity. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 35, 501-509 (1999).
- Papadaki, M., et al. Tissue engineering of functional cardiac muscle: molecular, structural, and electrophysiological studies. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 280, 168-178 (2001).
- Ishikawa, M., et al. Reconstitution of hepatic tissue architectures from fetal liver cells obtained from a three-dimensional culture with a rotating wall vessel bioreactor. J. Biosci. Bioeng. 111, 711-718 (2011).
- Carvalho, H. M., Teel, L. D., Goping, G., O'Brien, A. D. A three-dimensional tissue culture model for the study of attach and efface lesion formation by enteropathogenic and enterohaemorrhagic Escherichia coli. Cell Microbiol. 7, 1771-1781 (2005).
- Nickerson, C. A., et al. Three-dimensional tissue assemblies: novel models for the study of Salmonella enterica serovar Typhimurium pathogenesis. Infection and Immunity. 69, 7106-7120 (2001).
- Honer zu Bentrup, K., et al. Three-dimensional organotypic models of human colonic epithelium to study the early stages of enteric salmonellosis. Microbes Infect. 8, 1813-1825 (2006).
- Carterson, A. J., et al. A549 lung epithelial cells grown as three-dimensional aggregates: alternative tissue culture model for Pseudomonas aeruginosa pathogenesis. Infection and Immunity. 73, 1129-1140 (2005).
- Smith, Y. C., Grande, K. K., Rasmussen, S. B., O'Brien, A. D. Novel three-dimensional organoid model for evaluation of the interaction of uropathogenic Escherichia coli with terminally differentiated human urothelial cells. Infection and Immunity. 74, 750-757 (2006).
- Sainz, B., TenCate, V., Uprichard, S. L. Three-dimensional Huh7 cell culture system for the study of Hepatitis C virus infection. Virol J. 6, 103 (2009).
- Duray, P. H., et al. Invasion of human tissue ex vivo by Borrelia burgdorferi. J. Infect Dis. 191, 1747-1754 (2005).
- Margolis, L. B., et al. Lymphocyte trafficking and HIV infection of human lymphoid tissue in a rotating wall vessel bioreactor. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 13, 1411-1420 (1997).
- Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. Am. J. Hyg. 27, 493-497 (1938).
- Beer, B. E., et al. In vitro preclinical testing of nonoxynol-9 as potential anti-human immunodeficiency virus microbicide: a retrospective analysis of results from five laboratories. Antimicrob Agents Chemother. 50, 713-723 (2006).
- Hickey, D. K., Patel, M. V., Fahey, J. V., Wira, C. R. Innate and adaptive immunity at mucosal surfaces of the female reproductive tract: stratification and integration of immune protection against the transmission of sexually transmitted infections. J. Reprod. Immunol. 88, 185-194 (2011).
- Andersch-Bjorkman, Y., Thomsson, K. A., Holmen Larsson, J. M., Ekerhovd, E., Hansson, G. C. Large scale identification of proteins, mucins, and their O-glycosylation in the endocervical mucus during the menstrual cycle. Mol. Cell Proteomics. 6, 708-716 (2007).
- Barrila, J., et al. 3D cell culture models: Innovative platforms for studying host-pathogen interactions. Nature Reviews Microbiology. 8, 791-801 (2010).
- Vamvakidou, A. P., et al. Heterogeneous breast tumoroids: An in vitro assay for investigating cellular heterogeneity and drug delivery. J. Biomol Screen. 12, 13-20 (2007).
- Jin, F., et al. Establishment of three-dimensional tissue-engineered bone constructs under microgravity-simulated conditions. Artif Organs. 34, 118-125 (2010).
- Vertrees, R. A., et al. Development of a three-dimensional model of lung cancer using cultured transformed lung cells. Cancer Biol Ther. 8, 356-365 (2009).
- Hwang, Y. S., et al. The use of murine embryonic stem cells, alginate encapsulation, and rotary microgravity bioreactor in bone tissue engineering. Biomaterials. 30, 499-507 (2009).
- Pei, M., He, F., Kish, V. L., Vunjak-Novakovic, G. Engineering of functional cartilage tissue using stem cells from synovial lining: a preliminary study. Clin. Orthop Relat. Res. 466, 1880-1889 (2008).
