Summary
בתאי אנדותל היוצרים המושבה (ECFCs) מסתובבים לתאי אנדותל עם פוטנציאל חזק שגשוג משובט המוצגים מהותי
Abstract
צפיות ארוכת שנים של יצירת כלי דם חדשים באמצעות אנגיוגנזה, vasculogenesis, ו arteriogenesis נבדקו לאחרונה 1. הנוכחות של מחזורי ובתאים אנדותל (EPCs) זוהו לראשונה על ידי אסהאךה ואח' בדם למבוגרים היקפי האדם. בשנת 1997 2 להביא עירוי של השערות ואסטרטגיות חדשות התחדשות תיקון כלי הדם. EPCs הם מרכיבים נדירים אבל נורמלי של מחזורי הדם בבית לאתרים של היווצרות כלי דם או שיפוץ כלי הדם, ולאפשר גם vasculogenesis אנגיוגנזה לאחר הלידה, או arteriogenesis בעיקר באמצעות גירוי paracrine החומה כלי הקיים נובע תאים 3. סמן לא ספציפי לזהות EPC זוהה, וכיום המדינה השדה הוא להבין כי סוגי תאים רבים, כולל גזע hematopoietic proangiogenic ו ובתאים, מחזורי תאים angiogenic, Tie2 + ומונוציטים, cel אבי מיאלואידיתls, מקרופאגים הקשורים הגידול, מקרופאגים משופעלים מסוג M2 להשתתף מגרה את תהליך angiogenic במגוון רחב של מערכות מודל פרה בעלי חיים והן בבני אדם במדינות רבות המחלה 4, 5. בתאי אנדותל היוצרים המושבה (ECFCs) הם תאים נדירים במחזור אנדותל קיימא המאופיינים פוטנציאל חזק שגשוג משובט, המושבה משני שלישוני היכולת להרכיב על replating, ואת היכולת ליצור כלי מהותי ב vivo גבי השתלת לעכברים immunodeficient 6-8. בעוד ECFCs היו מבודדים בהצלחה מדם היקפי של נושאים בוגרים בריאים, חבל הטבור דם (CB) של תינוקות בריאים, והקיר כלי של מספר רב של כלי עורקי וורידי אדם 6-9, CB הוא בעל התדירות הגבוהה ביותר של ECFCs 7 כי התצוגה את הפוטנציאל הכי חזקים שגשוג משובט וצורה כלי דם עמיד תפקודית 8 vivo, 10-13. בעוד גזירתECFC מדם היקפי מבוגר הוצגה 14, 15, כאן נתאר את מתודולוגיות הגזירה, שיבוט ההרחבה, במבחנה, כמו גם אפיון vivo של ECFCs מן הטבור CB האדם.
Protocol
ריאגנטים פתרונות
EMG-2 Media (Lonza, חתול. מספר cc-3162 המכיל EBM-2 בינוני הבסיסי ו-EGM 2 ערכת תוספי SingleQuot, & גורמי גדילה)
EBM-2 (Lonza, חתול. מספר cc-3156) השלים עם ערכת תוספי כל SingleQuot שימוש גורמי גדילה (Lonza, חתול. מספר cc-4176), 10% (V / V) בסרום שור עוברית (FBS) ו 1% (V / V) פניצילין (10,000 יח' / מ"ל) / סטרפטומיצין (10,000 מיקרוגרם / מ"ל) / amphotericin (25 מיקרוגרם / מ"ל). לאחסן עד חודש 1 על 4 ° C. מומלצים EGM-2 כרכים להשתמש לתרבות ECFC הם 500 μl / טוב 24 גם צלחות, 2 מ"ל / 6 צלחות טוב טוב, 5ml/25-cm 2 צלוחיות, ו -10 ml/75-cm 2 צלוחיות, אלא אם כן אם צוין אחרת בפרוטוקול.
קולגן הפתרון אני
לדלל 0.575 מ"ל של חומצה אצטית קרחונית (17.4N) ב 495 מ"ל של מים מזוקקים סטריליים (0.02 N הריכוז הסופי). סטרילית חומצה אצטית מסנן לדלל עם 0.22-מיקרומטר VACuum מערכת סינון. הוסף 25 מ"ג חולדה הזנב קולגן אני לחומצה אצטית לדלל את הריכוז הסופי של 50 מיקרוגרם / מ"ל. כמות הקולגן הוסיף ישתנה בהתאם ריכוז המניות קולגן. לאחסן עד חודש ב 4 ° C.
הכנת אני מצופה קולגן משטחי רקמה תרבות
מקום 1 מ"ל של תמיסת קולגן אני היטב כל אחד צלחת 6-גם רקמת התרבות (שימוש μl 300/24 טוב גם צלחות, צלוחיות 3ml/25-cm 2, ו -8 ml/75-cm 2 צלוחיות). דגירה 1 שעה עד לילה ב 37 ° C. הסר את הקולגן אני פתרון ולשטוף פני שתי פעמים, כל פעם עם PBS (שימוש μl 500/24 טוב גם צלחות, 2 מ"ל / 6 צלחות טוב טוב, 5ml/25-cm 2 צלוחיות, ו 10 ml/75 ס"מ 2 צלוחיות). השתמש צלחות מיד בתרביות תאים.
FACS מכתים חיץ
פוספט בופר סליין (PBS) בתוספת 2% (V / V) בסרום שור עוברית (FBS). חנות uע 'ל 2 שבועות 4 ° C.
תוצאה א 'ECFC, שיבוט והרחבה
- איסוף CB עם הפרין (10 U הפרין / מ"ל דם) או EDTA כפי קרישה והובלה למעבדה בטמפרטורת החדר באופן מיידי (תוך 2 שעות משלוח של התינוק) תהליך מדגם לתא בידוד mononuclear (MNC).
- Aliquot 15 מ"ל של CB לתוך צינור של 50 מ"ל כל צנטריפוגה חרוטי ולהוסיף 20 מ"ל של PBS על צינור כל הזמנים CB ו פיפטה כמה לערבב. להכין 15 מ"ל Ficoll-Paque לתוך מזרק 20 מ"ל ולצרף מחט 20 גר 'או צינורית ערבוב. הנח את קצה צינורית ערבוב בחלק התחתון של צינור של דם מדולל ובזהירות רובד תחתון 15 מ"ל Ficoll-Pague. בצנטריפוגה צינורות 30 דק 'ב 740 XG, בטמפרטורת החדר, ללא הגדרה בלם האטה.
- בעזרת פיפטה, העברה, להסיר את שכבת מעורפל של בצפיפות נמוכה MNCs ממוקם בממשק שבין פלזמה Ficoll-Paque ובדילול מלא. לוותר על המשך MNCs 50 מ"ל צינור חרוטיaining 10 מ"ל EGM-2 בינוני. בצנטריפוגה 10 דקות MNCs ב XG 515, בטמפרטורת החדר, עם הגדרה האטה גבוהה בלם.
- בזהירות לשאוב וזורקים supernatant. שוטפים את התאים pelleted עם EGM-2 פעמיים (10 דק 'ב 515 XG) מחדש להשעות MNCs ב EGM-2 ב 1.25 x 10 -7 תאים / מ"ל. הכן קולגן אני מצופה 6-גם תרבות צלחות רקמות על ידי הוספת 1 חולדה זנב מ"ל קולגן מסוג I (50 מיקרוגרם / מ"ל) לכל דוגרים היטב את הצלחת בן לילה. פיפטה 4 מ"ל של השעיה זו MNC זה לתוך זה היטב למקם את התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור humidified. A.1.5) לאחר 24 שעות (יום 1), לאט לאט להסיר את המדיום בילה (לא להפריע את התאים חסיד רופף) מבאר עם טפטפת, לאט להוסיף 4 מ"ל EGM-2 כדי ובכן, ולחזור הצלחת חממה . ביום 2, רענון בינוני על ידי הסרת לאט בינוני (לא להפריע את התאים חסיד רופף) מבאר עם טפטפת והוספת 4 מ"ל EGM-2 היטב כל אחד מהם. חזור על שינוי בינונית מדי יום האו"םטיל יום 7 ובכל יום לאחר מכן עד מושבות ECFC מופיעים על שיבוט. בדרך כלל מושבות מופיעים בין יום 5 לבין יום 14 יום 7 (איור 1).
- דמיינו מושבות ECFC טיפוסי עם מורפולוגיה המרוצף באמצעות מיקרוסקופ הפוכה (הגדלה 10x) ולסמן את גבולות המושבה עם הסמן על החלק התחתון של הבאר, כדי לציין את המיקום של כל המושבה.
- ביום 14, לשטוף את מושבות ראשי 2 פעמים עם PBS ואת מושבות הקציר בודדים באמצעות צילינדרים השיבוט מספיק TrypLE מפורשת לכסות את התאים בתוך הגלילים. לאחר aspirating לשטוף האחרון של PBS, מקם ג'ל סטרילי מצופה גליל השיבוט ברחבי המושבה זה ולחץ בחוזקה על הצלחת באמצעות מלקחיים סטריליות. להוסיף 2-3 טיפות חם TrypLE אקספרס לגליל כל שיבוט דגירה של 3-5 דקות עד תאים בתוך גליל להתחיל לנתק. להוסיף כ 250 μl בינוני EGM-2 למרכז הגליל ו פיפטה במעלה ובמורד גרםenerate ההשעיה תא בודד. מעבירים את ההשעיה תא בודד מתוך כל גליל שיבוט בנפרד לתוך צינור מיקרו צנטריפוגות הפרט.
- לשטוף את האזור בתוך 2-3 פעמים עם צילינדר בינוני כ 250 EGM-2 μl לאסוף את כל התאים הנותרים ולהעביר את הכביסה מן הגליל לכל לתוך הצינור מיקרו צנטריפוגות בהתאמה. תאים בצנטריפוגה במהירות גבוהה (≤ 300 XG) על השולחן צנטריפוגות במשך 5 דקות.
- הסר את supernatant מחדש להשעות את התא גלולה ב 1.5 מ"ל בינוני טרי EGM-2. מעבירים את ההשעיה התא (שמכיל את כל התאים של מושבות בודדים) מהצינור זה לאחד היטב צלחת 24 גם רקמת התרבות מראש מצופה 500 μL עכברוש זנב קולגן אני (50 מיקרוגרם / מ"ל).
- מקום בתוך אינקובטור להרחבת עם התקשורת לשנות לבצע אחת ליומיים.
- כאשר תאים להתקרב 80-90% confluency, הסר בינוני במשך מכן לשטוף את התאים פי 2 עם PBS ולהוסיף 500 μl בינוני TrypLE אקספרס זה טובצלחת 24 גם בתרבית רקמה. מניחים צלחת בתוך חממה 3-5 דקות עד התאים מתחילים לאסוף ולנתק. הוסף 1 מ"ל של EGM-2 (עם 10% הגדירו FBS) זה גם לאסוף את התאים על ידי שטיפת ולהעבירם שפופרת 15 מ"ל. לשטוף היטב עם 1 בינוני ML-2 EGM לאסוף את כל התאים הנותרים ולהעביר את הכביסה מבאר כל לשפופרת 15 מ"ל, בהתאמה. בצנטריפוגה תאים ב XG 300 דקות 5.
- הסר את המדיום מחדש להשעות את התא גלולה ב 1 בינוני מ"ל EGM-2 טרי (עם FBS מוגדרים 10%). השג את מספר הסלולרי קיימא של aliquot באמצעות hemacytometer והדרה trypan כחול.
- הרחב את התאים על ידי זריעה על 5000 תאים / 2 ס"מ על קולגן אני מראש מצופים בתרבית רקמה משטחים EGM-2 התקשורת עם התקשורת לשנות כל יומיים עד תאים להתקרב 80-90% confluency לפני culturing קטן שוב.
ב באפיון פנוטיפי של ECFCs חוץ גופית: תא האנדותל Surface Antigen הביטויAssay ד תא יחיד עבור פוטנציאל שגשוג משובט
- על פני האנדותל ביטוי תא אנטיגן, לנתק את התאים עם TrypLE אקספרס לאסוף תאים על ידי שימוש בשיטות המתוארות על שיבוט הרחבת ECFC ו.
- מחדש להשעות התאים חיץ מכתים FACS (10 x 10 6 תאים / FACS 1ml מכתים חיץ) ולאחר מכן להוסיף מגיב FCR חוסם (20 μl / 10 x 10 6 תאים), מערבבים בעדינות ומניחים על קרח דק '10.
- 100 aliquot μl של השעיה זו תא צינור מיקרו צנטריפוגות על פני השטח של כל אנטיגן האנדותל שולטת isotype. הוספת כמות מתאימה של שכותרתו נוגדנים חד שבטיים fluorochrome אדם שמזהים אנטיגנים אנדותל (CD31, CD144, CD146, CD105 ו) או אנטיגנים hematopoietic (CD45 ו CD14) ולהשאיר על קרח למשך 30 דקות מפני אור זהירות: 1 X 10 6 תאים לא נדרשים עבור כל בדיקה. החוקרים בדרך כלל להכין 0.5 עד 1 X 10/5 תאים צינור להשיג 2 X 10 4 לנתחד אירועים. כמו כן, בעקבות המלצה של היצרן עבור סכום של נוגדנים כדי לשמש עבור כל בדיקה. נוגדנים מסוימים עשויים לדרוש titrating כדי לקבוע את ריכוז הנוגדן אופטימלית. כל מכתים כי החוקרים ביצעו הם כתמים בצבע אחד.
- לאחר 30 דקות של הדגירה על הקרח, צנטריפוגה כל הצינור במהירות גבוהה על צנטריפוגות השולחן 5 דקות ולאחר מכן להסיר את supernatant מחדש להשעות את התא גלולה במאגר FACS.
- ניתוח דגימות על cytometer זרימת לקבוע את אחוז התאים כתם חיובי או שלילי עבור כל אנטיגן. ECFCs כתם אחיד חיובית CD31, CD144 ו CD146, אבל שלילי CD45 ו CD14 בהשוואה לקבוצת הביקורת isotype המתאימים.
- עבור assay תא בודד כדי לבחון את פוטנציאל שגשוג משובט, לנתק את המעבר מוקדם (2-3) עם תאים TrypLE אקספרס לאסוף תאים תוך שימוש בשיטות דומות לזו שתוארה עבור שיבוט הרחבת ECFC ו.
- להדביק תאים אלהעם חלבון פלואורסצנטי ירוק משופרת (EGFP) להביע lentiviruses 16 ולאסוף תאים המבטאים EGFP ידי cytometry הקרינה זהירות:. עבודה עם lentivirus נחשב Biohazard וכל ביו בטיחות אמצעי זהירות יש לציית לו.
- תרבות בהם תיאר את ECFC culturing בסעיף להרחבת ECFC.
- הכן אני קולגן מצופה 96-גם הצלחות על ידי הוספת 50 μl סוג חולדה זנב קולגן אני (50 מיקרוגרם / מ"ל) לכל היטב דגירה צלחת את הלילה. לאסוף את + ECFCs EGFP באמצעות TrypLE אקספרס resuspend אותם במדיום EGM-2 בריכוז הסופי ~~~HEAD=NNS 10 6 תאים / מ"ל.
- השתמש FACS Vantage (בקטון דיקסון) או סדרן דומה אחר עם קצב זרימה נמוך של 20 תאים / שנייה למיין אחד EGFP + ECFC לכל גם צלחת 96-היטב לכוון את עוצמת הקול הסופי μl 200 דולר היטב עם EGM-2. השתמש מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוכה על מנת להבטיח כי גם כל אחד קיבל רק תא אחד. Alternativאלי, תאים בודדים ניתן למיין על פי FSC ו SSC ו Sytox צבע גרעינית מכתים המושבות יכול לשמש הניקוד תא וכימות.
- דגירה את הצלחת על פני תקופה של שבועיים עם שני שינויים התקשורת (200 pipetter μl EGM-2 באמצעות רב) שבוצעו ביום 5 ו - 10 יום. ביום 14 של תרבות, לשטוף היטב עם כל 100 PBS μl לפני תיקון התאים עם μl 100 paraformaldehyde של 4% למשך 30 דקות. עבור ECFCs שלא מביעים EGFP, להוסיף מגיב Sytox, צבע ירוק ניאון הגרעין, לאחר קיבוע paraformaldehyde ו דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
- במיקרוסקופ פלואורסצנטי לבחון כל טוב לכמת את מספר התאים אנדותל שהתרחבו מתא בודד בתרבית למשך 14 יום. לניתוח כמותי, בארות הציון עם 2 תאים או יותר כמו אנדותל חיובית (עבור הפצת) ולבחון אותם עוד יותר עבור מספר הכולל תא האנדותל על ידי ספירת ויזואלית באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
- כדי להציג tהוא השיג נתונים, בארות עם מספר תא האנדותל של: 2 עד 50, 51-2000, ו 2001 או יותר, נחשבים: אשכולות תא האנדותל, פוטנציאל שגשוג נמוכה (LPP)-ECFCs, ואת פוטנציאל שגשוג גבוהה (HPP) - ECFCs בהתאמה. ECFCs להציג היררכיה מלאה של פוטנציאל שגשוג משובט ידי והוליד אשכולות, LPPs אנדותל, וכן HPPs כאשר בתרבית ברמת תא בודד למשך 14 יום. 7
ג באפיון vivo פונקציונלי של ECFCs: ב Assay כלי vivo גיבוש לבחינת הפוטנציאל של ECFC עבור Vasculogenesis
- הכן שתלים cellularized ג'ל על ידי חישוב הנפח הכולל (מ"ל) של כל אחד מהחומרים הבאים ג 'ל (עם ריכוז של דבר בסוגריים) צריך להטיל 1-מ"ל ג'ל (אשר יהיה חוצה לאחר מכן לייצר 2 שתלים): FBS (10 %), EBM-2 10:01 (לכוונן את עוצמת הקול הסופי מ"ל 1), סודיום ביקרבונט (1.5 מ"ג / מ"ל), NaOH (כדי להתאים את ה-pH 7.4), HEPES (25 מ"מ), fibronectin (100 מיקרוגרם / מ"ל), וגם אני קולגן (1.5 מ"ג / מ"ל).
- לאחר חישוב חומר ג'ל, לנתק את התאים עם TrypLE אקספרס לאסוף תאים תוך שימוש בשיטות דומות לזו שתוארה עבור שיבוט הרחבת ECFC ו. להשיג ספירת תאים קיימא של aliquot באמצעות hemacytometer ו trypan כחול. העברת 2.4 מיליון תאים קיימא לתוך צינור ML-50 ו חרוטי גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה ב 515 XG, בטמפרטורת החדר. במקביל, מכינים הפתרון ג'ל מטריקס על ידי הוספת כמויות מחושבות של HEPES, סודיום ביקרבונט, EBM-2 10:1, FBS, fibronectin, וכן קולגן כדי צינור קר כקרח 50 מ"ל חרוטי (באותו סדר כפי שהם מופיעים). מערבבים היטב ולהתאים את ה-pH ל 7.4 עם NaOH תוך שמירה על פתרון קרח.
- מחק supernatant מתאי לאחר צנטריפוגה מחדש להשעות גלולה ב 360 μl חם EGM-2 ו לה להוסיף מותאם pH 840 μl של פתרון מטריקס ג'ל, מה שהופך את נפח השתל הסופי של 1 מ"ל ג'ל. מערבבים את התאים לתוך פתרון מטריקס ג'ל לאט עדתאים מושעים ביסודיות בתמיסה ג'ל.
- העברה זו 1 מ"ל תרחיף cellularized ג'ל אחד גם של צלחת של 12 גם רקמת תרבות דגירה של 20-30 דקות עד ג'ל polymerizes. לכסות בעדינות את הג'ל עם 2 מ"ל חם EGM-2 ו דגירה בן לילה.
- מיד לפני ההשתלה, לחצות ג'ל מודגרות לילה לשני חלקים שווים באמצעות מספריים איריס להחזיר את חתיכות ג'ל לתרבות אותו היטב המכיל EGM-2 בינוני.
- השתמש במתקן כירורגית חיים לבעל החיים הרגוע (5-6 ישנים בשבוע מהנהנים / עכברים SCID) על ידי בניהול ההרדמה isoflurane. לגלח את החלק התחתון של הבטן ניקיון יסודי באתר כירורגית עם רפידות אלכוהול בבטאדין או חומר חיטוי אחר. ואז לבודד את האזור עם וילונות על פי הנחיות IACUC ומוסדיים.
- באמצעות מספריים חדות סטריליים איריס לעשות חתך כ 5 מ"מ ברביע התחתון של הבטן, לחשוף את החלל תת עורית בין העור לבין שרירי הבטן. לבצע דיסקציה קהה דרך שכבת הדרמיס של שריר הבטן כדי ליצור כיס רחב 15-20 מ"מ מוביל מעולה לתוך ברבע הבטן העליונה. חזור על הליך דומה כדי ליצור כיס פתוח דומה בצד אחר של הבטן עכבר אחת.
- הכנס חתיכה אחת וחצי של ג'ל אל צד אחד של כיס בטן עוד חתיכת חצי ג'ל אל צד אחר של כיס הבטן על ידי הסרת שכבת הדרמיס הזנב רק חתך.
- לאחר החדרת ג'ל, סגור כל חתך עם 2-3 תפרים באמצעות 5-0 תפר פוליפרופילן על מחט חיתוך. כראוי לתייג את הקלפים הכלוב ולבצע לאחר ניתוח ניטור כאבים בהתאם לדרישות המוסדיים פרוטוקול לאפשר 14 יום עבור תאים אלה מושתלים ג'ל ליצור דה נובו בכלי הדם.
- לבסוף, קציר של שתלים ג'ל מבוצע בדרך כלל לאחר והרדמת חסד העכבר 14 יום לאחר ההשתלה.
- ספוגית אזור הבטן עם כריות אלכוהוללחתוך את עור הבטן הזנב לקו החתך המקורי. בזהירות, לנתח את השתל על ידי כשהוא כורת קפל העור הזנב אל המיקום המשוער של ג'ל. השתל והבלו על ידי חיתוך circumferentially סביב ג'ל אז מקום מקבע אבץ (BD Biosciences, בצע את המלצתו של היצרן לקבלת תוצאות אופטימליות) ולאפשר להם לתקן למשך 1-2 שעות בטמפרטורת החדר.
- להכין את פרפין, מוטבע ג'לים באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים histochemical ולהכין 5 חלקים מיקרומטר על שקופיות הזכוכית לבצע צביעה עם hematoxylin ו eosin, אנטי אנושי CD31 או עכבר אנטי CD31 לדמיין בכלי הדם בתוך הג'ל. ECFCs לעבור דה נובו vasculogenesis ליצור כלי אנושית ב cellularized שתלים ג'ל מוכנס לתוך עכברים immunodeficient למשך 14 יום 4,8,11.
ד נציג תוצאות
באמצעות טכניקה זו גזרה ECFC ראינו מחוץ הצמיחה העיקרי של צורת המושבהation כבר ביום 5 (איור 1). את הצמיחה מחוץ מושבות ECFC הציג המראה קובלסטון טיפוסי הולידה> הכפלות 40 אוכלוסייה עם התרחבות לטווח ארוך לאחר איסוף המושבה על ידי שיבוט. מושבות מורחבות לידי ביטוי אנטיגנים אנדותל, אך לא הביע אנטיגנים hematopoietic (איור 2). חשוב לציין, הם מוצגים היררכיה מלאה של פוטנציאל שגשוג משובט ברמת תא בודד (איור 3). יתר על כן, נוצר כלי דם ECFCs אנושית אשר perfused עם RBCs המארחות כאשר מושתלים לעכברים immunodeficient 4, 6, 8, 11 (איור 4).
באיור 1. בידוד של תאים mononuclear (MNCs) מן הדם הטבורי ואת תולדה של המושבה האנדותל (התאים יוצרים ECFCs) מ תרבות MNCs. שכבת MNCs באפי טופס מעיל במהלך ההפרדה Ficoll-Pague צפיפות שיפוע של כדוריות דם טבורי. הבידוד של שכבת מעיל באפי לתרבות MNCs על קולגן עכברוש זנב אני מצופה לוחות התוצאות תוצאה של המושבה ECFC ב 5 עד 14 ימים. ECFC תוצאה המושבה (מסומנת ראשי חץ) מוצג מורפולוגיה קובלסטון 7.
איור 2. נציג במבחנה הערכה פנוטיפי של האנדותל hematopoietic ביטוי פני התא אנטיגן. Immunophenotyping דם טבורי שמקורם ECFCs גילה כי ECFCs לידי ביטוי אנטיגנים אנדותל CD31, CD34, CD144, CD146, FLT-1, Flk-1, FLT-4 ו Nrp2 אבל לא הביע אנטיגנים היווצרות הדם CD45, CD14, CD11b, cKit, CXCR4 AC133 או 7, 8.
איור 3. נציג quantitation חוץ גופית של clonogenic ואת פוטנציאל שגשוג של ECFCs הנגזרות CB. (א) דם טבוריהנגזרות ECFCs להציג פוטנציאל שגשוג משובט עם היררכיה של מושבות החל אשכולות של 2-50 תאים עד מושבות של> 2001. (ב) micrographs של ההיררכיה של מושבות (קולוניות מוכתם, Sytox, צבע ירוק ניאון גרעינית כדי לצלם תמונות באיכות טובה יותר) המתקבל לאחר דם טבורי שמקורם ECFCs היו בתרבית ברמת תא בודד למשך 14 יום. סרגל קנה מידה מייצג 100μm 7, 8.
באיור 4. נציג אפיון פונקציונלי vivo של דם טבורי שמקורם ECFCs. א) H & E מכתים של דם טבורי המופק ECFC המכיל שתלים cellularized ג 'ל ציינו microvessel (מלא RBCs המארחות) היווצרות של ג'ל קולגן-fibronectin לאחר 14 ימים מיום ההשתלה. ב) נגד אדם מכתים CD31 (כתמים חומים) עוד יותר מאשר את המקור האנושי של הכלים האלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אפיון פנוטיפי ופונקציונלי של המשוערים ובתאים אנדותל חשוב לזהות את ECFCs חרוצים וישרי דרך המסוגלים clonally ו סדרתי מחדש ציפוי בתרבות להצמיח עמיד ופונקציונלי כלי דם להשתלה in vivo. דם אדם חבל הטבור הוא מועשר ECFCs וריכוז אלה ירידות במחזור תאים עם הזדקנות או מחלה 10. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי ECFC עשוי לשחק תפקידים חשובים תיקון התחדשות כלי הדם או במצבים של פגיעה וסקולרית, אוטם שריר הלב, או רטינופתיה 17-19.
הנה, יש לנו תיאר שיטות פשוטות ויעילות עבור הגזירה, שיבוט ההרחבה, במבחנה, כמו גם אפיון vivo של ECFCs מן הטבור CB האדם. גישות אלה מאפשרים לחוקרים לזהות ולבודד EPCs חרוצים וישרי דרך של CB אשר מחזיק פוטנציאל שגשוג משובט ו
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגוד עניינים הצהיר.
Acknowledgments
ד"ר Yoder הוא יועץ טכנולוגיות EndGenitor, Inc וחבר מועצת המנהלים של Rimedion Technologies, Inc
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heparin Sodium Injection, USP | APP Pharmaceuticals | 504031 | |
| Ficoll-Pague | Amersham | 17-1440-03 | |
| Mixing cannula | Maersk Medical | 500.11.012 | |
| EGM-2 | Lonza Inc. | CC-3162 | |
| Defined FBS | Hyclone | SH30070.03 | |
| TrypLE express | GIBCO, by Life Technologies | 12605 | |
| Rat type I collagen | BD Biosciences | 354236 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | |
| FcR Block | Miltenyi Biotec | 130-059-901 | |
| hCD31, FITC conjugated | BD Biosciences | 555445 | |
| hCD45, FITC conjugated | BD Biosciences | 555482 | |
| hCD14, FITC conjugated | BD Biosciences | 555397 | |
| hCD144, PE conjugated | eBioscience | 12-1449-80 | |
| hCD146, PE conjugated | BD Biosciences | 550315 | |
| hCD105, PE conjugated | Invitrogen | MHCD10504 | |
| Ms IgG1,k antibody, FITC conjugated | BD Biosciences | 555748 | |
| Ms IgG1,k antibody, PE conjugated | BD Biosciences | 559320 | |
| Ms IgG2a,k antibody, FITC conjugated | BD Biosciences | 555573 | |
| Anti-human CD31 | Dako | clone JC70/A | |
| Anti-mouse CD31 | BD Biosciences | 553370 | |
| 0.22-μm vacuum filtration system | EMD Millipore | SCGPU05RE | |
| Glacial acetic acid, 17.4N | Fisher Scientific | A38-500 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Invitrogen | 15240-062 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30070.03 | |
| IHC Zinc Fixative | BD Biosciences | 550523 | |
| Sytox green reagent | Invitrogen | S33025 | |
| Cloning cylinders, sterile | Fisher Scientific | 07-907-10 |
References
- Carmeliet, P., Jain, R. K. Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis. Nature. 473, 298-307 (2011).
- Asahara, T. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science. 275, 964-967 (1997).
- Urbich, C., Dimmeler, S. Endothelial progenitor cells: characterization and role in vascular biology. Circ. Res. 95, 343-353 (2004).
- Critser, P. J., Voytik-Harbin, S. L., Yoder, M. C. Isolating and defining cells to engineer human blood vessels. Cell. Prolif. 44, 15-21 (2011).
- Matthias, M., David, N., Josef, N. From bench to bedside: what physicians need to know about endothelial progenitor cells. Am. J. Med. 124, 489-4897 (2011).
- Ingram, D. A. Vessel wall-derived endothelial cells rapidly proliferate because they contain a complete hierarchy of endothelial progenitor cells. Blood. 105, 2783-276 (2005).
- Ingram, D. A. Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood. Blood. 104, 2752-2760 (2004).
- Yoder, M. C. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109, 1801-1809 (2007).
- Reinisch, A., Strunk, D. Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells (ECFCs. J. Vis. Exp. (32), e1525 (2009).
- Au, P. Differential in vivo potential of endothelial progenitor cells from human umbilical cord blood and adult peripheral blood to form functional long-lasting vessels. Blood. 111, 1302-135 (2008).
- Critser, P. J., Kreger, S. T., Voytik-Harbin, S. L., Yoder, M. C. Collagen matrix physical properties modulate endothelial colony forming cell-derived vessels in vivo. Microvasc. Res. 80, 23-30 (2010).
- Melero-Martin, J. M. Engineering robust and functional vascular networks in vivo with human adult and cord blood-derived progenitor cells. Circ. Res. 103, 194-202 (2008).
- Melero-Martin, J. M. In vivo vasculogenic potential of human blood-derived endothelial progenitor cells. Blood. 109, 4761-4768 (2007).
- Hofmann, N. A., Reinisch, A., Strunk, D. Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (32), e1524 (2009).
- Lin, Y., Weisdorf, D. J., Solovey, A., Hebbel, R. P. Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood. J. Clin. Invest. 105, 71-77 (2000).
- Witting, S. R. Efficient Large Volume Lentiviral Vector Production Using Flow Electroporation. Hum. Gene. Ther. , (2011).
- Yoon, C. H. Synergistic neovascularization by mixed transplantation of early endothelial progenitor cells and late outgrowth endothelial cells: the role of angiogenic cytokines and matrix metalloproteinases. Circulation. , 112-1618 (2005).
- Dubois, C. Differential effects of progenitor cell populations on left ventricular remodeling and myocardial neovascularization after myocardial infarction. J. Am. Coll. Cardiol. 55, 2232-2243 (2010).
- Medina, R. J., O'Neill, C. L., Humphreys, M. W., Gardiner, T. A., Stitt, A. W. Outgrowth endothelial cells: characterization and their potential for reversing ischemic retinopathy. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51, 5906-5913 (2010).
