Summary
Cellules endothéliales formant colonie (CPEF) sont les cellules endothéliales circulantes avec robuste potentiel prolifératif clonal qui affichent intrinsèque
Abstract
Vues de longue date de la formation de nouveaux vaisseaux sanguins par l'intermédiaire d'angiogenèse, vasculogenèse, et artériogenèse ont été récemment passé en revue 1. La présence de progéniteurs endothéliaux circulants (PEC) ont d'abord été identifié chez l'adulte le sang périphérique humain par Asahara et al. En 1997 2 portant une perfusion de nouvelles hypothèses et les stratégies de régénération et de réparation vasculaire. EPC sont des éléments rares, mais normale de la circulation du sang qui abrite des sites de formation de vaisseaux sanguins ou le remodelage vasculaire, et de faciliter soit la vasculogenèse postnatale, l'angiogenèse, ou artériogenèse largement via la stimulation paracrine de paroi de la cuve existante cellules dérivées 3. Aucun marqueur spécifique pour identifier un CBE a été identifié, et à l'heure actuelle l'état du champ est de comprendre que de nombreux types cellulaires, y compris pro-angiogénique souches hématopoïétiques et des cellules progénitrices, les cellules circulantes angiogéniques, Tie2 + de monocytes, cel progéniteur myéloïdels, les macrophages tumorales associées, et M2 macrophages activés participer à stimuler le processus angiogénique dans une variété de précliniques systèmes de modèles animaux et chez des sujets humains dans plusieurs états pathologiques 4, 5. Cellules endothéliales formant colonie (CPEF) sont rares en circulation des cellules endothéliales viables caractérisés par robuste potentiel prolifératif clonale, une colonie secondaire et tertiaire à la capacité à former des replacage, et sa capacité à former intrinsèque dans les vaisseaux in vivo sur la transplantation dans des souris immunodéficientes 6-8. Alors que CPEF ont été isolées avec succès à partir du sang périphérique de sujets adultes en bonne santé, le sang du cordon ombilical (CB) de la santé des nouveau-nés, et paroi de la cuve de nombreux humains vaisseaux artériels et veineux 6-9, CB possède la plus grande fréquence des CPEF 7 que l'affichage le plus robuste possible clonale proliférative et la forme des vaisseaux sanguins durables et fonctionnelle in vivo 8, 10-13. Alors que la dérivation deECFC à partir du sang périphérique adulte a été présenté 14, 15, ici, nous décrivons les méthodes pour la dérivation, le clonage, l'expansion, et in vitro ainsi que dans la caractérisation in vivo de CPEF du cordon ombilical humain CB.
Protocol
Réactifs et solutions
EMG-2 médias (Lonza, No. de cat. Cc-3162 contenant EBM-2 milieu de base et EGM-2 Suppléments kit SingleQuot, & facteurs de croissance)
EBM-2 (Lonza, No. de cat. Cc-3156) complétées par des suppléments entiers kit SingleQuot et facteurs de croissance (Lonza, No. de cat. Cc-4176), 10% (v / v) de sérum bovin fœtal (FBS) et 1% (v / v) la pénicilline (10000 U / ml) / streptomycine (10000 g / ml) / amphotéricine (25 pg / ml). Stockez jusqu'à 1 mois à 4 ° C. Recommandées EGM-2 volumes à utiliser pour la culture ECFC sont de 500 pl / puits pour plaques à 24 puits, 2 ml / puits pour les plaques à 6 puits, les 5ml/25-cm 2 flacons, et 10 ml/75-cm 2 flacons, sauf si indication contraire dans le protocole.
Collagène de type I solution
Diluer 0,575 ml d'acide acétique glacial (17.4N) dans 495 ml d'eau distillée stérile (0,02 N concentration finale). Filtre stérile de l'acide acétique dilué avec un aspirateur de 0,22 umSystème de filtration uum. Ajouter 25 collagène de queue de rat mg I à l'acide acétique dilué à une concentration finale de 50 pg / ml. La quantité de collagène ajoutée varie en fonction de la concentration de stock de collagène. Stockez jusqu'à un mois à 4 ° C.
Préparation de collagène I surfaces revêtues de culture de tissus
Placer 1 ml de collagène de type I solution dans chaque puits d'une plaque à 6 puits de culture de tissus (utiliser 300 pl / puits pour plaques à 24 puits, des 3ml/25-cm 2 flacons, et 8 ml/75-cm 2 flacons). Incuber 1 heure à une nuit à 37 ° C. Retirez le collagène de type I solution et laver la surface deux fois, chaque fois avec du PBS (500 ul utiliser / bien pour plaques à 24 puits, 2 ml / puits pour les plaques à 6 puits, les 5ml/25-cm 2 flacons, et de 10 ml/75 -cm2). Utilisez des assiettes immédiatement pour les cultures cellulaires.
Tampon de coloration FACS
Tampon phosphate salin (PBS) additionné de 2% (v / v) de sérum bovin fœtal (FBS). Magasin up à 2 semaines à 4 ° C.
A. ECFC excroissance, le clonage et l'expansion
- Recueillir CB avec de l'héparine (10 U d'héparine / ml de sang) ou de l'EDTA comme anticoagulant et le transport au laboratoire à température ambiante et immédiatement (dans les 2 heures suivant l'accouchement du nourrisson) processus de l'échantillon pour des cellules mononucléaires (MNC) d'isolement.
- Aliquoter 15 ml de CB dans chaque tube de 50 ml à centrifuger conique et ajouter 20 ml de PBS à chaque tube de fois CB et la pipette plusieurs pour mélanger. Dessiner une hausse de 15 ml de Ficoll-Paque dans une seringue de 20 ml et fixer une aiguille 20G ou d'une canule de mélange. Placer l'extrémité de la canule de mélange au fond du tube de sang dilué et soigneusement sous-tendaient 15 ml de Ficoll-Pague. Centrifuger les tubes 30 min à 740 xg, à la température ambiante, sans le réglage du frein de décélération.
- En utilisant une pipette de transfert, retirer la couche brumeuse de faible densité multinationales situé à l'interface entre le plasma Ficoll-Paque et dilué. Distribuer les multinationales dans un cont 50 ml tube coniqueAining 10 ml EGM-2 moyennes. Centrifuger les multinationales 10 min à 515 xg, à la température ambiante, avec un réglage du frein forte décélération.
- Aspirer soigneusement et jeter le surnageant. Laver les cellules granulées avec EGM-2 à deux reprises (10 min à 515 xg) et remettre en suspension les multinationales dans EGM-2 à 1,25 x 10 7 cellules / ml. Préparer collagène I revêtues des plaques 6 puits de culture de tissus en ajoutant 1 ml de queue de rat collagène de type I (50 pg / ml) par puits et incuber la plaque pendant la nuit. Introduire à la pipette 4 ml de cette suspension de MNC dans chaque puits et placer les cellules à 37 ° C, 5% de CO 2 incubateur humidifié. A.1.5) Après 24 heures (jour 1), retirer lentement du milieu usé (ne pas déranger les cellules faiblement adhérentes) à partir du puits avec une pipette, ajouter lentement 4 ml EGM-2 pour le bien, et retourner la plaque dans l'incubateur . Le jour 2, rafraîchissement du milieu par le milieu en enlevant lentement (ne pas déranger les cellules faiblement adhérentes) à partir du puits avec une pipette et en ajoutant 4 ml EGM-2 dans chaque puits. Répétez le milieu changement quotidien de l'ONUtil 7 jours et tous les autres jours par la suite jusqu'à colonies ECFC apparaissent pour le clonage. Typiquement les colonies apparaissent entre les jours 5 et 14 jours 7 (Fig. 1).
- Visualisez colonies typiques ECFC avec la morphologie pavés en utilisant un microscope inversé (grossissement 10x) et marquer les limites des colonies avec un marqueur sur la face inférieure du puits pour indiquer la position de chaque colonie.
- Au jour 14, lavez ces colonies primaires 2 fois avec du PBS et les colonies de récolte individuelles utilisant des cylindres de clonage et juste assez TrypLE expresse pour couvrir les cellules à l'intérieur des cylindres. Après aspiration du lavage final de PBS, placer un cylindre enduit de clonage gel stérile autour de chaque colonie et appuyer fermement sur la plaque à l'aide de pinces stériles. Ajouter 2-3 gouttes d'eau tiède TrypLE expresse dans chaque cylindre de clonage et incuber pendant 3-5 min jusqu'à ce que les cellules au sein du cylindre commencent à se détacher. Ajouter environ 250 pl moyen AGE-2 dans le centre du cylindre et pipeter de haut en bas à generate suspension cellulaire unique. Transférer la suspension cellulaire unique de chaque cylindre séparément dans le clonage d'un individu micro-tube à centrifuger.
- Laver la zone à l'intérieur des cylindres 2-3 fois avec environ 250 pi EGM-2 à moyen et à recueillir toutes les cellules restantes et de transférer le lavage de chaque cylindre dans le micro-centrifugeuse respective tube. Centrifuger les cellules à grande vitesse (≤ 300 g) sur centrifugeuse de paillasse pendant 5 min.
- Eliminer le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans 1,5 ml frais EGM-2 moyennes. Transférer la suspension cellulaire (contenant toutes les cellules provenant de colonies individuelles) de chaque tube dans un puits d'une plaque de 24 puits de culture de tissus pré-enduit avec 500 uL de collagène de queue de rat I (50 pg / ml).
- Place à l'intérieur de l'incubateur de l'expansion avec les médias changent effectué tous les deux jours.
- Lorsque les cellules approcher 80-90% de confluence, retirez le support passé, puis laver les cellules 2 fois avec du PBS et ajouter 500 ul TrypLE expresse à moyen et à chaque puitsde 24 et plaque de culture tissulaire. Mettre la plaque dans l'incubateur pendant 3-5 min jusqu'à ce que les cellules commencent à rassembler et à se détacher. Ajouter 1 ml de l'AGE-2 (avec 10% défini FBS) à chaque puits pour recueillir les cellules par lavage et de les transférer à un tube de 15 ml. Bien laver le avec 1 ml EGM-2 à moyen et à recueillir toutes les cellules restantes et de transférer le lavage de chaque puits en tube de 15 ml respective. Centrifuger les cellules à 300 xg pendant 5 min.
- Retirez le support et remettre en suspension le culot cellulaire dans 1 ml frais EGM-2 moyennes (avec 10% de FBS défini). Procurez-vous le nombre de cellules viables d'une aliquote utilisant un hématimètre et exclusion au bleu trypan.
- Développer les cellules par l'ensemencement d'environ 5000 cellules par cm 2 sur un collagène de type I pré-enduits surfaces de culture de tissus dans EGM-2 médias avec les médias changent tous les jours jusqu'à ce que les cellules approcher 80-90% de confluence avant le sous-culture à nouveau.
B. In vitro Caractérisation phénotypique des CPEF: Endothelial expression de l'antigène de surface cellulaire uned analyse cellulaire unique pour potentiel prolifératif clonale
- Pour l'expression antigène de cellule endothéliale de surface, détacher les cellules avec TrypLE expresse pour recueillir des cellules en utilisant des méthodes décrites pour le clonage ECFC et d'expansion.
- Re-suspendre les cellules de la coloration tampon FACS (10 x 10 6 cellules / FACS 1ml coloration tampon) puis ajouter réactif FcR de blocage (20 pi / 10 x 10 6 cellules), mélanger doucement et le lieu sur la glace pendant 10 min.
- Aliquote de 100 ul de cette suspension cellulaire en micro-centrifugeuse tube pour chaque antigène de surface endothéliale et les contrôles isotypiques. Ajouter la quantité appropriée de fluorochromes étiquetés anticorps monoclonaux humains qui reconnaissent les antigènes endothéliaux (CD31, CD144, CD146, CD105 et) ou des antigènes hématopoïétiques (CD45, et CD14) et de laisser sur la glace pendant 30 min abri de la lumière. Attention: 1 x 10 6 cellules ne sont pas requis pour chaque test. Les auteurs généralement préparer 0,5 à 1 X 10 5 cellules / tube pour obtenir 2 x 10 4 analyserévénements d. En outre, suivre la recommandation du fabricant pour la quantité d'anticorps pour être utilisé pour chaque test. Certains anticorps peuvent exiger titrage pour déterminer la concentration d'anticorps optimal. Tout coloration que les auteurs ont effectué des taches de couleur unique.
- Après 30 min d'incubation sur la glace, centrifuger chaque tube à haute vitesse sur une centrifugeuse de paillasse pendant 5 min, puis enlever le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans du tampon FACS.
- Analyser les échantillons sur un cytomètre de flux pour déterminer le pourcentage de cellules qui tache positivement ou négativement pour chaque antigène. CPEF tache uniformément positive pour CD31, CD144, CD146 et, mais négatif pour le CD45 et CD14 par rapport aux contrôles isotypiques correspondants.
- Pour le dosage seule cellule d'examiner le potentiel prolifératif clonal, détachez passage précoce (2-3) avec des cellules TrypLE expresse pour recueillir des cellules en utilisant des méthodes similaires à qui a été décrit pour le clonage ECFC et d'expansion.
- Infecter ces cellulesavec renforcement de la protéine fluorescente verte (EGFP) exprimant lentivirus 16 et de recueillir des cellules exprimant l'EGFP par cytométrie en fluorescence. Attention: Travailler avec des lentivirus est considéré comme un danger biologique et toutes les précautions de sécurité biologique doivent être respectées.
- Culture eux comme décrit pour ECFC culture dans la section pour l'expansion ECFC.
- Préparer collagène de type I enduits plaques à 96 puits en ajoutant 50 pl de type collagène de queue de rat I (50 pg / ml) par puits et incuber la plaque pendant la nuit. Recueillir les EGFP + CPEF en utilisant TrypLE expresse et les remettre en suspension dans l'EGM-2 moyennes avec une concentration finale ~ 10 6 cellules / ml.
- Utilisez FACS Vantage (Becton Dickson) ou d'autres trieuse comparable à faible débit de 20 cellules / seconde à trier un seul EGFP + ECFC par puits d'une plaque de 96 puits et ajuster le volume final à 200 ul par puits avec EGM-2. Utiliser un microscope inversé à fluorescence afin de s'assurer que chaque bien reçu une seule cellule. AlternativEly, des cellules individuelles peuvent être triées en fonction de FSC et SSC et Sytox nucléaire colorant coloration des colonies peuvent être utilisés pour la notation et la quantification des cellules.
- Incuber la plaque sur une période de deux semaines avec les changements de supports deux (200 pi EGM-2 pipetteur multicanaux à l'aide) effectuées sur les jours 5 et 10. Au jour 14 de la culture, se laver chaque puits avec 100 ul de PBS avant de fixer les cellules avec 100 pl de paraformaldéhyde 4% pendant 30 min. Pour CPEF qui ne sont pas exprimant l'EGFP, ajouter réactif Sytox, un colorant fluorescent vert nucléaire, après la fixation de paraformaldéhyde et incuber à 4 ° C pendant la nuit.
- Utilisez un microscope à fluorescence pour examiner chaque puits pour quantifier le nombre de cellules endothéliales qui ont élargi à partir d'une seule cellule en culture pendant 14 jours. Pour l'analyse quantitative, les puits marquer avec 2 ou plusieurs cellules endothéliales comme positif (à la prolifération) et les examiner plus avant pour le nombre de cellules endothéliales totale par comptage visuel avec le microscope à fluorescence.
- Pour afficher til a obtenu des données, les puits avec un nombre de cellules endothéliales de: 2 à 50, 51 à 2000, et 2001 ou plus, sont considérés comme: amas de cellules endothéliales, faible potentiel prolifératif (LPP)-CPEF, et à fort potentiel prolifératif (HPP) - CPEF respectivement. CPEF présentent hiérarchie complète du potentiel prolifératif clonal en donnant naissance à des grappes endothéliales, PPR, et quand elle est cultivée HPPS à un niveau unique cellule pendant 14 jours 7.
C. In vivo caractérisation fonctionnelle des CPEF: En essai de formation in vivo de navire à examiner le potentiel ECFC pour vasculogenèse
- Préparer les implants en gel cellularized en calculant le volume total (en ml) de chacun des matériaux suivants gel (avec la concentration finale dans la parenthèse) nécessaire pour lancer de 1 ml de gel (qui sera plus tard divisée en deux pour générer 2 implants): FBS (10 %), EBM-2 10:1 (ajuster le volume final de 1 ml) de bicarbonate de sodium (1,5 mg / ml), NaOH (ajuster le pH à 7,4), HEPES (25 mM), fibronectin (100 pg / ml), et le collagène I (1,5 mg / ml).
- Après le calcul matériau de gel, détacher les cellules avec TrypLE expresse pour recueillir des cellules en utilisant des méthodes similaires à qui a été décrit pour le clonage ECFC et d'expansion. Procurez-vous un comptage des cellules viables d'une aliquote utilisant un hématimètre et bleu trypan. Transfert de 2,4 millions de cellules viables dans un 50 ml-conique du tube et le culot des cellules par centrifugation à 515 xg, la température ambiante. En même temps, préparer la solution de matrice de gel en ajoutant des volumes calculés de HEPES, bicarbonate de sodium, EBM-2 10:1, FBS, la fibronectine, collagène et à un glacée de 50 ml tube conique (dans le même ordre tels qu'ils sont énumérés). Mélanger soigneusement et ajuster le pH à 7,4 avec NaOH tout en gardant une solution sur de la glace.
- Jeter le surnageant des cellules après centrifugation et remettre en suspension le culot dans 360 ul chaude EGM-2 et de l'ajouter à pH ajusté 840 pi de solution de matrice de gel, ce qui rend le volume final de 1 ml d'implant de gel. Mélanger les cellules dans une solution matrice de gel lentement jusqu'à ce queles cellules sont complètement mis en suspension dans la solution de gel.
- Transférer cette suspension à 1 ml de gel cellularized à un puits d'une plaque de 12 puits de culture de tissu et laisser incuber pendant 20-30 min jusqu'à ce que le gel polymérise. Couvrir soigneusement le gel avec 2 ml chaude EGM-2 et incuber pendant la nuit.
- Immédiatement avant l'implantation, couper en deux le gel durant la nuit incubé en deux parties égales l'aide de ciseaux iris et de retourner les morceaux de gel à la même culture et contenant EGM-2 moyennes.
- Utilisez l'animalerie chirurgicale pour endormir l'animal (5-6 semaine vieilles souris NOD / SCID) par l'administration anesthésie à l'isoflurane. Rasez la partie inférieure de l'abdomen et bien nettoyer le site chirurgical avec des tampons d'alcool et la bétadine ou un autre antiseptique. Puis isoler la zone avec des rideaux, conformément aux directives du IACUC et institutionnel.
- En utilisant des ciseaux pointus stériles iris de faire une incision d'environ 5 mm dans le quadrant inférieur de l'abdomen, ce qui expose l'espace sous-cutané entre la peau et des muscles abdominaux. Effectuer émoussée-dissection à travers la couche cutanée de la musculature abdominale pour créer une poche de 15 à 20 mm de large menant supérieure dans le quadrant supérieur abdominale. Répétez la procédure similaire pour créer similaire poche ouverte dans un autre côté de l'abdomen de la souris même.
- Insérer une seule pièce de la moitié de gel dans un côté de poche abdominale et une autre pièce de la moitié de gel dans un autre côté de la poche abdominale en soulevant la couche dermique juste en aval de la incision.
- Après l'insertion de gels, fermez chaque incision avec 2-3 points de suture à l'aide 5-0 polypropylène sur une aiguille de coupe. Marquer de façon approprié les cartes cage et effectuer le suivi post-opératoire et de l'analgésie selon les exigences institutionnelles et protocole et prévoir 14 jours pour les cellules de ces gels implantés afin de générer de novo vasculaire.
- Enfin, la récolte des implants en gel de est généralement effectuée 14 jours après l'implantation après l'euthanasie de la souris.
- Nettoyer la zone abdominale avec des tampons d'alcool et decouper la peau abdominale caudale à la ligne d'incision initiale. Soigneusement, disséquer l'implant en excisant un lambeau de la peau caudale de l'emplacement probable du gel. D'accise de l'implant en coupant la circonférence autour du gel puis placer dans un fixateur de zinc (BD Biosciences, suivez les recommandations du fabricant pour des résultats optimaux) et de leur permettre de fixer pendant 1-2 heures à température ambiante.
- Préparer les gels inclus en paraffine en utilisant des protocoles standard de histochimiques et de préparer 5 sections um sur des lames de verre pour réaliser une coloration à l'hématoxyline et l'éosine, anti-humain CD31 ou anti-souris CD31 pour visualiser la vascularisation au sein du gel. CPEF subir de novo vasculogenèse pour générer navires humanisés dans cellularized implants en gel de insérés dans des souris immunodéficientes pendant 14 jours 4,8,11.
D. des résultats représentatifs
Grâce à cette technique de dérivation ECFC nous avons observé sur la croissance de la forme primaire colonietion dès le jour 5 (Fig. 1). Les colonies à croissance ECFC exposées aspect pavimenteux typique et a donné lieu à 40 doublements de population> lors de l'expansion à long terme après ramassage colonie par clonage. Colonies étendues exprimé antigènes endothéliaux, mais n'a pas exprimer des antigènes hématopoïétiques (Fig. 2). Surtout, ils ont fait preuve d'une hiérarchie complète de potentiel prolifératif clonale au niveau de la cellule unique (Fig. 3). En outre, CPEF formé des vaisseaux sanguins qui sont humanisés perfusés avec les globules rouges d'accueil lors de leur implantation dans des souris immunodéficientes 4, 6, 8, 11 (Fig. 4).
Figure 1. L'isolement des cellules mononucléées (CMN) du sang du cordon et l'excroissance de la colonie de cellules endothéliales formant des cellules (CPEF) de culture multinationales. Couche de forme multinationales couche leuco-plaquettaire au cours de Ficoll-Pague séparation par gradient de densité de cellules de sang de cordon. Isolement de la couche leuco-plaquettaire à la culture des multinationales sur queue de rat collagène I enduits résultats plaques en excroissance de la colonie ECFC dans 5 à 14 jours. La colonie ECFC excroissance (indiqué par des pointes de flèches) affiché 7 morphologie pavée.
Figure 2. Représentant d'évaluation in vitro de l'expression phénotypique des cellules endothéliales et hématopoïétiques antigène de surface. Immunophénotypage des dérivés du sang de cordon CPEF a révélé que CPEF exprimé antigènes endothéliaux CD31, CD34, CD144, de CD146, Flt-1, Flk-1, Flt-4, et Nrp2 mais n'a pas hématopoïétiques expriment des antigènes CD45, CD14, CD11b, CKIT, CXCR4 ou AC133 7, 8.
Figure 3. Représentant dans la quantification in vitro de la clonogénique et le potentiel de prolifération de CB CPEF dérivés. Le sang du cordon (A)Dérivés de CPEF afficher clonale potentiel prolifératif avec une hiérarchie des colonies allant de grappes de 2-50 cellules à des colonies de> 2001. (B) Micrographies de la hiérarchie des colonies (colonies colorées avec, Sytox, un colorant fluorescent vert nucléaire à prendre des photos de meilleure qualité) obtenu après de sang de cordon dérivé CPEF ont été cultivées à un niveau unique cellule pendant 14 jours. La barre d'échelle représente 100 um 7, 8.
Figure 4. Représentant dans la caractérisation fonctionnelle in vivo de sang de cordon dérivés CPEF. A) H & E coloration de sang de cordon dérivé ECFC contenant implants en gel de cellularized indiqué microvaisseaux (rempli de globules rouges d'accueil) la formation de collagène-fibronectine gel après 14 jours d'implantation. B) coloration anti-CD31 humain (coloration brune) confirme en outre l'origine humaine de ces navires.
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Discussion
La caractérisation phénotypique et fonctionnelle des cellules progénitrices endothéliales putatifs est important d'identifier les CPEF de bonne foi qui sont capables de clonage et de série re-placage dans la culture et de donner lieu à durables et fonctionnels des vaisseaux sanguins implantables in vivo. Sang de cordon ombilical humain est enrichi en CPEF et la concentration de ces cellules circulantes diminue avec le vieillissement ou d'une maladie 10. Des études récentes suggèrent que ECFC peut jouer un rôle important dans la réparation vasculaire ou la régénération dans les situations de lésion vasculaire, infarctus du myocarde, ou la rétinopathie 17-19.
Ici, nous avons décrit des méthodes simples et efficaces pour la dérivation, le clonage, l'expansion, et in vitro ainsi que dans la caractérisation in vivo de CPEF de cordon ombilical humain CB. Ces approches permettent aux chercheurs d'identifier et d'isoler de bonne foi EPC de CB qui possèdent clonale potentiel prolifératif et
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Disclosures
Pas de conflits d'intérêt déclarés.
Acknowledgments
Dr Yoder est consultant pour les technologies EndGenitor, Inc et un membre du conseil d'administration de Technologies Rimedion, Inc
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heparin Sodium Injection, USP | APP Pharmaceuticals | 504031 | |
| Ficoll-Pague | Amersham | 17-1440-03 | |
| Mixing cannula | Maersk Medical | 500.11.012 | |
| EGM-2 | Lonza Inc. | CC-3162 | |
| Defined FBS | Hyclone | SH30070.03 | |
| TrypLE express | GIBCO, by Life Technologies | 12605 | |
| Rat type I collagen | BD Biosciences | 354236 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | |
| FcR Block | Miltenyi Biotec | 130-059-901 | |
| hCD31, FITC conjugated | BD Biosciences | 555445 | |
| hCD45, FITC conjugated | BD Biosciences | 555482 | |
| hCD14, FITC conjugated | BD Biosciences | 555397 | |
| hCD144, PE conjugated | eBioscience | 12-1449-80 | |
| hCD146, PE conjugated | BD Biosciences | 550315 | |
| hCD105, PE conjugated | Invitrogen | MHCD10504 | |
| Ms IgG1,k antibody, FITC conjugated | BD Biosciences | 555748 | |
| Ms IgG1,k antibody, PE conjugated | BD Biosciences | 559320 | |
| Ms IgG2a,k antibody, FITC conjugated | BD Biosciences | 555573 | |
| Anti-human CD31 | Dako | clone JC70/A | |
| Anti-mouse CD31 | BD Biosciences | 553370 | |
| 0.22-μm vacuum filtration system | EMD Millipore | SCGPU05RE | |
| Glacial acetic acid, 17.4N | Fisher Scientific | A38-500 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Invitrogen | 15240-062 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30070.03 | |
| IHC Zinc Fixative | BD Biosciences | 550523 | |
| Sytox green reagent | Invitrogen | S33025 | |
| Cloning cylinders, sterile | Fisher Scientific | 07-907-10 |
References
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