Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Fenotypisk og Funksjonell Karakterisering av endoteliale Colony forming celler avledet fra humant navlestrengsblod

Published: April 13, 2012 doi: 10.3791/3872
Automatic Translation
1, 1, 1
1Herman B Wells Center for Pediatric Research, Indiana University School of Medicine

Summary

Endoteliale colony forming celler (ECFCs) er sirkulerende endotelceller med robust klonal proliferativ potensial som viser iboende

Abstract

Langvarig utsikt over nye blodkar dannes via angiogenese, vasculogenesis, og arteriogenesis har nylig blitt anmeldt en. Tilstedeværelsen av sirkulerende endoteliale progenitorceller (EPCs) ble først identifisert i voksent menneske perifert blod ved Asahara et al. I 1997 to bringe en infusjon av nye hypoteser og strategier for vaskulær fornyelse og reparasjon. EPCs er sjeldne, men normale komponentene i sirkulerende blod som hjem til nettsteder av blodkar dannes eller vaskulær remodellering, og legge til rette enten postnatal vasculogenesis, angiogenese, eller arteriogenesis hovedsak via parakrine stimulering av eksisterende åreveggen avledet celler 3. Ingen spesifikk markør for å identifisere en EPC har blitt identifisert, og i dag staten av feltet er å forstå at en rekke celletyper, inkludert proangiogenic hematopoietisk stem og stamceller, sirkulerende angiogenic celler, Tie2 + monocytter, myeloid progenitor Cells, tumor assosiert makrofager, og M2 aktiverte makrofager delta i å stimulere angiogenic prosessen i en rekke prekliniske dyremodell systemer og i mennesker i en rekke sykdomstilstander 4, 5. Endoteliale colony forming celler (ECFCs) er sjeldne sirkulerende levedyktige endotelceller preget av robuste klonal proliferativ potensial, sekundær og tertiær koloni forming evne på replating, og evne til å danne indre in vivo skip upon transplantasjon inn immunsvikt mus 6-8. Mens ECFCs har blitt isolert fra perifert blod hos friske voksne personer, navlestreng blod (CB) av friske nyfødte, og åreveggen av mange menneskelige arterielle og venøse fartøy 6-9, besitter CB den høyeste frekvensen av ECFCs 7 som skjerm den mest robuste klonal proliferativ potensial og form holdbare og funksjonelle blodkar i 8 vivo, 10-13. Mens avledning avECFC fra voksen perifert blod har blitt presentert 14, 15, her vi beskrive metoder for avledning, kloning, ekspansjon, og in vitro, samt in vivo karakterisering av ECFCs fra den menneskelige umbilical CB.

Protocol

Reagenser og løsninger

EMG-2-medier (Lonza, Kat. Nr. cc-3162 inneholder EBM-2 basal medium og EGM-2 SingleQuot kit kosttilskudd, og vekstfaktorer)

EBM-2 (Lonza, Cat. Nr. cc-3156) supplert med hele SingleQuot kit kosttilskudd og vekstfaktorer (Lonza, Kat. Nr. cc-4176), 10% (v / v) fosteret storfe serum (FBS) og 1% (v / v) penicillin (10 000 U / ml) / streptomycin (10.000 mikrogram / ml) / amfotericin (25 mikrogram / ml). Lagre opptil 1 måned ved 4 ° C. Anbefalt EGM-2 volumer som skal brukes for ECFC kultur er 500 mL / bra for 24-brønns plater, 2 ml / brønn for seks-brønns plater, 5ml/25-cm 2 kolber, og 10 ml/75-cm 2 kolber, med mindre annet er angitt i protokollen.

Collagen jeg løsning

Fortynn 0.575 ml iseddik (17.4N) i 495 ml sterilt destillert vann (0,02 N endelig konsentrasjon). Steril filter fortynnet eddiksyre med en 0.22-mikrometer vacuum filtreringssystem. Tilsett 25 mg rotte hale kollagen jeg til fortynnet eddiksyre til en endelig konsentrasjon på 50 mikrogram / ml. Mengden av kollagen lagt vil variere avhengig av kollagen lager konsentrasjon. Lagre opptil en måned ved 4 ° C.

Utarbeidelse av kollagen I-belagt vevskulturstudier overflater

Place 1 ml av kollagen jeg løsningen i hver brønn av en 6-brønns vevskultur plate (bruk 300 mL / bra for 24-brønns plater, 3ml/25-cm 2 kolber, og 8 ml/75-cm 2 kolber). Inkuber 1 time til natten ved 37 ° C. Fjern kollagen jeg løsningen og vask overflaten to ganger, hver gang med PBS (bruk 500 mL / bra for 24-brønns plater, 2 ml / vel for seks-brønns plater, 5ml/25-cm 2 kolber, og 10 ml/75 -cm 2 kolber). Bruk plater umiddelbart for cellekulturer.

FACS farging buffer

Fosfat-saltløsning (PBS) supplert med 2% (v / v) fosteret storfe serum (FBS). Butikk up til 2 uker ved 4 ° C.

A. ECFC utvekst, Kloning og utvidelse

  1. Samle CB med heparin (10 U heparin / ml blod) eller EDTA som en antikoagulant og transport til laboratoriet ved romtemperatur og umiddelbart (innen 2 timer etter barnets levering) prosess prøven for mononukleære celle (MNC) isolasjon.
  2. Delmengde 15 ml CB i hver 50-ml konisk sentrifugerør og tilsett 20 ml PBS til hver tube med CB og pipette flere ganger for å blande. Tegn opp 15 ml Ficoll-Paque til en 20-ml sprøyte og feste en 20G nål eller blanding kanyle. Plasser tuppen av blande kanylen på bunnen av røret av fortynnet blod og nøye underlag 15 ml Ficoll-Pague. Sentrifuger rørene 30 minutter ved 740 xg ved romtemperatur, uten nedbremsing brems innstillingen.
  3. Bruk en overføringspipetten, fjerne disig lag av lav tetthet MNCs ligger i grenseflaten mellom Ficoll-Paque og utvannet plasma. Tilsett den MNCs til en 50-ml konisk rør fortsaining 10 ml EGM-2 medium. Sentrifuger MNCs 10 minutter ved 515 xg ved romtemperatur, med en høy retardasjon brems innstilling.
  4. Nøye aspirer og kast supernatanten. Vask pelleterte cellene med EGM-2 to ganger (10 min ved 515 xg) og re-suspendere MNCs i EGM-2 på 1,25 x 10 7 celler / ml. Forbered kollagen I belagt seks-brønns vevskulturstudier platene ved å legge en ml rotte-hale kollagen type I (50 mikrogram / ml) per brønn og ruger platen over natten. Pipetter 4 ml av denne MNC suspensjon i hver brønn og plassere cellene i 37 ° C, 5% CO 2 fuktet inkubator. A.1.5) Etter 24 timer (dag 1), langsomt fjerne brukte medium (ikke forstyrre løst heftende celler) fra brønnen med en pipette, sakte legge 4 ml EGM-2 til brønnen, og returnere plate til inkubatoren . På dag to, oppdatere medium ved sakte å fjerne medium (ikke forstyrre løst heftende celler) fra brønnen med en pipette og legge 4 ml EGM-2 til hver brønn. Gjenta medium endringen daglige unTil dag 7 og annen hver dag deretter til ECFC kolonier vises for kloning. Vanligvis kolonier vises mellom dag 5 og dag 14 dager 7 (Fig. 1).
  5. Visualiser typiske ECFC kolonier med brostein morfologi bruker invertert mikroskop (forstørrelse 10x) og merk koloniens grenser med en markør på undersiden av brønnen for å angi posisjonen til hver koloni.
  6. På dag 14, vaske disse primære kolonier 2 ganger med PBS og høste enkelte kolonier med kloning sylindere og akkurat nok TrypLE uttrykkelig å dekke celler inne i sylindrene. Etter å aspirere den siste vask av PBS, plasser en steril gel belagt kloning sylinder rundt hver koloni og trykk hardt mot tallerkenen med steril tang. Legg 2-3 dråper varmt TrypLE Express til hver kloning sylinder og inkuber for 3-5 min til cellene i sylinderen begynner å løsne. Legg ca 250 mL EGM-2 medium i midten av sylinderen og pipetter opp og ned for å generate eneste celle suspensjon. Overfør enkelt celle suspensjon fra hver kloning sylinder separat i en individuell mikro-sentrifugerør.
  7. Vask området innenfor sylinder 2-3 ganger med ca 250 mL EGM-2 medium for å samle alle gjenværende celler og overføre vask fra hver sylinder i den respektive mikro-sentrifugerør. Sentrifuger cellene ved høy hastighet (≤ 300 xg) på bordet sentrifuger i 5 min.
  8. Fjern supernatanten og re-suspendere cellepelleten i 1,5 ml frisk EGM-2 medium. Overfør cellesuspensjon (som inneholder alle cellene fra enkelte kolonier) fra hvert rør inn én brønn av en 24-brønns vevskultur plate forbelagte med 500 mL rotte-hale kollagen I (50 mikrogram / ml).
  9. Plasser inne i inkubatoren for utvidelse med media endres utføres annenhver dag.
  10. Når cellene nærmer 80-90% confluency, fjerne brukte mediet deretter vaske cellene 2 ganger med PBS og legge 500 mL TrypLE Express medium til hver brønnav 24-brønnen vevskultur plate. Sett platen på innsiden av inkubator for 3-5 min før cellene begynner å runde opp og løsne. Tilsett 1 ml av EGM-2 (med 10% definert FBS) til hver brønn for å hente celler ved vask og overføre dem til en 15 ml tube. Vask godt med 1 ml EGM-2 medium for å samle alle gjenværende celler og overføre vask fra hver brønn inn i respektive 15 ml tube. Sentrifuger cellene ved 300 xg i 5 min.
  11. Fjern medium og re-suspendere cellepelleten i 1 ml frisk EGM-2 medium (med 10% definert FBS). Skaff levedyktig celletall av en delmengde med en hemacytometer og trypan blå ekskludering.
  12. Utvid cellene ved såing ca 5000 celler / cm 2 på en kollagen I forbelagte vevskulturstudier flater i EGM-2-medier med media endres annenhver dag frem til cellene nærmer 80-90% confluency før sub-dyrkning igjen.

B. In vitro Fenotypisk Karakterisering av ECFCs: endotel celleoverflateantigen Expression end Singel Cell Assay for Klonal Proliferativ Potential

  1. For endotelial celleoverflateantigen uttrykk, løsner celler med TrypLE ekspress å samle celler ved hjelp av metodene som er beskrevet for ECFC kloning og ekspansjon.
  2. Re-suspendere celler i FACS farging buffer (10 x 10 6 celler / 1ml FACS Fargeløsninger buffer) deretter legger FCR blokkering reagens (20 mL / 10 x 10 6 celler), bland forsiktig og sted på is i 10 min.
  3. Delmengde 100 mL av denne cellesuspensjon i mikro-sentrifugerør for hver endotelial overflateantigen og isotype kontroller. Legg passende mengde fluorokromkonjugerte merket humane monoklonale antistoffer som gjenkjenner endotelceller antigener (CD31, CD144, CD146, og CD105) eller blodkreft antigener (CD45, og CD14) og la på is i 30 min beskyttet mot lys. Advarsel: 1 x 10 6 celler er ikke nødvendig for hver test. Forfatterne typisk forberede 0,5 til 1 x 10 5 celler / røret for å få 2 X 10 4 analysered hendelser. Også følger produsentens anbefaling for mengden av antistoff som skal brukes for hver test. Noen antistoffer kan kreve titrere å finne den optimale antistoff konsentrasjon. All farging at forfatterne har utført er singel misfarging.
  4. Etter 30 min av inkubasjon på is, sentrifuger hver tube med høy hastighet på en tabletop sentrifuger i 5 min så fjern supernatanten og re-suspendere cellepelleten i FACS buffer.
  5. Analysere prøvene på en strømningscytometer å bestemme hvor stor prosentandel av celler som beis positivt eller negativt for hver antigen. ECFCs flekker jevnt positiv for CD31, CD144, og CD146, men negativ for CD45 og CD14 sammenlignet med tilsvarende isotype kontrollene.
  6. For enkelt celle analysen å undersøke klonal proliferativ potensialet, ta tidlig passasje (2-3) celler med TrypLE ekspress å samle celler ved hjelp av metoder som ligner som ble beskrevet for ECFC kloning og ekspansjon.
  7. Infisere disse cellenemed forbedret grønt fluoriserende protein (EGFP) uttrykker lentiviruses 16 og samle celler uttrykker EGFP av fluorescens-cytometri. Advarsel: Arbeide med lentivirus regnes som en biologiske og alle bio-sikkerhetsregler bør følges.
  8. Kultur dem som beskrevet for dyrking ECFC i seksjonen for ECFC ekspansjon.
  9. Forbered kollagen I belagte 96-brønners plater ved å legge 50 mL rotte-hale kollagen type I (50 mikrogram / ml) per brønn og inkuber platen for natten. Samle EGFP + ECFCs ved hjelp TrypLE ekspress og resuspender dem i EGM-2 medium med endelig konsentrasjon ~ 10 6 celler / ml.
  10. Bruk FACS Vantage (Becton Dickson) eller andre tilsvarende sorter med lav strømningshastighet på 20 celler / sekund for å sortere en enkelt EGFP + ECFC per brønn av en 96-brønns plate og justere den endelige volumet til 200 mL per brønn med EGM-2. Bruk en omvendt fluorescens mikroskop for å sikre at hvert godt mottatt kun en celle. AlternativEly, kan enkeltceller være sortert basert på FSC og SSC og Sytox kjernefysisk fargestoff flekker koloniene kan brukes til celle scoring og kvantifisering.
  11. Inkuber platen over en periode på to uker med to medier endringer (200 mL EGM-2 ved hjelp av flerkanals pipetter) utført på dag 5 og dag 10. På dag 14 av kultur, vask hver brønn med 100 mL PBS før montering cellene med 100 mL 4% paraformaldehyde i 30 min. For ECFCs som ikke uttrykker EGFP, legge Sytox reagens, et grønt fluorescerende kjernefysisk fargestoff, etter paraformaldehyde fiksering og Inkuber ved 4 ° C over natten.
  12. Bruk en fluorescens mikroskop for å undersøke hver brønn for å quantitate antall endotelceller som utvidet fra en enkelt celle dyrket i 14 dager. For kvantitativ analyse, poengsum brønner med 2 eller flere endotelceller som positiv (for spredning) og undersøke dem nærmere for total antall endotelceller ved visuell telling med fluorescens mikroskop.
  13. For å vise than fikk data, brønner med en endotelcelle antall: 2 til 50, 51-2000, og 2001 eller mer, regnes som: endotelcelle klynger, lavt proliferativ potensielle (LPP)-ECFCs, og høy proliferativ potensial (HPP) - ECFCs henholdsvis. ECFCs viser fullstendig hierarki av klonal proliferativ potensial ved å gi opphav til endotel klynger, LPPs og HPPs når kultiveres på en enkelt celle nivå i 14 dager. 7

C. I vivo Funksjonell Karakterisering av ECFCs: In vivo fartøy dannelse analyse for å undersøke ECFC potensial for Vasculogenesis

  1. Forbered cellularized gel implantater ved å beregne det totale volum (ml) av hver av de følgende gel materialer (med den endelige konsentrasjonen i parentes) for å kaste 1-ml gel (som vil bli senere bisected å generere 2 implantater): FBS (10 %), EBM-2 10:01 (juster det endelige volumet til 1 ml), natriumbikarbonat (1,5 mg / ml), NaOH (juster pH til 7.4), HEPES (25 mm), fibronectin (100 mikrogram / ml), og kollagen jeg (1,5 mg / ml).
  2. Etter gel materiale beregning, løsner celler med TrypLE ekspress å samle celler ved hjelp av metoder som ligner som ble beskrevet for ECFC kloning og ekspansjon. Skaff en levedyktig celletall på en delmengde med en hemacytometer og trypan blå. Overfør 2,4 millioner levedyktige celler inn i en 50 ml-konisk rør og pellet cellene ved sentrifugering ved 515 xg, romtemperatur. Samtidig forbereder gel matrix løsning ved å legge beregnede volumer av HEPES, natriumbikarbonat, EBM-2 10:1, FBS og fibronectin, og kollagen til en iskald 50-ml konisk rør (i samme rekkefølge som de er oppført). Bland grundig og justere pH til 7,4 med NaOH samtidig holde løsning på is.
  3. Kast supernatanten fra cellene etter sentrifugering og re-suspendere pellet i 360 mL varm EGM-2 og det legge pH justert 840 mL av gel matrix løsning, gjør det endelige volumet av gel implantatet 1 ml. Bland cellene inn i gel matrix løsning sakte framceller er grundig suspendert i gel løsning.
  4. Overfør denne 1 ml cellularized gel suspensjon til en brønn av en 12-brønns vevskultur plate og inkuber 20-30 min før gel polymerizes. Forsiktig dekke gelen med 2 ml varm EGM-2 og inkuber natten.
  5. Umiddelbart før implantasjon, halvere den natten inkubert gel i to like biter med iris saks og returnere gel stykker til den samme kulturen godt inneholder EGM-2 medium.
  6. Bruk dyret kirurgiske anlegget til sedate dyret (5-6 ukers gamle NOD / SCID mus) ved administrasjon isofluran anestesi. Shave nedre del av magen og rengjør det kirurgiske området med alkohol pads og Betadine eller annen antiseptisk. Deretter isolere området med forheng som per IACUC og institusjonelle retningslinjer.
  7. Bruke sterile skarpe iris saks til å gjøre en ca 5 mm snitt i nedre kvadrant av abdomen, utsette det subkutane mellomrom mellom huden og abdominal muskler. Utfør sløv-disseksjon gjennom dermal laget fra abdominal muskler til å lage en 15-20 mm bred lomme leder overlegent i den øvre abdominal kvadrant. Gjenta samme prosedyre for å opprette lignende åpen lomme i en annen side av samme mus magen.
  8. Sett halvparten stykke gel til den ene siden av magen lommen og den andre halvparten stykke gel inn i en annen side av magen lommen ved å løfte dermal laget like kaudal til snittet.
  9. Etter innsetting av geleer, lukke hvert snitt med 2-3 sting med 5-0 polypropylene sutur på en klippe nål. Passende merke buret kortene og utføre postoperativ overvåking og analgesi som per de institusjonelle og protokoll krav og tillater 14 dager for cellene i disse implantert gels å generere de novo blodkar.
  10. Endelig er høsting av gel implantater vanligvis utføres 14 dager etter implantering etter euthanizing musen.
  11. Swab mageområdet med alkohol pads ogkutte magehud kaudal til den opprinnelige snitt linjen. Forsiktig, dissekere ut implantatet ved excising en klaff på huden kaudale til den sannsynlige plasseringen av gel. Avgiftsdirektoratet implantatet ved å kutte circumferentially rundt gelen da sted i sink fiksativ (BD Biosciences, følg produsentens anbefaling for optimale resultater) og tillate dem å fikse i 1-2 timer ved romtemperatur.
  12. Forbered parafin-embedded-geler med vanlige histochemical protokoller og forberede 5 mikrometer seksjoner på glassplater å utføre farging med hematoxylin og eosin, anti-human CD31 eller CD31 anti-mus for å visualisere blodkar i gel. ECFCs gjennomgå de novo vasculogenesis å generere humanisert fartøy i cellularized gel implantater satt inn immunsvikt mus i 14 dager 4,8,11.

D. Representative Resultater

Ved hjelp av denne ECFC avledning teknikken har vi observert ut-vekst av primær koloni skjemaasjon så tidlig som dag 5 (Fig. 1). De out-vekst ECFC kolonier utstilt typisk brostein utseende og ga opphav til> 40 befolkningsgrupper doblinger upon langsiktig ekspansjon etter koloni pickup ved kloning. Utvidede kolonier uttrykt endotelceller antigener, men uttrykte ikke blodkreft antigener (fig 2). Viktigere, viste de en komplett hierarki av klonal proliferativ potensial på en enkelt celle nivå (Fig. 3). Videre dannet ECFCs humanisert blodkar som er perfused med verten RBCs når implantert i immunsvikt mus 4, 6, 8, 11 (Fig. 4).

Figur 1.
Figur 1. Isolering av mononukleære celler (MNCs) fra navlestrengsblod og utvekst av endotelial koloni danne celler (ECFCs) fra kultivert MNCs. MNCs skjema Buffy Coat lag under Ficoll-Pague tettshetsgradient separasjon av ledningen blod celler. Isolering av Buffy Coat lag til kultur MNCs på rotte-hale kollagen jeg belagte plater resultater i utvekst av ECFC koloni i 5 til 14 dager. Den utvekst ECFC kolonien (angitt med pil hoder) vises brostein morfologi 7.

Figur 2.
Figur 2. Representant in vitro fenotypisk vurdering av endotelial og hematopoetiske celleoverflateantigen uttrykk. Immunfenotyping av ledningen blod-deriverte ECFCs avslørte at ECFCs uttrykte endotelceller antigener CD31 og CD34 og CD144 og CD146 og FLT-1, FLK-1, FLT-4, og Nrp2 men uttrykte ikke blodkreft antigener CD45 og CD14 og CD11b, cKit, CXCR4 eller AC133 7, 8.

Figur 3.
Figur 3. Representant in vitro kvantifisering av clonogenic og proliferativ potensial CB avledet ECFCs. (A) ledningen blod-Deriverte ECFCs vise klonal proliferativ potensial med et hierarki av kolonier fra klynger av 2-50 celler opp til kolonier av> 2001. (B) mikrografer for hierarki av kolonier (kolonier farget med, Sytox, en grønn fluorescerende fargestoff kjernefysisk å ta bedre kvalitet bilder) oppnås etter ledningen blod-avledet ECFCs ble kultivert ved en enkelt celle nivå i 14 dager. Scale bar representerer 7 100μm, 8.

Figur 4.
Figur 4. Representant in vivo funksjonell karakterisering av ledningen blod-deriverte ECFCs. A) H & E farging av ledningen blod-avledet ECFC inneholder cellularized gel implantater indikert microvessel (fylt med verten RBCs) dannelse i kollagen-fibronectin gel etter 14 dager med implantasjon. B) Anti-human CD31 flekker (brun farging) bekrefter ytterligere den menneskelige opprinnelsen til disse fartøyene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Fenotypisk og funksjonell karakterisering av antatte endoteliale progenitorceller er viktig å identifisere de godtroende ECFCs som er i stand clonally og serielt re-plating i kultur og gi opphav til holdbare og funksjonelle implanterbare blodkar in vivo. Menneskelig navlestrengsblod er beriket med ECFCs og konsentrasjonen av disse sirkulerende celler avtar med aldring eller sykdom 10. Nyere studier tyder på at ECFC kan spille viktige roller i vaskulær reparasjon eller fornyelse i situasjoner med vaskulær skade, myokardinfarkt eller retinopati 17-19.

Her har vi beskrevet enkle og effektive metoder for avledning, kloning, ekspansjon, og in vitro, samt in vivo karakterisering av ECFCs fra menneskelig umbilical CB. Disse metodene gjør forskerne å identifisere og isolere bona fide EPCs fra CB som besitter klonal proliferativ potensial og

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklært.

Acknowledgments

Dr. Yoder er konsulent for EndGenitor Technologies, Inc. og et medlem av styret i Rimedion Technologies, Inc.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Heparin Sodium Injection, USP APP Pharmaceuticals 504031
Ficoll-Pague Amersham 17-1440-03
Mixing cannula Maersk Medical 500.11.012
EGM-2 Lonza Inc. CC-3162
Defined FBS Hyclone SH30070.03
TrypLE express GIBCO, by Life Technologies 12605
Rat type I collagen BD Biosciences 354236
Matrigel BD Biosciences 356234
FcR Block Miltenyi Biotec 130-059-901
hCD31, FITC conjugated BD Biosciences 555445
hCD45, FITC conjugated BD Biosciences 555482
hCD14, FITC conjugated BD Biosciences 555397
hCD144, PE conjugated eBioscience 12-1449-80
hCD146, PE conjugated BD Biosciences 550315
hCD105, PE conjugated Invitrogen MHCD10504
Ms IgG1,k antibody, FITC conjugated BD Biosciences 555748
Ms IgG1,k antibody, PE conjugated BD Biosciences 559320
Ms IgG2a,k antibody, FITC conjugated BD Biosciences 555573
Anti-human CD31 Dako clone JC70/A
Anti-mouse CD31 BD Biosciences 553370
0.22-μm vacuum filtration system EMD Millipore SCGPU05RE
Glacial acetic acid, 17.4N Fisher Scientific A38-500
Antibiotic-Antimycotic Invitrogen 15240-062
Fetal bovine serum (FBS) Hyclone SH30070.03
IHC Zinc Fixative BD Biosciences 550523
Sytox green reagent Invitrogen S33025
Cloning cylinders, sterile Fisher Scientific 07-907-10

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carmeliet, P., Jain, R. K. Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis. Nature. 473, 298-307 (2011).
  2. Asahara, T. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science. 275, 964-967 (1997).
  3. Urbich, C., Dimmeler, S. Endothelial progenitor cells: characterization and role in vascular biology. Circ. Res. 95, 343-353 (2004).
  4. Critser, P. J., Voytik-Harbin, S. L., Yoder, M. C. Isolating and defining cells to engineer human blood vessels. Cell. Prolif. 44, 15-21 (2011).
  5. Matthias, M., David, N., Josef, N. From bench to bedside: what physicians need to know about endothelial progenitor cells. Am. J. Med. 124, 489-4897 (2011).
  6. Ingram, D. A. Vessel wall-derived endothelial cells rapidly proliferate because they contain a complete hierarchy of endothelial progenitor cells. Blood. 105, 2783-276 (2005).
  7. Ingram, D. A. Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood. Blood. 104, 2752-2760 (2004).
  8. Yoder, M. C. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109, 1801-1809 (2007).
  9. Reinisch, A., Strunk, D. Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells (ECFCs. J. Vis. Exp. (32), e1525 (2009).
  10. Au, P. Differential in vivo potential of endothelial progenitor cells from human umbilical cord blood and adult peripheral blood to form functional long-lasting vessels. Blood. 111, 1302-135 (2008).
  11. Critser, P. J., Kreger, S. T., Voytik-Harbin, S. L., Yoder, M. C. Collagen matrix physical properties modulate endothelial colony forming cell-derived vessels in vivo. Microvasc. Res. 80, 23-30 (2010).
  12. Melero-Martin, J. M. Engineering robust and functional vascular networks in vivo with human adult and cord blood-derived progenitor cells. Circ. Res. 103, 194-202 (2008).
  13. Melero-Martin, J. M. In vivo vasculogenic potential of human blood-derived endothelial progenitor cells. Blood. 109, 4761-4768 (2007).
  14. Hofmann, N. A., Reinisch, A., Strunk, D. Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (32), e1524 (2009).
  15. Lin, Y., Weisdorf, D. J., Solovey, A., Hebbel, R. P. Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood. J. Clin. Invest. 105, 71-77 (2000).
  16. Witting, S. R. Efficient Large Volume Lentiviral Vector Production Using Flow Electroporation. Hum. Gene. Ther. , (2011).
  17. Yoon, C. H. Synergistic neovascularization by mixed transplantation of early endothelial progenitor cells and late outgrowth endothelial cells: the role of angiogenic cytokines and matrix metalloproteinases. Circulation. , 112-1618 (2005).
  18. Dubois, C. Differential effects of progenitor cell populations on left ventricular remodeling and myocardial neovascularization after myocardial infarction. J. Am. Coll. Cardiol. 55, 2232-2243 (2010).
  19. Medina, R. J., O'Neill, C. L., Humphreys, M. W., Gardiner, T. A., Stitt, A. W. Outgrowth endothelial cells: characterization and their potential for reversing ischemic retinopathy. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51, 5906-5913 (2010).

Tags

Cellular Biology endoteliale koloni-dannende celler (ECFCs) endoteliale progenitorceller (EPCs) enslig celle koloni forming analysen post-natal vasculogenesis cellekultur kloning
Fenotypisk og Funksjonell Karakterisering av endoteliale Colony forming celler avledet fra humant navlestrengsblod
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Prasain, N., Meador, J. L., Yoder,… More

Prasain, N., Meador, J. L., Yoder, M. C. Phenotypic and Functional Characterization of Endothelial Colony Forming Cells Derived from Human Umbilical Cord Blood. J. Vis. Exp. (62), e3872, doi:10.3791/3872 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter