Summary
Endotheliale kolonievormende cellen (ECFCs) in omloop zijn endotheelcellen met robuuste klonale proliferatie potentieel dat intrinsieke weer te geven
Abstract
Sinds zeer lange tijd uitzicht op de vorming van nieuwe bloedvaten via angiogenese, vasculogenese en arteriogenese zijn onlangs beoordeeld 1. De aanwezigheid van circulerende endotheliale voorlopercellen (EPC's) werden voor het eerst geïdentificeerd in volwassen menselijke perifeer bloed door Asahara et al.. In 1997 2 het instellen van een infusie van nieuwe hypothesen en strategieën voor vasculaire regeneratie en reparatie. EPC's zijn zeldzaam, maar de normale componenten van het circulerende bloedvolume dat huis naar sites van bloedvatvorming of vasculaire remodellering, en grotendeels te vergemakkelijken of postnatale vasculogenese, angiogenese, of arteriogenese via paracriene stimulatie van de bestaande vaatwand afgeleide cellen 3. Er is geen specifieke marker om een EPC te identificeren is geïdentificeerd, en op dit moment de staat van het veld is om te begrijpen dat een groot aantal soorten cellen, waaronder proangiogenic hematopoietische stamcellen en progenitorcellen, circulerende angiogene cellen, Tie2 + monocyten, myeloïde progenitor cells, tumor geassocieerde macrofagen en M2 geactiveerde macrofagen deel stimuleren angiogene proces verscheidene preklinische diermodelsystemen en bij mensen in talrijke ziektetoestanden 4, 5. Endotheliale kolonievormende cellen (ECFCs) zijn zeldzaam circulerende levensvatbare endotheliale cellen kenmerkt zich door robuuste klonale proliferatie potentieel, secundaire en tertiaire kolonievormende mogelijkheid op opnieuw platen, en het vermogen om intrinsieke vormen in vivo schepen bij de transplantatie in immunodeficiënte muizen 6-8. Terwijl ECFCs zijn met succes geïsoleerd uit het perifere bloed van gezonde volwassen personen, navelstrengbloed (CB) van gezonde pasgeboren baby's, en de vaatwand van een groot aantal menselijke arteriële en veneuze vaten 6-9, CB bezit de hoogste frequentie van ECFCs 7 dat scherm de meest robuuste klonale proliferatieve potentieel en de vorm duurzaam en functioneel bloedvaten in vivo 8, 10-13. Hoewel de afleiding vanECFC volwassen perifeer bloed is ingediend 14, 15, hier de methoden voor het afleiden beschrijven klonen expansie en in vitro als in vivo karakterisering van ECFCs van het menselijk umbilical CB.
Protocol
Reagentia en oplossingen
EMG-2-media (Lonza, Cat. No cc-3162 met EBM-2 basismedium en EGM-2 SingleQuot kit Supplementen, en groeifactoren)
EBM-2 (Lonza, Cat. Nr. cc-3156) aangevuld door het hele SingleQuot kit aanvullingen en groeifactoren (Lonza, Cat. Nr. cc-4176), 10% (v / v) foetaal bovine serum (FBS) en 1% (v / v) penicilline (10.000 E / ml) / streptomycine (10.000 ug / ml) / amfotericine (25 ug / ml). Sla tot 1 maand bij 4 ° C. Aanbevolen EGM-2 volumes om te gebruiken voor ECFC cultuur zijn 500 ul / putje voor 24-putjes, 2 ml / goed voor 6-well platen, 5ml/25-cm 2 flessen, en 10 ml/75-cm 2 flessen, tenzij anders is bepaald in het protocol.
Collageen I oplossing
Verdun 0,575 ml ijsazijn (17.4N) in 495 ml steriel gedistilleerd water (0,02 N eindconcentratie). Steriel filter het verdund azijnzuur met een 0,22-um vacuum filtersysteem. Voeg 25 mg rattenstaart collageen I verdund azijnzuur tot een eindconcentratie van 50 ug / ml. De hoeveelheid collageen toegevoegd hangt af van het collageen voorraad concentratie. Sla tot een maand bij 4 ° C.
Bereiding van collageen I beklede weefselkweek oppervlakken
Plaats 1 ml van collageen I-oplossing in elk putje van een 6-en weefselkweek plaat (gebruik 300 ul / putje voor 24-putjes, 3ml/25-cm 2 flessen, en 8 ml/75-cm 2 flessen). Incubeer 1 uur overnacht bij 37 ° C. Verwijder het collageen I oplossing was oppervlak twee keer telkens met PBS (gebruik 500 ul / well van 24-putjes, 2 ml / putje 6-wells platen 5ml/25-cm 2 flessen en 10 ml/75 cm 2 kolven). Onmiddellijk gebruik maken van platen voor celculturen.
FACS kleuring buffer
Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) aangevuld met 2% (v / v) foetaal bovine serum (FBS). Store up 2 weken bij 4 ° C.
A. ECFC uitgroei, klonen en uitbreiding
- Verzamel CB met heparine (10 U heparine / ml bloed) of EDTA als antistollingsmiddel en het transport naar het laboratorium bij kamertemperatuur en direct (binnen 2 uur na levering kind) proces van het monster voor mononucleaire cellen (MNC) isolatie.
- Aliquot 15 ml CB in elke 50-ml conische centrifugebuis en voeg 20 ml PBS aan elke buis van CB en de pipet enkele malen om te mengen. Opstellen van 15 ml Ficoll-Paque in een 20 ml spuit en bevestig een 20G naald of canule mengen. Plaats het uiteinde van het mengen canule aan de onderzijde van de buis van verdund bloed en zorgvuldig ten grondslag 15 ml Ficoll-pague. Centrifugeer de buizen 30 min op 740 xg bij kamertemperatuur zonder vertraging rem.
- Met een transferpipet, verwijderen wazige laag van lage-dichtheid MDL zich aan het grensvlak tussen de Ficoll-Paque en verdund plasma. Breng de multinationals in een 50 ml conische buis containing 10 ml EGM-2 medium. Centrifugeer de MDL 10 min op 515 xg bij kamertemperatuur met een hoge vertraging rem.
- Voorzichtig zuigen en gooi het supernatant. Was de gepelleteerde cellen met EGM-2 twee keer (10 min bij 515 xg) en de multinationals opnieuw te schorten in EGM-2 op 1,25 x 10 7 cellen / ml. Bereid collageen I beklede 6-well weefselkweekplaten door 1 ml rat-tail collageen type I (50 ug / ml) per putje en het incuberen van de plaat gedurende de nacht. Pipetteer 4 ml van deze MNC suspensie in elk putje en de cellen in 37 plaats ° C, 5% CO2 bevochtigde incubator. A.1.5) Na 24 uur (dag 1) langzaam, de gebruikte medium (niet storen de los hechtende cellen) te verwijderen uit de put met een pipet, voeg langzaam 4 ml EGM-2 naar de bron, en terug te keren plaat aan de incubator . Op dag 2, vernieuwen het medium door het langzaam verwijderen van het medium (niet verstoren de los hechtende cellen) uit de put met een pipet en het toevoegen van 4 ml EGM-2 aan elke well. Herhaal het medium verandering dagelijkse until dag 7 en om de dag daarna tot ECFC kolonies verschijnen voor het klonen. Typisch kolonies verschijnen tussen dag 5 en dag 14 dagen 7 (fig. 1).
- Visualiseer typische ECFC kolonies met kasseien morfologie met behulp van omgekeerde microscoop (vergroting 10x) en markeer de kolonie grenzen met een stift aan de onderkant van de put om de positie van elke kolonie aan te geven.
- Op dag 14, was deze primaire kolonies 2 keer met PBS en oogst individuele kolonies met behulp van het klonen van cilinders en net genoeg TrypLE Express naar de cellen in de cilinders te dekken. Na het opzuigen van de laatste wasbeurt van PBS, plaats een steriele gel coating klonen cilinder rond elke kolonie en druk deze stevig tegen de plaat met behulp van een steriel pincet. Voeg 2-3 druppels warme TrypLE express in elke klonen cilinder en incubeer gedurende 3-5 minuten tot er cellen in de cilinder beginnen te los te maken. Voeg ongeveer 250 pi EGM-2 medium in het midden van de cilinder en pipetteren en neer te generate enkele celsuspensie. Breng de enkele celsuspensie van elke cilinder afzonderlijk het klonen van een individuele micro-centrifugebuis.
- Was het gebied binnen de cilinder 2-3 keer met ongeveer 250 ul EGM-2 medium om alle resterende cellen te verzamelen en overdragen van de wasbeurt van elke cilinder in de betreffende micro-centrifugebuis. Centrifugeer de cellen met hoge snelheid (≤ 300 xg) op tafelblad centrifuge gedurende 5 minuten.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de cel pellet in 1,5 ml verse EGM-2 medium. Breng de celsuspensie (waarin alle cellen van individuele kolonies) van elke buis in een putje van een 24-well weefselkweekplaten plaat vóórbekleed met 500 ul rat-staart collageen I (50 ug / ml).
- Plaats in de incubator voor uitbreiding met de media veranderen uitgevoerd om de andere dag.
- Wanneer de cellen te benaderen 80-90% confluentie, verwijder vervolgens de afgewerkte medium was de cellen 2 keer met PBS en voeg 500 ul TrypLE uitdrukkelijke medium in elk putjevan de 24-en weefselkweek plaat. Plaats de plaat in de incubator voor 3-5 minuten tot cellen beginnen af te ronden en los te maken. Voeg 1 ml EGM-2 (met 10% FBS gedefinieerd) aan elk putje om de cellen verzameld door wassen en ze naar een 15 ml buis. Was het goed met 1 ml EGM-2 medium om alle resterende cellen te verzamelen en over te dragen de was uit elk putje in de respectievelijke 15 ml buis. Centrifugeer de cellen bij 300 g gedurende 5 minuten.
- Verwijder het medium en resuspendeer de celpellet in 1 ml verse EGM-2 medium (met 10% gedefinieerd FBS). Het verkrijgen van de telling van levensvatbare cellen van een hoeveelheid met behulp van een hemacytometer en trypaanblauw uitsluiting.
- Vouw de cellen door het zaaien ongeveer 5000 cellen / cm 2 op een collageen I pre-coated weefselkweek oppervlakken in EGM-2-media met media te veranderen om de andere dag tot cellen te benaderen 80-90% confluentie voor sub-kweken opnieuw.
B. In vitro fenotypische karakterisatie van ECFCs: endotheel-oppervlakte-antigeen Expression eend Single Cell test voor Klonale Proliferatieve Potentiële
- Voor endotheelcellen oppervlakte-antigeen expressie, los cellen met TrypLE Express naar cellen te verzamelen met behulp van methoden beschreven voor het ECFC klonen en expansie.
- Opnieuw te schorten cellen in FACS kleuring buffer (10 X 10 6 cellen / 1 ml FACS kleuring buffer) dan FcR blokkerend reagens (20 ul / 10 X 10 6 cellen) toe te voegen, voorzichtig en plaats mengen op ijs gedurende 10 minuten.
- Aliquot 100 pi van deze celsuspensie in micro-centrifugebuis per endotheliale antigeen en isotype controles. Voeg juiste hoeveelheid fluorochroom gelabelde humane monoklonale antilichamen die endotheliale antigenen (CD31, CD144, CD146, CD105 en) of hematopoietische antigenen (CD45 en CD14) te herkennen en laat op ijs gedurende 30 minuten beschermd tegen licht. Let op: 1 X 10 6 cellen zijn niet vereist voor elke test. De auteurs gewoonlijk bereiden 0,5 tot 1 x 10 5 cellen / buis 2 X verkrijgen 10 4 analyserend evenementen. Ook gebeuren volgens de aanbevelingen van de hoeveelheid antilichaam wordt gebruikt voor iedere proef. Sommige antilichamen kunnen eisen titratie de optimale antilichaam concentratie te bepalen. Alle vlekken dat de auteurs hebben uitgevoerd zijn enkele kleur vlekken.
- Na 30 min incubatie op ijs, elke buis centrifugeren met hoge snelheid op een tafelblad centrifuge gedurende 5 minuten en verwijder het supernatant en resuspendeer de celpellet in FACS-buffer.
- Analyseren de monsters op een flowcytometer het percentage cellen dat positief of negatief vlek voor elke antigeenregel bepalen. ECFCs uniform positief kleuren voor CD31, CD144, CD146 en, maar negatief voor CD45 en CD14 vergeleken met de overeenkomstige isotype controles.
- Voor enkele cel-test om de klonale proliferatie mogelijkheden te onderzoeken, los te vroeg doorgang (2-3) cellen met TrypLE Express naar cellen te verzamelen met behulp van methoden vergelijkbaar met die werd beschreven voor ECFC klonen en expansie.
- Infect deze cellenmet verbeterde groen fluorescerend eiwit (EGFP) uitdrukken lentivirussen 16 en het verzamelen van cellen die EGFP met behulp van fluorescentie-cytometrie. Let op: Het werken met lentivirus wordt beschouwd als een biologisch gevaarlijk en alle bio-veiligheidsmaatregelen moeten worden gehoorzaamd.
- Cultuur ze als beschreven voor het kweken van ECFC in de rubriek voor ECFC expansie.
- Bereid collageen I beklede platen met 96 putjes door toevoeging van 50 pi rat-tail collageen type I (50 ug / ml) per putje en incubeer de plaat nacht. Verzamel de EGFP + ECFCs door gebruik te maken TrypLE express en resuspendeer ze in EGM-2 medium met eindconcentratie ~ 10 6 cellen / ml.
- Gebruik FACS Vantage (Becton Dickson) of andere vergelijkbare sorteerapparaat met laag debiet van 20 cellen / seconde tot een enkele EGFP + ECFC per putje van een 96-wells plaat sorteren en het uiteindelijke volume van 200 ul per putje met EGM-2. Gebruik een omgekeerde fluorescentie microscoop om ervoor te zorgen dat elk goed slechts een cel ontvangen. Alternatively, kunnen enkele cellen worden gesorteerd op basis van FSC en SSC en Sytox nucleaire kleurstof kleuren van de kolonies kan worden gebruikt voor cel scoren en kwantificering.
- Incubeer de plaat over een periode van twee weken met twee media veranderingen (200 ul EGM-2 met behulp van multichannel pipetter) uitgevoerd op dag 5 en dag 10. Op dag 14 cultuur, wassen elk putje met 100 ul PBS, alvorens de cellen met 100 pi 4% paraformaldehyde gedurende 30 minuten. Voor ECFCs die niet tot expressie EGFP toevoegen Sytox reagens, een groen fluorescerend nucleaire kleurstof na fixatie paraformaldehyde en incuberen bij 4 ° C geroerd.
- Gebruik van een fluorescentiemicroscoop aan elk putje onderzoeken aantal endotheelcellen uitgebreid van een cel gekweekt gedurende 14 dagen te kwantificeren. Voor de kwantitatieve analyse, score putten met 2 of meer endotheelcellen als positief (voor proliferatie) en ze verder te onderzoeken voor het totale aantal endotheelcellen door middel van visuele telling met de fluorescentie microscoop.
- Om t weer te gevenhij gegevens, putten verkregen met een endotheelcellen aantal: 2 tot 50, 51-2000, en 2001 of meer, worden beschouwd als: endotheelcellen clusters, lage proliferatieve potentiële (LPP)-ECFCs, en een hoge proliferatieve potentieel (HPP) - ECFCs respectievelijk. ECFCs vertonen volledige hiërarchie van klonale proliferatieve potentieel door die aanleiding geven tot endotheliale clusters, LPPs en HPPs wanneer gekweekt op een enkele cel niveau voor 14 dagen. 7
C. In vivo functionele karakterisering van ECFCs: In vivo bloedvatvorming Assay aan de ECFC potentieel van Vasculogenese Onderzoek
- Bereid cellularized gel implantaten door berekening van de totale volume (ml) van elk van de volgende gel (waarbij de uiteindelijke concentratie in de haakjes) nodig is om 1 ml gel (die later zal worden gesneden om twee implantaten genereren) werp FBS (10 %), EBM-2 10:01 (pas het eindvolume tot 1 ml), natriumbicarbonaat (1,5 mg / ml), NaOH (pH aangepast tot 7,4), HEPES (25 mM), fibronectin (100 ug / ml) en collageen I (1,5 mg / ml).
- Na gelmateriaal berekening los cellen met TrypLE Express naar cellen te verzamelen met behulp van methoden vergelijkbaar met die werd beschreven voor ECFC klonen en expansie. Zorg voor een telling van levensvatbare cellen van een hoeveelheid met behulp van een hemacytometer en trypaanblauw. Overdracht 2400000 levensvatbare cellen in een 50 ml-conische buis pellet de cellen door centrifugeren bij 515 xg kamertemperatuur. Tegelijkertijd bereiden gelmatrix oplossing door toevoeging berekend hoeveelheden HEPES, natriumbicarbonaat, EBM-2 10:1 FBS, fibronectine, collageen en een ijskoude 50 ml conische buis (in dezelfde volgorde als deze worden weergegeven). Meng goed en breng de pH op 7,4 met NaOH terwijl oplossing op ijs.
- Verwijder het supernatant van de cellen na het centrifugeren en het pellet opnieuw te schorten in 360 ul warme EGM-2 en deze toe te voegen pH 840 ul van gel matrix oplossing, waardoor het uiteindelijke volume van de gel implantaat 1 ml. Meng de cellen in gel matrix oplossing langzaam totcellen goed gesuspendeerd in de gel oplossing.
- Breng deze 1 ml cellularized gel suspensie naar een putje van een 12-well kultuur plaat en incubeer gedurende 20-30 min. totdat de gel polymeriseert. Voorzichtig dekking van de gel met 2 ml warm EGM-2 en incubeer overnacht.
- Vlak voor de implantatie, halveren van de 's nachts bebroede gel in twee gelijke stukken met behulp van iris schaar en breng de gel stukken om dezelfde cultuur putje met EGM-2 medium.
- Gebruik het dier chirurgische mogelijkheid om rustig van het dier (5-6 weken oud NOD / SCID muizen) door het toedienen isofluraananesthesie. Scheer het onderste deel van de buik en grondig de operatiewond schoon met alcohol pads en betadine of andere antiseptische. Dan isoleer het gebied met gordijnen als per IACUC en institutionele richtlijnen.
- Met behulp van steriele scherpe iris schaar tot een ongeveer 5 mm incisie te maken in de onderste kwadrant van de buik, waardoor de subcutane ruimte tussen de huid en de buikspieren. Voer stompe dissectie door de dermale laag van de buikspier naar een 15-20 mm breed zak leidt superieur in de bovenbuik kwadrant te creëren. Herhaal soortgelijke procedure soortgelijke open zak andere kant van dezelfde muis buik te maken.
- Steek een half stukje gel in een kant van de buik-zak en een half stukje gel in een andere kant van de buik-zak door het optillen van de huid laag net caudaal van de incisie.
- Na het inbrengen van gels, sluit de incisie met 2-3 steken met 5-0 polypropyleen hechtdraad op een snij-naald. Toepasselijk het etiket van de kooi-kaarten en het uitvoeren van post-operatieve monitoring en analgesie volgens de institutionele en het protocol eisen en kunnen 14 dagen voor cellen in deze geïmplanteerd gels om de novo vaatstelsel te genereren.
- Tot slot wordt het oogsten van gel implantaten meestal uitgevoerd 14 dagen na de implantatie na euthanasie de muis.
- Swab de buikstreek met alcohol pads enSnijd de buikhuid caudaal van de oorspronkelijke incisie lijn. Voorzichtig, ontleden van het implantaat door wegsnijden van een klep van de huid caudaal van de waarschijnlijke locatie van de gel. Accijnzen het implantaat door een vermindering van de omtrek rond de gel en breng vervolgens in zink fixatief (BD Biosciences, volg dan de fabrikant aanbevolen voor een optimaal resultaat) en hen in staat stellen op te lossen gedurende 1-2 uur bij kamertemperatuur.
- Bereid de paraffine ingebedde gels met standaard protocollen histochemische en bereid 5 pm secties op glasplaatjes met kleuring uit te voeren met hematoxyline en eosine, anti-humane CD31 of anti-muis CD31 het vaatstelsel in de gel te visualiseren. ECFCs ondergaan de novo vasculogenese van gehumaniseerde vaartuigen genereren in cellularized gel implantaten ingebracht in immunodeficiënte muizen gedurende 14 dagen 4,8,11.
D. representatieve resultaten
Met behulp van deze ECFC afleiding techniek die we hebben gezien out-groei van de primaire kolonie vormatie vanaf dag 5 (Fig. 1). De out-groei ECFC kolonies tentoongesteld typische kasseien uiterlijk en gaf aanleiding tot> 40 verdubbelingen bevolking op lange termijn groei na de kolonie pick-up door het klonen. Uitgebreide kolonies uitgedrukt endotheel-antigenen, maar niet ten hematopoietische antigenen (afb. 2). Belangrijk, toonden zij een volledige hiërarchie van klonale proliferatieve potentiaal een celniveau (Fig. 3). Bovendien ECFCs gevormd gehumaniseerd bloedvaten die geperfuseerd met gastheer RBC wanneer geïmplanteerd in immunodeficiënte muizen 4, 6, 8, 11 (afb. 4).
Figuur 1. Isolatie van mononucleaire cellen (MNC's) uit navelstrengbloed en de uitgroei van endotheliale kolonievormende cellen (ECFCs) van gekweekte multinationals. Multinationals vorm buffy coat laag tijdens Ficoll-pague dichtheidsgradiënt scheiding van navelstrengbloed cellen. Isolatie van buffy coat laag aan cultuur MNC's op de rat-tail collageen I gecoate platen resulteert in een uitloper van ECFC kolonie in 5 tot 14 dagen. De uitgroei ECFC kolonie (aangegeven met pijlpunten) weergegeven kasseien morfologie 7.
Figuur 2. Vertegenwoordiger in vitro fenotypische beoordeling van endotheel-en hematopoietische cellen oppervlakte-antigeen expressie. Immunofenotypering van van navelstrengbloed afgeleide ECFCs bleek dat ECFCs endotheliale antigenen CD31, CD34, CD144, CD146, Flt-1, Flk-1, Flt-4, en Nrp2 uitgedrukt, maar heeft zich niet hematopoietische antigenen CD45, CD14, CD11b, cKit, CXCR4 of AC133 7, 8.
Figuur 3. Vertegenwoordiger in vitro kwantificering van de Monogene en proliferatieve potentieel van CB afgeleid ECFCs. (A) navelstrengbloedAfgeleide ECFCs weer te geven klonale proliferatieve potentieel met een hiërarchie van kolonies, variërend van clusters van 2-50 cellen tot kolonies van> 2001. (B) microfoto van de hiërarchie van de kolonies (kolonies gekleurd met, Sytox, een groen fluorescerend nucleaire kleurstof tot een betere kwaliteit foto's te maken), verkregen na navelstrengbloed afgeleide ECFCs werden gekweekt op een enkele cel niveau voor 14 dagen. Schaal balk vertegenwoordigt 100 urn 7, 8.
Figuur 4. Vertegenwoordiger in vivo functionele karakterisering van van navelstrengbloed afgeleide ECFCs. A) H & E kleuring van navelstrengbloed afgeleide ECFC met cellularized gel implantaten aangegeven microvaatjes (gevuld met gastheer RBC's) de vorming van collageen-fibronectine gel na 14 dagen van de implantatie. B) Anti-menselijke CD31 kleuring (bruin kleuring) bevestigt verder de menselijke oorsprong van deze schepen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fenotypische en functionele karakterisering van vermeende endotheliale voorlopercellen is belangrijk om de bonafide ECFCs die in staat zijn klonaal en serieel re-plating in cultuur te identificeren en aanleiding geven tot duurzaam en functioneel implanteerbare bloedvaten in vivo. Human navelstrengbloed is verrijkt met ECFCs en de concentratie van deze circulerende cellen neemt af met het ouder worden of ziekte 10. Recente studies suggereren dat ECFC kan een belangrijke rol in vasculaire reparatie of herstel in situaties van schade aan de vaatwand, myocardinfarct of retinopathie 17-19 te spelen.
Hier we hebben beschreven eenvoudige en efficiënte methoden voor de afleiding klonen, uitbreiding in vitro als in vivo karakterisering van ECFCs van menselijke umbilical CB. Deze benaderingen onderzoekers in staat om te identificeren en te isoleren bonafide EPC's van CB die klonale proliferatieve potentieel en bezitten
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dr Yoder is consultant voor EndGenitor Technologies, Inc en lid van de raad van Rimedion Technologies, Inc
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heparin Sodium Injection, USP | APP Pharmaceuticals | 504031 | |
| Ficoll-Pague | Amersham | 17-1440-03 | |
| Mixing cannula | Maersk Medical | 500.11.012 | |
| EGM-2 | Lonza Inc. | CC-3162 | |
| Defined FBS | Hyclone | SH30070.03 | |
| TrypLE express | GIBCO, by Life Technologies | 12605 | |
| Rat type I collagen | BD Biosciences | 354236 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | |
| FcR Block | Miltenyi Biotec | 130-059-901 | |
| hCD31, FITC conjugated | BD Biosciences | 555445 | |
| hCD45, FITC conjugated | BD Biosciences | 555482 | |
| hCD14, FITC conjugated | BD Biosciences | 555397 | |
| hCD144, PE conjugated | eBioscience | 12-1449-80 | |
| hCD146, PE conjugated | BD Biosciences | 550315 | |
| hCD105, PE conjugated | Invitrogen | MHCD10504 | |
| Ms IgG1,k antibody, FITC conjugated | BD Biosciences | 555748 | |
| Ms IgG1,k antibody, PE conjugated | BD Biosciences | 559320 | |
| Ms IgG2a,k antibody, FITC conjugated | BD Biosciences | 555573 | |
| Anti-human CD31 | Dako | clone JC70/A | |
| Anti-mouse CD31 | BD Biosciences | 553370 | |
| 0.22-μm vacuum filtration system | EMD Millipore | SCGPU05RE | |
| Glacial acetic acid, 17.4N | Fisher Scientific | A38-500 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Invitrogen | 15240-062 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30070.03 | |
| IHC Zinc Fixative | BD Biosciences | 550523 | |
| Sytox green reagent | Invitrogen | S33025 | |
| Cloning cylinders, sterile | Fisher Scientific | 07-907-10 |
References
- Carmeliet, P., Jain, R. K. Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis. Nature. 473, 298-307 (2011).
- Asahara, T. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science. 275, 964-967 (1997).
- Urbich, C., Dimmeler, S. Endothelial progenitor cells: characterization and role in vascular biology. Circ. Res. 95, 343-353 (2004).
- Critser, P. J., Voytik-Harbin, S. L., Yoder, M. C. Isolating and defining cells to engineer human blood vessels. Cell. Prolif. 44, 15-21 (2011).
- Matthias, M., David, N., Josef, N. From bench to bedside: what physicians need to know about endothelial progenitor cells. Am. J. Med. 124, 489-4897 (2011).
- Ingram, D. A. Vessel wall-derived endothelial cells rapidly proliferate because they contain a complete hierarchy of endothelial progenitor cells. Blood. 105, 2783-276 (2005).
- Ingram, D. A. Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood. Blood. 104, 2752-2760 (2004).
- Yoder, M. C. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109, 1801-1809 (2007).
- Reinisch, A., Strunk, D. Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells (ECFCs. J. Vis. Exp. (32), e1525 (2009).
- Au, P. Differential in vivo potential of endothelial progenitor cells from human umbilical cord blood and adult peripheral blood to form functional long-lasting vessels. Blood. 111, 1302-135 (2008).
- Critser, P. J., Kreger, S. T., Voytik-Harbin, S. L., Yoder, M. C. Collagen matrix physical properties modulate endothelial colony forming cell-derived vessels in vivo. Microvasc. Res. 80, 23-30 (2010).
- Melero-Martin, J. M. Engineering robust and functional vascular networks in vivo with human adult and cord blood-derived progenitor cells. Circ. Res. 103, 194-202 (2008).
- Melero-Martin, J. M. In vivo vasculogenic potential of human blood-derived endothelial progenitor cells. Blood. 109, 4761-4768 (2007).
- Hofmann, N. A., Reinisch, A., Strunk, D. Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (32), e1524 (2009).
- Lin, Y., Weisdorf, D. J., Solovey, A., Hebbel, R. P. Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood. J. Clin. Invest. 105, 71-77 (2000).
- Witting, S. R. Efficient Large Volume Lentiviral Vector Production Using Flow Electroporation. Hum. Gene. Ther. , (2011).
- Yoon, C. H. Synergistic neovascularization by mixed transplantation of early endothelial progenitor cells and late outgrowth endothelial cells: the role of angiogenic cytokines and matrix metalloproteinases. Circulation. , 112-1618 (2005).
- Dubois, C. Differential effects of progenitor cell populations on left ventricular remodeling and myocardial neovascularization after myocardial infarction. J. Am. Coll. Cardiol. 55, 2232-2243 (2010).
- Medina, R. J., O'Neill, C. L., Humphreys, M. W., Gardiner, T. A., Stitt, A. W. Outgrowth endothelial cells: characterization and their potential for reversing ischemic retinopathy. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51, 5906-5913 (2010).
