Summary
Cystometri är en effektiv teknik för att mäta urinblåsans funktion av små djur
Abstract
Protocol
1. Laboratory Animals
- Djur (möss, råttor) är inrymt i en specialiserad djur anläggning med en 12-timmars ljus-mörker-cykel och fri tillgång till vatten och vanliga pellets mat. Både ålder och kön hos djuren är viktiga parametrar som bör standardiseras efter behov. Vi utför vanligtvis cystometri i 10 till 12 veckor gamla hondjur 5,6.
- Samtliga djurförsök utförs i enlighet med Europeiska unionens Community rådets riktlinjer och godkänts av den lokala etiska kommittén.
2. Anestesi
- Isoflurananestesi används för att utföra små kirurgiska ingrepp, eftersom det är lätt att dosera på grund av dess korta halveringstid. Lämplig avgas sophantering är nödvändig när man använder isofluran.
- Djuren placeras i en sluten låda, gasas med isofluran 5% i rent syre (1 liter / minut).
- Efter induktion, anestesi vid lämplig lNivå bibehålls genom en liten mask (ett snitt 10 ml spruta) med 0,8 - 1 l / min syre med 1 - 1,5% av isofluran.
- För möss är uretananestesi används under funktionella inspelningar (jfr nedan). Uretan anestesi används vid funktionella inspelningar, eftersom i motsats till de flesta andra anestetika, är miktion reflexen inte undertryckas av denna anestesimedel 4. Uretan 1,2 g / kg kroppsvikt administreras subkutant (SC) 60 minuter före början av inspelningar. Om nödvändigt, kan dosen av uretan som behövs för att erhålla korrekt anestesi titreras genom administrering av ytterligare doser (0,1 g / kg) subkutant. Det bör noteras, emellertid, kan det ytterligare anestesi ändra tömningseffektiviteten och följaktligen miktionsfrekvens 7,8. Därför bör cystometriska inspelningar övervakas noggrant och kasseras när betydande avvikelser från kontroll beteendet observeras. Anestetika skall inte ges samtidigt provföreningar tillämpas för att undvika feltolkningar av data.
3. Kirurgisk Förfarande - Bladder Kateter Implantation
- Kirurgiska instrument steriliseras i en autoklav före användning. Raka buken hos djuret, desinficera med etanol 70% och utföra en låg mittlinje laparotomi för att exponera urinblåsan.
- Under ett kirurgiskt mikroskop, placera en handväska sträng sutur i urinblåsan kupolen med ett icke-absorberbara, monofilamentsutur (storlek 6-0).
- Gör en liten cystostomy (vi företrädesvis använda en 18 G nål) inuti väskan strängen och sätt en PE 50 polyetenkateter, med en liten manschett i slutet (erhålls genom försiktig uppvärmning slangen) genom detta hål. I våra händer, tunnare rör (PE 10) har en högre och mer varierande motstånd. Slangen kan desinficeras genom att sätta den i en etanol 70% lösning eller steriliseras i en autoklav. Före implantering bör slangen spolas med saltlösning.
- Säkra väskan strIng kring röret med en kirurgs knut. Dra katetern försiktigt utåt tills klockformade spets är placerad precis under suturen. Skjut en bit 18 G kateter mot suturen för att förhindra läckage.
- Infundera en liten volym saltlösning (100 - 200 ^) försiktigt för att kontrollera för läckor. Om läckor förekommer, bör ytterligare sutur placeras.
- Stäng magmusklerna med monofilamentsuturer, lämnar en passage för katetern i den övre delen av snittet.
- Tunnel röret till interskapulära regionen med en ihålig metallstav, förhindrar därigenom djuren att bita röret under experimentet.
- Huden är stängd med hjälp av icke-absorberbara, monofilament suturer. Den implanterade katetern spolas med saltlösning för att kontrollera dess permeabilitet.
- Innan djuren vaknar, är analgetika ges subkutant (buprenorfin, 0,05 mg / kg).
4. Installation och cystometri
- Beroende på den experimentella questipå (och de arter som används) cystometri utförs i vaken (återhållsamhet eller unrestraint) eller uretan-sövda djur. Medan cystometri är fullt möjligt i medvetna råttor, som tenderar att behålla lugnet i en återhållsam miljö, utför vi vanligtvis cystometri under uretananestesi (1,2 mg / kg, subkutant) när du använder möss 3,5,6,9.
- I sövda möss, är kroppstemperaturen ständigt övervakas och hölls vid 36,5 ° C ± 0,2 ° C med hjälp av en temperatursond och en värmelampa.
- Upplägget är kalibrerad före varje experiment enligt tillverkarens instruktioner.
- Den implanterade katetern är ansluten med en luer påbörjad till ett 3-vägs kran, som är ansluten till tryckgivaren (Edwards Lifesciences) på ena sidan och en infusionspump på den andra (Harvard Apparatus). Tryckgivaren är ansluten via en förstärkare (78534c bildskärm, Hewlett Packard) till datainsamlingssystemet (DI-730-USB, Dataq instrument) och ett samarbetemputer. Windaq / Lite kan användas för inspelning.
- Infusionspumpen startas, vilket möjliggör infusion av saltlösning eller PBS vid, till exempel, 100 pl / min (i råttor) eller 20 pl / min (i möss). Som sådan blåsan kommer att fyllas med en konstant hastighet, medan det intravesikala trycket registreras.
- Figur 5 visar en typisk tryck spår: under fluidinfusion, det sker en långsam tryckuppbyggnad i blåsan, tills en viss volym / tryck nås, miktion tröskelvärdet. När detta tröskelvärde har uppnåtts, kommer blåsan kontraktet och därefter urin sphincter öppnas tillåter passage av urin genom urinröret. Som sådan, är blåsan töms, kommer sammandragningen stannar och trycket sjunker igen till "basala" nivå.
- Eftersom råttan placeras i en metabolisk bur och ovanför en digital balans, kan den tömda volymen mätas samtidigt, ger information om den tömda volymen. På grund av de små annulleras volymer i mice, kan det vara mycket utmanande med detta system. Därför tömd volym bestämdes med användning små filterpapper vägs före och efter tömning.
- Typiskt, låter vi systemet jämvikta under 30 min, följt av en inspelning period av 30 minuter. Sedan kan läkemedel administreras systemiskt eller intravesikalt och ytterligare 30 minuter registreras.
- Inspelade data kan exporteras som. Csv-filer som kan importeras till en specialiserad mjukvara för kvantitativ analys. Vi använder vanligtvis Ursprung (OriginLab Corporation, MA, USA).
- Efter experiment, avlivas djuren genom cervikal dislokation (möss) eller CO 2 förgiftning (råttor).
5. Representativa resultat
Figur 1. Laparotomi översikt. A) Placera råttan i ryggläge. B) Raka och desinficera förbereda operationsområdet. C) snitt i huden. D) Snitt of magmusklerna och urinblåsan exponering.
Figur 2. En handväska sträng sutur.
Figur 3. Kateter implantering.
Figur 4. Tunnlar av katetern.
Exempel på tryckmätningar som erhållits under intravesikal perfusion av saltlösning i en medveten råtta och en sövd mus visas i figur 5. Flera parametrar kan extraheras från trycksignalen (t.ex. intercontractile intervallet baslinjen tryck och tröskeltrycket). För omfattande beskrivningar av dessa parametrar, se Andersson et al. (Ref 4) och Yoshiyama et al. ( ref 10).
Vi har nyligen använt cystometri att identifiera de molekylära målen av senapsolja (MO), en mycket reaktiv förening som har länge använts i experimentella modeller av inflammation och hyperalgesi av viscerala organ såsom urinblåsan 11,12. Intravesikal infusion av 10 mM MO inducerade en kraftig ökning av tömningsfrekvens (minskning av intercontractile intervall) i vildtyp möss (Figur 6A, B) och en minskning av tömd volym 6. Intressant, inducerade MO liknande förändringar i möss med brist på MO-receptorn TRPA1. Däremot inducerade MO mycket svagare förändringar i cystometriska parametrar i TRPV1 KO-möss än i WT möss och var utan någon effekt i Trpa1/Trpv1 KO möss. Tillsammans med mätningar av lanseringen av kalcitoningenrelaterad peptid (CGRP) 6, indikerar dessa data visar att TRPV1 kan spela en nyckelroll i viscerala irritation inducerad av MO.
ve_content ">
Figur 5. Representativa spår av intravesikalt tryck registrerades i en medveten honråtta (A) och i en sövd honmus (B). Den lägsta trycket definieras som "baslinje trycket" (röda pilar). Trycket vid slutet av fyllningsfasen är markerad med blå pilar. Volymen av vätska infunderas mellan dessa punkter, dividerat med tryckskillnaden, medger beräkning av efterlevnaden av blåsväggen (överensstämmelse = infunderade volymen / (tröskel tryck -. Utgångsläget tryck) Den "intercontractile intervall" (ICI) är tiden mellan två tömning sammandragningar.
Figur 6. Effekter av intravesikal tillämpning av senapsolja på cystometri mönster i vildtyp och Trpa1, TRPV1 och Trpa1/Trpv1 möss knockout.(A) Representativa exempel på intravesikala tryckförändringar inspelade i WT, Trpa1 KO, TRPV1 KO och Trpa1/Trpv1 KO-möss svar på infusion av saltlösning och 10 mM MO. (B) Tidsförlopp för den genomsnittliga momentana tömningsfrekvens före och under intravesikal infusion av MO. För alla möss var uppgifterna normaliseras till den genomsnittliga frekvensen erhålls under koksaltlösning infusion. Dessa data är anpassad från Everaerts et al. (Ref 6), med tillstånd från Elsevier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den cystometri Tekniken som presenteras här kan utföra in vivo mätningar av urinblåsans funktion i djurmodeller. Råttor är förmodligen den mest använda djurmodell. Möss är svårare att hantera, men erbjuder fördelen av att använda genetiskt manipulerade djur. På grund av tekniska svårigheter att använda medvetna möss, som tenderar att vara mycket aktiva leder lossnar den implanterade katetern och förändringar i buken påtryckningar som kan påverka intravesikalt tryck, rekommenderar vi att hålla dem bedövas med uretan under hela cystometri protokoll. Naturligtvis, fördelarna med att ha sederade möss bör vägas mot effekterna av anestetika. Som sådan, kan uretan ha en betydande inverkan på efter tömning restvolym 7,8. Vi väntar alltså tills vi har en stabil grad av anestesi, innan vi börjar våra inspelningar och insatser.
Forskare bör överväga than skillnader mellan manliga och kvinnliga gnagare urinering 13. Dessutom är djurens ålder av stor betydelse. Vi utför cystometri hos djur som är 10 till 12 veckor gamla. Alla försök skall utföras i en lugn miljö, speciellt när man använder medvetna djur. Ett antal infusionshastigheter har beskrivits för våra djurmodeller. Vi använder vanligtvis infusionshastigheter av 20 pl / min för möss och 100 pl / min för råttor.
Såsom nämnts ovan, urinering hos människor och gnagare skiljer sig väsentligt. Till exempel är ATP en viktig bidragsgivare till detrusorkontraktionen hos möss och råttor, medan människor är blåssammandragning, under fysiologiska förhållanden huvudsakligen förmedlas av acetylkolin 4. Men möjligheterna utföra invasiva mätningar som är allmänt avskräckande i det kliniska sammanhang och användningen av genetiskt modifierade djur, låt utforska de nuvarande gränserna för blåsan patofysiologi ettd. farmakologi. I detta avseende, har betydande framsteg gjorts nyligen erhållits i belysa rollen av muskarin 14, prostaglandin 15 och adrenerga receptorer 16, neuropeptider 17, Ca 2 +-aktiverad K +-kanaler 18 och TRP-kanalerna 3,5,6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats med bidrag från den belgiska federala regeringen (IUAP P6/28), för forskning Foundation-Flandern (FWO) (G.0565.07 och G.0686.09) har Astellas Europeiska fonden Award 2009 och Vetenskapsrådet för KU Leuven (GOA 2009/07, EF/95/010 och PFV/10/006). PU och vi är docs i Research Foundation-Flandern (FWO). MB är en Marie Curie-stipendiat. DDR en grundläggande-klinisk kamrat av FWO.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| urethane | Urethane, Sigma-Aldrich | 315419 | group 2B carcinogen |
| isoflurane | Isoba, Schering-Plough Animal Health | ||
| polyethylene catheter | Intramedic Polyethylene tubing PE50, Becton Dickinson | 427411 | |
| surgical microscope | Op-Mi 6, Carl Zeiss | Op-Mi 6 | |
| purse-string suture | Prolene 6/0, Ethicon | 8610H | |
| fascia and skin suture | Ethilon 4/0 or 5/0, Ethicon | 662G or 661G | |
| postoperative analgesics | Temgesic, Schering-Plough Animal Health | dosage for rats: 0.05 mg/kg | |
| amplifier | 78534c monitor, Hewlett Packard | ||
| analytical balances and balance data acquisition software | FZ 300i, A&D | FZ-300i | |
| infusion pumps | pump 33, Harvard apparatus | HA33 | |
| cystometry recording system | Dataq instruments, DI-730 series and Windaq/Lite | DI-730-USB Windaq/Lite | |
| temperature registration | Fluke 52 KJ thermometer | 52 KJ | |
| pressure transducers | Edwards Lifesciences, pressure monitoring set | T322247A |
References
- Everaerts, W., Gevaert, T., Nilius, B., De Ridder, D. On the origin of bladder sensing: Tr(i)ps in urology. Neurourol. Urodyn. 27, 264-2673 (2008).
- Fry, C. H. Animal models and their use in understanding lower urinary tract dysfunction. Neurourol. Urodyn. 29, 603-608 (2010).
- Gevaert, T. Deletion of the transient receptor potential cation channel TRPV4 impairs murine bladder voiding. J. Clin. Invest. 117, 3453-3462 (2007).
- Andersson, K. E., Soler, R., Fullhase, C. Rodent models for urodynamic investigation. Neurourol. Urodyn. 30, 636-646 (2011).
- Everaerts, W. Inhibition of the cation channel TRPV4 improves bladder function in mice and rats with cyclophosphamide-induced cystitis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 19084-19089 (2010).
- Everaerts, W. The capsaicin receptor TRPV1 is a crucial mediator of the noxious effects of mustard oil. Curr. Biol. 21, 316-321 (2011).
- Yoshiyama, M., Roppolo, J. R., Thor, K. B., de Groat, W. C. Effects of LY274614, a competitive NMDA receptor antagonist, on the micturition reflex in the urethane-anaesthetized rat. Br. J. Pharmacol. 110, 77-86 (1993).
- Yoshiyama, M., Roppolo, J. R., de Groat, W. C. Effects of MK-801 on the micturition reflex in the rat--possible sites of action. J. Pharmacol. Exp. Ther. 265, 844-850 (1993).
- Boudes, M. Functional Characterization of a Chronic Cyclophosphamide-Induced Overactive Bladder Model in mice. Neurourol. Urodyn. , (2011).
- Yoshiyama, M. Sex-related differences in activity of lower urinary tract in response to intravesical acid irritation in decerebrate unanesthetized mice. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 295, R954-R960 (2008).
- McMahon, S. B., Abel, C. A model for the study of visceral pain states: chronic inflammation of the chronic decerebrate rat urinary bladder by irritant chemicals. Pain. 28, 109-127 (1987).
- Du, S., Araki, I., Yoshiyama, M., Nomura, T., Takeda, M. Transient receptor potential channel A1 involved in sensory transduction of rat urinary bladder through C-fiber pathway. Urology. 70, 826-831 (2007).
- Streng, T., Santti, R., Talo, A. Similarities and differences in female and male rat voiding. Neurourol. Urodyn. 21, 136-141 (2002).
- Igawa, Y. Cystometric findings in mice lacking muscarinic M2 or M3 receptors. J. Urol. 172, 2460-2464 (2004).
- Schroder, A., Newgreen, D., Andersson, K. E. Detrusor responses to prostaglandin E2 and bladder outlet obstruction in wild-type and Ep1 receptor knockout mice. J. Urol. 172, 1166-1170 (2004).
- Chen, Q. Function of the lower urinary tract in mice lacking alpha1d-adrenoceptor. J. Urol. 174, 370-374 (2005).
- May, V., Vizzard, M. A. Bladder dysfunction and altered somatic sensitivity in PACAP-/- mice. J. Urol. 183, 772-779 (2010).
- Thorneloe, K. S., Meredith, A. L., Knorn, A. M., Aldrich, R. W., Nelson, M. T. Urodynamic properties and neurotransmitter dependence of urinary bladder contractility in the BK channel deletion model of overactive bladder. Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 289, 604-610 (2005).
