Summary
الخلايا البطانية التي تشكل مستعمرة (ECFCs) تنتشر الخلايا البطانية مع احتمال قوي التكاثري نسيلي التي تعرض جوهري
Abstract
وقد تم منذ فترة طويلة وجهات النظر من جديد في الدم تشكيل السفينة عبر الأوعية الدموية، تكون الأوعية، وتخلق الشرايين مؤخرا بمراجعة 1. وحددت لأول مرة وجود تعميم الخلايا الاولية البطانية (EPCs) في الدم المحيطي الإنسان من قبل الكبار اساهارا وآخرون. في 1997 2 جلب ضخ فرضيات واستراتيجيات جديدة للتجديد وإصلاح الأوعية الدموية. EPCs هي مكونات طبيعية نادرة ولكن لتعميم الدم التي تضم مواقع لتكوين الأوعية الدموية أو إعادة تشكيل الأوعية الدموية، وتسهيل إما تكون الأوعية بعد الولادة، الأوعية الدموية، أو تخلق الشرايين الى حد كبير عن طريق تنشيط نظير الصماوي من جدار الوعاء الدموي القائم الخلايا المشتقة 3. لم يتم التعرف على علامة محددة لتحديد هوية EPC، وفي الوقت الحاضر حالة الحقل هو أن نفهم أن العديد من أنواع الخلايا الجذعية المكونة للدم بما في ذلك proangiogenic والخلايا الاولية، تعميم خلايا عائية، Tie2 + حيدات، النخاعي سل سلفليرة سورية، ورم الضامة المرتبطة بها، وM2 الضامة تنشيط المشاركة في حفز عملية عائية في مجموعة متنوعة من قبل السريرية نظم نموذج الحيوان والإنسان في المواد الدراسية في الحالات المرضية العديدة 4، 5. الخلايا البطانية التي تشكل مستعمرة (ECFCs) هي المتداولة قابلة للحياة نادرة الخلايا البطانية التي تتميز محتمل قوي التكاثري نسيلي، مستعمرة والثانوي والعالي تشكيل القدرة على replating، والقدرة على تكوين جوهري في أوعية الجسم الحي على زرع في الفئران العوز المناعي 6-8. في حين تم عزل ECFCs بنجاح من الدم المحيطي من المواضيع البالغين الأصحاء، دم الحبل السري (CB) للأطفال حديثي الولادة الأصحاء، وجدار الوعاء الدموي من السفن الإنسان العديد من الشرياني والوريدي 6-9، CB تمتلك أعلى تردد من ECFCs 7 أن العرض في أقوى المحتملة التكاثري نسيلي وشكل الأوعية الدموية الدائم وظيفية في الجسم الحي 8، 10-13. في حين أن اشتقاقوقد قدم ECFC من الدم المحيطي الكبار 14 و 15، ونحن هنا وصف منهجيات والاشتقاق، والاستنساخ، والتوسع، وفي المختبر وكذلك في توصيف المجراة من ECFCs من CB السري الإنسان.
Protocol
الكواشف وحلول
EMG-2 وسائل الاعلام (Lonza، القط. رقم CC-3162 التي تحتوي على EBM-2 متوسطة القاعدية وغير العادية-2 ملاحق عدة SingleQuot، وعوامل النمو)
EBM-2 (Lonza، القط. رقم CC-3156) تستكمل مع الملاحق SingleQuot طقم كامل وعوامل النمو (Lonza، القط. رقم CC-4176)، و 10٪ (V / V) الجنين مصل بقري (FBS) و 1٪ (V / V) البنسلين (10000 وحدة / مل) / الستربتومايسين (10000 ميكروغرام / مل) / الامفوتريسين (25 ميكروغرام / مل). تخزين ما يصل إلى 1 في شهر 4 درجة مئوية. وأوصت الجمعية العمومية غير العادية-2 وحدات التخزين لاستخدامها لثقافة ECFC هي 500 ميكروليتر / جيد لمدة 24 جيدا لوحات، 2 مل / جيدا لوحات 6-جيدا، وقوارير 5ml/25-cm 2، و 10 قوارير ml/75-cm 2، إلا إذا ينص على خلاف ذلك في البروتوكول.
الكولاجين أنا حل
تمييع 0.575 مل من حمض الخليك الجليدي (17.4N) في 495 مل من الماء المقطر المعقم (0.02 N تركيز النهائي). معقم مرشح للحمض الخل المخفف مع بطالة 0.22 ميكرون،uum نظام الترشيح. إضافة 25 ذيل فأر الكولاجين ملغ من الأول إلى حامض الخليك المخفف في لتركيز النهائي من 50 ميكروغرام / مل. واضاف كمية الكولاجين وسوف تختلف تبعا لتركيز مخزون الكولاجين. تخزين ما يصل الى شهر واحد في 4 درجة مئوية.
إعداد I-المغلفة الكولاجين السطوح زراعة الأنسجة
مكان 1 مل من محلول أنا الكولاجين في كل بئر من لوحة زراعة الأنسجة 6-جيدا (استخدام 300 ميكروليتر / جيد لمدة 24 جيدا لوحات، وقوارير 3ml/25-cm 2، و 8 قوارير ml/75-cm 2). احتضان 1 ساعة ليلة وضحاها في 37 درجة مئوية. إزالة الكولاجين أنا حل ويغسل سطح مرتين، كل مرة مع برنامج تلفزيوني (استخدم 500 ميكروليتر / جيد لمدة 24 جيدا لوحات، 2 مل / جيدا لوحات 6-جيدا، وقوارير 5ml/25-cm 2، وml/75 10 سم 2 قوارير). استخدام لوحات على الفور الحصول على مزارع الخلايا.
FACS تلطيخ العازلة
الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) تستكمل مع 2٪ (V / V) الجنين مصل بقري (FBS). مخزن شص إلى 2 أسابيع في 4 درجات مئوية.
A. ECFC ثمرة، الاستنساخ والتوسع
- جمع CB مع الهيبارين (10 يو الهيبارين / دم مل) أو EDTA بوصفها مضادة للتخثر والنقل إلى المختبر في درجة حرارة الغرفة وعلى الفور (في حدود 2 ساعة من الولادة الرضيع) عملية العينة للخلية وحيدات النوى (متعددة الجنسيات) العزلة.
- قسامة 15 مل من CB في كل أنبوب 50 مل الطرد المركزي مخروطي الشكل وإضافة 20 مل من برنامج تلفزيوني على كل أنبوب من المرات CB وماصة عدة لخلط. وضع 15 مل Ficoll-Paque إلى حقنة من 20 مل ونعلق إبرة 20G أو قنية الاختلاط. وضع غيض من قنية خلط في الجزء السفلي من أنبوب من الدم المخفف والأساس الذي تقوم عليه بدقة 15 مل Ficoll-Pague. منبذة الأنابيب و 30 دقيقة في 740 XG، في درجة حرارة الغرفة، من دون تباطؤ وضع الفرامل.
- باستخدام ماصة نقل، وإزالة طبقة ضبابية من منخفض الكثافة الشركات المتعددة الجنسيات الموجودة في واجهة بين البلازما Ficoll-Paque والمخففة. الاستغناء عن الشركات المتعددة الجنسيات الى تابع 50 مل أنبوب مخروطيaining 10 مل EGM-2 المتوسط. أجهزة الطرد المركزي ال 10 دقيقة في الشركات المتعددة الجنسيات 515 XG، في درجة حرارة الغرفة، مع تحديد التباطؤ فرامل عالية.
- نضح بعناية وتجاهل طاف. غسل الخلايا مكعبات مع EGM-2 مرتين (10 دقائق في 515 XG)، واعادة تعليق على الشركات المتعددة الجنسيات في EGM-2 على 1.25 X 10 7 خلية / مل. إعداد الكولاجين أنا المغلفة زراعة الأنسجة 6-جيدا لوحات وذلك بإضافة 1 مل نوع الكولاجين بذنب الفأر أنا (50 ميكروغرام / مل) لكل بئر واحتضان لوحة بين عشية وضحاها. ماصة 4 مل من هذا التعليق في كل الشركات متعددة الجنسيات بشكل جيد ووضع الخلايا في 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 حاضنة مرطب. A.1.5) بعد 24 ساعة (يوم 1)، وإزالة ببطء وسيلة أمضى (لا تخل الخلايا الملتصقة فضفاضة) من البئر مع ماصة، إضافة ببطء 4 مل EGM-2 إلى البئر، والعودة إلى لوحة الحاضنة . في يوم 2، وتحديث والمتوسطة من خلال إزالة ببطء المتوسط (لا تخل الخلايا الملتصقة فضفاضة) من البئر مع ماصة، وإضافة 4 مل EGM-2 إلى كل بئر. كرر المتوسطة التغيير اليومي للامم المتحدةسمسم يوم 7 و كل يوم آخر حتى بعد ذلك المستعمرات ECFC تظهر للاستنساخ. وعادة ما تظهر المستعمرات بين يوم 5 و 14 يوما يوم 7 (الشكل 1).
- تصور المستعمرات ECFC نموذجي مع مورفولوجيا حصوه باستخدام مجهر مقلوب (التكبير 10x)، وعلامة على الحدود مع مستعمرة علامة على الجانب السفلي من البئر للإشارة إلى موقف كل مستعمرة.
- في اليوم 14، وغسل هذه المستعمرات الأولية 2 مرات مع برنامج تلفزيوني والمستعمرات حصاد الفردية باستخدام اسطوانات الاستنساخ ويكفي TrypLE صريحة لتغطية خلايا داخل الاسطوانات. بعد الشفط والغسيل النهائي من برنامج تلفزيوني، وضع اسطوانة جل معقم استنساخ المغلفة حول كل مستعمرة واضغط بشدة ضد لوحة باستخدام ملقط معقم. أضف 2-3 قطرات من التعبير عن TrypLE الحارة إلى كل اسطوانة الاستنساخ واحتضان لمدة 3-5 دقائق حتى الخلايا داخل اسطوانة تبدأ في فصل. إضافة ما يقرب من 250 متوسطة EGM-2 ميكروليتر في مركز الاسطوانة وماصة صعودا وهبوطا إلى زenerate وحيد الخلية تعليق. نقل تعليق خلية واحدة من كل اسطوانة على حدة الاستنساخ في أنبوب الطرد المركزي الصغيرة الفردية.
- غسل المنطقة في حدود الوقت 2-3 اسطوانة مع ما يقرب من 250 متوسطة EGM-2 ميكروليتر لجمع كل الخلايا المتبقية ونقل الغسيل من كل أسطوانة في أنبوب الطرد المركزي الصغيرة منها. منبذة الخلايا بسرعة عالية (≤ 300 x ج) في أجهزة الطرد المركزي الطاولة لمدة 5 دقائق.
- إزالة طاف وإعادة تعليق بيليه خلية في 1.5 مل المتوسطة EGM-2 الطازجة. نقل تعليق الخلية (التي تحتوي على كافة الخلايا من المستعمرات الفردية) من كل أنبوب إلى بئر واحدة من لوحة زراعة الأنسجة 24-جيدا قبل المغلفة مع 500 ميكرولتر أنا الكولاجين الجرذ الذيل (50 ميكروغرام / مل).
- مكان داخل الحاضنة للتوسع مع وسائل الإعلام تغيير يؤديها كل يوم.
- عندما نقترب خلايا 80-90٪ confluency، إزالة متوسط إنفاق ثم غسل الخلايا 2 مرات مع برنامج تلفزيوني وإضافة 500 ميكروليتر المتوسطة TrypLE صريحة إلى كل بئرمن 24 جيد نسيج لوحة الثقافة. وضع لوحة داخل الحاضنة لمدة 3-5 دقائق حتى تبدأ الخلايا في جمع وفصل. إضافة 1 مل من الجمعية العمومية غير العادية-2 (مع 10٪ تعريف FBS) على كل بئر لجمع الخلايا عن طريق غسل ونقلها إلى أنبوب 15 مل. يغسل جيدا مع 1 مل المتوسطة-2 الجمعية العمومية غير العادية لجمع كل الخلايا المتبقية ونقل الغسيل من كل بئر في كل أنبوب 15 مل. منبذة الخلايا في 300 XG لمدة 5 دقائق.
- إزالة المتوسطة وإعادة تعليق بيليه خلية في 1 مل المتوسطة EGM-2 الطازجة (مع 10٪ FBS محددة). الحصول على عدد خلايا قابلة للحياة من قسامة باستخدام عدادة الكريات والتريبان الاستبعاد الزرقاء.
- توسيع الخلايا عن طريق بذر حوالي 5000 خلية / سم 2 في الصعود إلى الكولاجين أنا زراعة الأنسجة قبل المغلفة السطوح في وسائل الاعلام-2 غير العادية مع وسائل الاعلام تتغير كل يوم آخر حتى الاقتراب خلايا 80-90٪ confluency قبل زراعة الصحراء مرة أخرى.
B. في توصيف المظهري من المختبر ECFCs: غشائي المستضد السطحي التعبير خليةد فحص خلية واحدة لإمكانية التكاثري نسيلي
- لسطح الخلية البطانية التعبير مستضد، فصل الخلايا مع TrypLE صريحة لجمع الخلايا باستخدام أساليب وصفها لاستنساخ ECFC والتوسع.
- اعادة تعليق الخلايا في عازلة تلطيخ FACS (10 X 10 6 خلية / FACS 1ml تلطيخ عازلة) ثم يضاف كاشف FCR حجب (20 ميكروليتر / 10 X 10 خلايا 6)، ومزيج بلطف ومكان على الجليد لمدة 10 دقيقة.
- قسامة 100 ميكروليتر من هذا التعليق خلية في الدقيقة أنبوب الطرد المركزي لكل المستضد السطحي البطانية والضوابط isotype. إضافة كمية مناسبة من الأجسام المضادة البشرية وحيدة النسيلة ملون تألقي المسمى التي تعترف المستضدات البطانية (CD31، CD144، CD146، وCD105) أو المستضدات المكونة للدم (CD45، و CD14)، وترك على الجليد لمدة 30 دقيقة محمية من الضوء تحذير: 1 × 10 6 خلايا ليست مطلوبة في كل اختبار. الكتاب يعد عادة 0،5-1 X 10 5 خلية / أنبوب للحصول على 2 X 10 4 تحليلأحداث د. أيضا، اتبع توصية الشركة المصنعة لكمية من الأجسام المضادة لاستخدامها في كل اختبار. قد تتطلب بعض الأجسام المضادة titrating لتحديد تركيز الضد الأمثل. جميع تلطيخ أن الكتاب كان أداء هي واحدة تلطيخ اللون.
- بعد 30 دقيقة من حضانة على الجليد، وأجهزة الطرد المركزي كل أنبوب بسرعة عالية في جهاز للطرد المركزي الطاولة لمدة 5 دقائق ثم إزالة طاف واعادة تعليق الخلية بيليه في عازلة نظام مراقبة الأصول الميدانية.
- تحليل العينات على تدفق عداد الكريات لتحديد نسبة الخلايا التي صمة عار سلبا أو إيجابا على كل مستضد. ECFCs صمة عار موحد إيجابية لCD144، CD31، و CD146، ولكن سلبية على CD45 و CD14 بالمقارنة مع الضوابط isotype المقابلة.
- لفحص خلية واحدة للنظر في إمكانية نسيلي التكاثري، فصل مرور في وقت مبكر (2-3) مع خلايا TrypLE صريحة لجمع الخلايا باستخدام أساليب مماثلة لتلك التي وصفت لاستنساخ ECFC والتوسع.
- تصيب هذه الخلاياويعتبر العمل مع الفيروسة البطيئة 1 بيولوجية، وينبغي أن يطاع جميع الاحتياطات السلامة البيولوجية: مع بروتين الفلورية الخضراء المعززة (EGFP) معربا عن lentiviruses 16 و جمع الخلايا معربا عن EGFP بواسطة الخلوي مضان الحذر.
- ثقافة لهم كما هو موضح لECFC زراعة في القسم للتوسع ECFC.
- إعداد الكولاجين أنا المغلفة 96-جيدا لوحات من خلال إضافة 50 ميكرولتر نوع الكولاجين الجرذ الذيل أنا (50 ميكروغرام / مل) لكل جيدا واحتضان لوحة ليلة وضحاها. جمع + ECFCs EGFP باستخدام TrypLE صريحة وresuspend لهم في الجمعية العمومية غير العادية-2 متوسطة مع تركيز نهائي ~ 10 6 خلية / مل.
- استخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية الفضل (بيكتون ديكسون) أو فارز أخرى مماثلة مع معدل تدفق منخفض من 20 خلية / 2 لفرز واحد EGFP + ECFC لكل بئر من لوحة 96-جيدا، وضبط حجم الصوت النهائي الى 200 ميكروليتر لكل بئر مع EGM-2. استخدام المجهر المقلوب مضان للتأكد من أن كل بئر تلقى خلية واحدة فقط. البديلهإيلي، يمكن فرز الخلايا واحدة على أساس FSC والتعاون بين بلدان الجنوب وSytox النووية صبغ تلطيخ يمكن استخدامها في المستعمرات عن التهديف خلية النوعي والكمي.
- احتضان لوحة على مدى اسبوعين مع التغييرات وسائل الإعلام 2 (200 ميكروليتر EGM-2 pipetter الأقنية باستخدام) التي أجريت على يوم 5 و 10 أيام. في يوم 14 من الثقافة، وغسل كل بئر مع 100 PBS ميكرولتر قبل تحديد الخلايا مع 100 ميكرولتر من بارافورمالدهيد 4٪ لمدة 30 دقيقة. لECFCs التي لم يتم التعبير عن EGFP، إضافة Sytox كاشف، صبغة خضراء النووية الفلورسنت، وبعد تثبيت لامتصاص العرق، واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية.
- استخدام المجهر مضان لدراسة كل بئر إلى quantitate عدد الخلايا البطانية التي توسعت من خلية واحدة تربيتها لمدة 14 يوما. عن التحليل الكمي، والآبار درجة مع 2 أو أكثر من الخلايا البطانية بأنها إيجابية (لانتشار) ودراستها لمزيد من مجموع عدد خلايا البطانية عن طريق العد البصرية مع مضان المجهر.
- لعرض تيحصل على بيانات والآبار مع عدد من الخلايا البطانية: من 2 إلى 50، و 51-2000، و 2001 أو أكثر، وتعتبر على النحو التالي: مجموعات الخلايا البطانية، وإمكانات التكاثري منخفضة (LPP)-ECFCs، وإمكانات عالية التكاثري (سكان المرتفعات) - ECFCs على التوالي. ECFCs يحمل التسلسل الهرمي الكامل للإمكانات التكاثري نسيلي من قبل مما أدى إلى مجموعات البطانية، LPPs، وعندما HPPs مثقف على مستوى خلية واحدة لمدة 14 يوما. 7
C. في توصيف وظيفي المجراة من ECFCs: في الجسم الحي سفينة الفحص تشكيل لتفحص احتمالات نجاح هذه ECFC لتكون الأوعية
- إعداد غرسات هلام cellularized عن طريق حساب الحجم الكلي (مل) من كل من المواد التالية هلام (مع تركيز النهائية في قوس) اللازمة للادلاء 1 مل هلام (وسيتم في وقت لاحق الذي شطر لتوليد 2 يزرع): FBS (10 ٪)، EBM-2 10:01 (ضبط مستوى الصوت النهائي إلى 1 مل)، وبيكربونات الصوديوم (1.5 ملغ / مل)، هيدروكسيد الصوديوم (ضبط درجة الحموضة إلى 7.4)، HEPES (25 ملم)، fibronectiن (100 ميكروغرام / مل)، والكولاجين الأول (1.5 ملغ / مل).
- بعد حساب المواد هلام، وفصل الخلايا مع TrypLE صريحة لجمع الخلايا باستخدام أساليب مماثلة لتلك التي وصفت لاستنساخ ECFC والتوسع. الحصول على عدد خلايا قابلة للحياة من قسامة باستخدام عدادة الكريات والأزرق التريبان. نقل 2400000 خلايا قابلة للحياة في أنبوب ML-مخروطي 50 و بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 515 XG، درجة حرارة الغرفة. في وقت واحد، وإعداد جيل حل المصفوفة بإضافة كميات محسوبة من HEPES، بيكربونات الصوديوم، 10:01 EBM-2، FBS، فبرونيكتين، والكولاجين لالمثلج أنبوب 50 مل مخروطي الشكل (في نفس الترتيب كما تم سردها). مزيج دقيق وضبط درجة الحموضة إلى 7.4 مع هيدروكسيد الصوديوم مع الحفاظ على حل على الجليد.
- تجاهل طاف من الخلايا بعد الطرد المركزي وإعادة تعليق بيليه في 360 ميكروليتر دافئ 2-الجمعية العمومية غير العادية، وأنه إضافة إلى تعديل درجة الحموضة 840 ميكرولتر من حل مصفوفة هلام، مما يجعل حجم النهائي مل هلام 1 الزرع. خلط الخلايا في حل مصفوفة هلام ببطء حتىوعلقت تماما الخلايا في حل هلام.
- نقل هذا الجل cellularized 1 مل تعليق واحد جيد من لوحة زراعة الأنسجة 12-جيدا واحتضان لمدة 20-30 دقيقة حتى الجل polymerizes. تغطية بلطف الجل مع 2 مل دافئ 2-EGM واحتضان بين عشية وضحاها.
- مباشرة قبل غرس، شطر الجل بين عشية وضحاها المحتضنة في اثنين قطع متساوية باستخدام مقص القزحية وتعود القطع هلام لنفس الثقافة التي تحتوي كذلك الجمعية العمومية غير العادية-2 المتوسط.
- استخدام مرفق حيوان جراحية لحيوان ورزين (5-6 الاسبوع القديمة NOD / الفئران SCID) من قبل ادارتها التخدير isoflurane. حلاقة الجزء السفلي من البطن وتنظيف شامل لموقع الجراحية مع منصات الكحول وbetadine أو مطهر آخر. ثم عزل المنطقة مع الستائر وفقا لمبادئ توجيهية IACUC والمؤسسية.
- استخدام معقم مقص حاد قزحية إلى إجراء شق ما يقرب من 5 مم في الجزء الأسفل من رباعي من البطن، ويعرض الفضاء تحت الجلد بين الجلد والعضلات في منطقة البطن. أداء صريحا، من خلال تشريح طبقة الجلد من عضلات البطن، لخلق جيب واسعة 15-20 ملم مما أدى إلى رباعي متفوقة في أعلى البطن. تكرار إجراء مماثل لخلق جيب مفتوحة مماثلة في جانب آخر من البطن الماوس نفسه.
- أدخل قطعة واحدة من نصف هلام إلى جانب واحد من جيب في البطن وآخر قطعة من نصف جل في جانب آخر من جيب في البطن من خلال رفع طبقة الجلد الذيلية فقط إلى شق.
- بعد الإدراج من المواد الهلامية، وإغلاق كل شق 2-3 مع غرز خياطة 5-0 باستخدام مادة البولي بروبيلين في إبرة عدة قطاعات. تسمية مناسب بطاقات قفص، وتأدية ما بعد الجراحة والرصد والتسكين وفقا لمتطلبات المؤسسية والبروتوكول والسماح 14 يوما للخلايا في هذه المواد الهلامية مزروع لتوليد دي نوفو الأوعية الدموية.
- أخيرا، حصاد من غرسات هلام ويجري في العادة 14 يوما بعد الزرع بعد euthanizing الماوس.
- مسحة منطقة البطن مع منصات الكحول وقطع الجلد في منطقة البطن الذيلية إلى خط شق الأصلي. بعناية، تشريح خارج عملية الزرع بواسطة استئصال رفرف من الذيلية الجلد إلى المكان الذي يحتمل من هلام. استئصال زرع عن طريق خفض محيطي حول الجل ثم في مكان مثبت الزنك دينار بحريني (العلوم البيولوجية، اتبع توصية الشركة الصانعة لأفضل النتائج)، والسماح لهم لإصلاح لمدة 1-2 ساعات في درجة حرارة الغرفة.
- إعداد المواد الهلامية جزءا لا يتجزأ من البارافين باستخدام بروتوكولات النسيجية القياسية وإعداد 5 أقسام ميكرومتر على الشرائح الزجاجية لأداء تلطيخ مع هيماتوكسيلين ويوزين، ومكافحة CD31 الإنسان أو مكافحة فأر CD31 لتصور الأوعية الدموية داخل الجل. ECFCs الخضوع دي نوفو تكون الأوعية لتوليد الأوعية أنسنة في cellularized غرسات هلام إدراجها في الفئران العوز المناعي لمدة 14 يوما 4،8،11.
D. الممثل النتائج
باستخدام هذه التقنية الاشتقاق ECFC لاحظناه من النمو من شكل مستعمرة الابتدائيةأوجه في وقت مبكر يوم 5 (الشكل 1). معارضها خارج نمو المستعمرات ECFC نموذجي مظهر حصوه، وأدت إلى> الأضعاف 40 عدد السكان على المدى الطويل بعد توسيع مستعمرة صغيرة عن طريق الاستنساخ. وأعرب المستعمرات الموسع مستضدات البطانية، لكنه لم يعرب عن المستضدات المكونة للدم (الشكل 2). الأهم من ذلك، عرضها التسلسل الهرمي الكامل للإمكانات التكاثري نسيلي على مستوى خلية واحدة (الشكل 3). وعلاوة على ذلك، شكلت ECFCs الأوعية الدموية أنسنة التي perfused مع كرات الدم الحمراء المضيف عند زرعها في الفئران العوز المناعي 4، 6، 8، 11 (الشكل 4).
الشكل 1. عزل الخلايا وحيدات النوى (الشركات المتعددة الجنسيات) من دم الحبل السري، وثمرة من مستعمرة تشكيل الخلايا البطانية (ECFCs) من الشركات المتعددة الجنسيات مثقف شكل الشركات المتعددة الجنسيات. طبقة معطف بوفي خلال Ficoll-Pague الفصل المتدرج الكثافة من خلايا دم الحبل السري. العزلة من طبقة معطف بوفي إلى الشركات المتعددة الجنسيات على ثقافة الفئران الذيل الكولاجين أنا المغلفة لوحات النتائج في ثمرة مستعمرة ECFC في 5 إلى 14 يوما. مستعمرة ECFC ثمرة (المشار إليها من قبل رؤساء السهم) عرض مورفولوجيا حصوه 7.
الشكل 2. وكشف ممثل في المختبر تقدير المظهري من البطانية والمكونة للدم خلية سطح مستضد التعبير. المناعي الظاهري من ECFCs الدم المستمدة من الحبل السري الذي ECFCs أعرب عن مستضدات البطانية CD31، CD34، CD144، CD146، FLT-1، FLK-1، FLT-4، ولكن Nrp2 لم يبد المستضدات المكونة للدم CD45، CD14، CD11b، cKit، CXCR4 أو AC133 7 و 8.
الشكل 3. ممثل في المختبر لتحديد الكميات مولد الرمع والمحتملة التكاثري من CB ECFCs المشتقة. (أ) دم الحبل السريالمستمدة من ECFCs عرض محتمل التكاثري نسيلي مع تسلسل هرمي من المستعمرات التي تتراوح بين مجموعات من الخلايا يصل إلى 2-50 مستعمرات> 2001. (ب) الميكروسكوب من التسلسل الهرمي من المستعمرات (المستعمرات ملطخة، Sytox، أخضر صبغ فلوري النووية لالتقاط صور ذات جودة أفضل) التي تم الحصول عليها بعد دم الحبل المستمدة تم زرعها ECFCs على مستوى خلية واحدة لمدة 14 يوما. شريط مقياس يمثل 100μm 7 و 8.
الشكل 4. ممثل في توصيف وظيفي المجراة من ECFCs حبل المشتقة من الدم. أ) H & E تلطيخ من دم الحبل السري المستمدة أشار ECFC تحتوي على غرسات هلام cellularized microvessel (كرات الدم الحمراء مليئة المضيف) في تشكيل الكولاجين فبرونيكتين هلام بعد 14 يوما من الزرع. ب) المضادة للتلطيخ الإنسان CD31 (تلطيخ البني) يؤكد كذلك على أصل الإنسان من هذه السفن.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
التوصيف المظهري والوظيفية من المفترض الخلايا الاولية البطانية من المهم التعرف على ECFCs حسن النية التي هي قادرة على clonally متسلسل وإعادة الطلاء في الثقافة، وتؤدي إلى دائم والأوعية الدموية وظيفية للزرع في الجسم الحي. وأثرى البشرية دم حبل السرة مع ECFCs وتركز هذه الانخفاضات الخلايا المنتشرة مع الشيخوخة أو المرض 10. الدراسات الحديثة تشير الى ان ECFC قد تلعب دورا هاما في إصلاح الأوعية الدموية أو تجديد في حالات إصابة الأوعية الدموية، واحتشاء عضلة القلب، أو اعتلال الشبكية 17-19.
هنا، التي وصفناها منهجيات بسيطة وفعالة للاشتقاق، والاستنساخ، والتوسع، وفي المختبر وكذلك في توصيف المجراة من ECFCs من CB السري الإنسان. هذه النهج تمكين الباحثين من تحديد وعزل EPCs حسن النية من CB التي تملك إمكانات والتكاثري نسيلي
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
الدكتور يودر هو استشاري لتقنيات EndGenitor، المؤتمر الوطني العراقي وعضو في مجلس إدارة شركة Rimedion، تقنيات
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heparin Sodium Injection, USP | APP Pharmaceuticals | 504031 | |
| Ficoll-Pague | Amersham | 17-1440-03 | |
| Mixing cannula | Maersk Medical | 500.11.012 | |
| EGM-2 | Lonza Inc. | CC-3162 | |
| Defined FBS | Hyclone | SH30070.03 | |
| TrypLE express | GIBCO, by Life Technologies | 12605 | |
| Rat type I collagen | BD Biosciences | 354236 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | |
| FcR Block | Miltenyi Biotec | 130-059-901 | |
| hCD31, FITC conjugated | BD Biosciences | 555445 | |
| hCD45, FITC conjugated | BD Biosciences | 555482 | |
| hCD14, FITC conjugated | BD Biosciences | 555397 | |
| hCD144, PE conjugated | eBioscience | 12-1449-80 | |
| hCD146, PE conjugated | BD Biosciences | 550315 | |
| hCD105, PE conjugated | Invitrogen | MHCD10504 | |
| Ms IgG1,k antibody, FITC conjugated | BD Biosciences | 555748 | |
| Ms IgG1,k antibody, PE conjugated | BD Biosciences | 559320 | |
| Ms IgG2a,k antibody, FITC conjugated | BD Biosciences | 555573 | |
| Anti-human CD31 | Dako | clone JC70/A | |
| Anti-mouse CD31 | BD Biosciences | 553370 | |
| 0.22-μm vacuum filtration system | EMD Millipore | SCGPU05RE | |
| Glacial acetic acid, 17.4N | Fisher Scientific | A38-500 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Invitrogen | 15240-062 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30070.03 | |
| IHC Zinc Fixative | BD Biosciences | 550523 | |
| Sytox green reagent | Invitrogen | S33025 | |
| Cloning cylinders, sterile | Fisher Scientific | 07-907-10 |
References
- Carmeliet, P., Jain, R. K. Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis. Nature. 473, 298-307 (2011).
- Asahara, T. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science. 275, 964-967 (1997).
- Urbich, C., Dimmeler, S. Endothelial progenitor cells: characterization and role in vascular biology. Circ. Res. 95, 343-353 (2004).
- Critser, P. J., Voytik-Harbin, S. L., Yoder, M. C. Isolating and defining cells to engineer human blood vessels. Cell. Prolif. 44, 15-21 (2011).
- Matthias, M., David, N., Josef, N. From bench to bedside: what physicians need to know about endothelial progenitor cells. Am. J. Med. 124, 489-4897 (2011).
- Ingram, D. A. Vessel wall-derived endothelial cells rapidly proliferate because they contain a complete hierarchy of endothelial progenitor cells. Blood. 105, 2783-276 (2005).
- Ingram, D. A. Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood. Blood. 104, 2752-2760 (2004).
- Yoder, M. C. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109, 1801-1809 (2007).
- Reinisch, A., Strunk, D. Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells (ECFCs. J. Vis. Exp. (32), e1525 (2009).
- Au, P. Differential in vivo potential of endothelial progenitor cells from human umbilical cord blood and adult peripheral blood to form functional long-lasting vessels. Blood. 111, 1302-135 (2008).
- Critser, P. J., Kreger, S. T., Voytik-Harbin, S. L., Yoder, M. C. Collagen matrix physical properties modulate endothelial colony forming cell-derived vessels in vivo. Microvasc. Res. 80, 23-30 (2010).
- Melero-Martin, J. M. Engineering robust and functional vascular networks in vivo with human adult and cord blood-derived progenitor cells. Circ. Res. 103, 194-202 (2008).
- Melero-Martin, J. M. In vivo vasculogenic potential of human blood-derived endothelial progenitor cells. Blood. 109, 4761-4768 (2007).
- Hofmann, N. A., Reinisch, A., Strunk, D. Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (32), e1524 (2009).
- Lin, Y., Weisdorf, D. J., Solovey, A., Hebbel, R. P. Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood. J. Clin. Invest. 105, 71-77 (2000).
- Witting, S. R. Efficient Large Volume Lentiviral Vector Production Using Flow Electroporation. Hum. Gene. Ther. , (2011).
- Yoon, C. H. Synergistic neovascularization by mixed transplantation of early endothelial progenitor cells and late outgrowth endothelial cells: the role of angiogenic cytokines and matrix metalloproteinases. Circulation. , 112-1618 (2005).
- Dubois, C. Differential effects of progenitor cell populations on left ventricular remodeling and myocardial neovascularization after myocardial infarction. J. Am. Coll. Cardiol. 55, 2232-2243 (2010).
- Medina, R. J., O'Neill, C. L., Humphreys, M. W., Gardiner, T. A., Stitt, A. W. Outgrowth endothelial cells: characterization and their potential for reversing ischemic retinopathy. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51, 5906-5913 (2010).
