Summary
मात्रात्मक वास्तविक समय पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (qPCR) एक तेजी से और संवेदनशील ट्यूमर के नमूनों में विभिन्न microRNA की अभिव्यक्ति के स्तर (miRNA) अणुओं की जांच के विधि है. अलग miRNA अणुओं के सैकड़ों की इस विधि अभिव्यक्ति का उपयोग करना, प्रवर्धित किया जा सकता है मात्रा, और एक ही सीडीएनए टेम्पलेट से विश्लेषण किया है.
Protocol
1. प्रोस्टेट नमूना संग्रह
- Prostatectomy के समय में प्रोस्टेट के नमूने ले लीजिए. नमूना शारीरिक स्थलों का उपयोग कर उन्मुख है. प्रोस्टेट और लाभदायक vesicles के रूप में चित्रित कर रहे हैं: सही पक्ष हरी, बाईं ओर नीला है.
- प्रोस्टेट के एक यादृच्छिक अनुप्रस्थ midsection सीधा गुदा सतह के लिए लिया जाता है, तरल नाइट्रोजन में जमे हुए, और -80 ° 9 सी पर संग्रहीत है.
- नमूनों की बैंकिंग स्लाइस फोटोकॉपी, उन्मुख (पूर्वकाल, पीछे, सही है और छोड़), quadrisected हैं. धारा cryostat का उपयोग कर काट रहे हैं.
- धारा एच ई के साथ दाग रहे हैं और निर्धारित करने के लिए एक और दाग स्लाइड और एक इसी छवि पर ट्यूमर बनाम सामान्य क्षेत्रों को चित्रित करना रोगविज्ञानी द्वारा समीक्षा की. चिह्नित क्षेत्रों क्षेत्रों में से जो ट्यूमर ऊतक से जो शाही सेना के बाद के चरणों में निकाला जाएगा निकालने को इंगित करने के लिए एक गाइड के रूप में उपयोग किया जाता है.
2. नमूने से अलग miRNA मिलाकर कुल शाही सेना,
- शुष्क बर्फ और चित्रित फोटोकॉपी बात पर जमे हुए प्रोस्टेट नमूने, प्रोस्टेट ट्यूमर का एक छोटा सा हिस्सा (50 से 100 मिलीग्राम के बीच) में कटौती.
- TRIzol अभिकर्मक के 1 एमएल में प्रोस्टेट ट्यूमर ऊतक Homogenize. निम्न चरणों में मात्रा TRIzol अभिकर्मक के 1 एमएल के उपयोग पर आधारित हैं.
नोट: यहाँ हम निकालने शाही सेना के लिए TRIzol अभिकर्मक का इस्तेमाल किया है, लेकिन अन्य किट है कि छोटे से शाही सेना को अलग से युक्त कुल शाही सेना भी इस्तेमाल किया जा सकता है.
- कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए homogenized नमूने सेते हैं.
- नमूने के लिए क्लोरोफॉर्म की 0.2 एमएल जोड़ें और 15 सेकंड के लिए सख्ती से हिला. कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए नमूने सेते हैं, तो 4 बजे 15 मिनट के लिए 12,000 XG पर अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस
- ताजा ट्यूब बेरंग ऊपरी जलकृत चरण के स्थानांतरण, और isopropyl शराब के 0.5 एमएल जोड़ें.कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए नमूने सेते हैं, तो 4 बजे 10 मिनट के लिए 12,000 XG पर अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस
- शाही सेना युक्त गोली परेशान बिना ध्यान से सतह पर तैरनेवाला महाप्राण (व्यंजन). 1 75% इथेनॉल एमएल के साथ शाही सेना गोली धो लें. भंवर नमूना और 4 में फिर से तलछट XG ७,५०० में 5 मिनट के लिए centrifugation द्वारा डिग्री सेल्सियस
- 5-10 मिनट के लिए ध्यान से सतह पर तैरनेवाला और सूखी आरएनए गोली महाप्राण (व्यंजन), यकीन है कि शाही सेना गोली पूरी तरह से सूखे नहीं है. Nuclease मुक्त गोली आकार के लिए उपयुक्त पानी में फिर से भंग है. शाही सेना की एकाग्रता NanoDrop 1000 स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (260 एनएम और 280 एनएम पर उपाय absorbance के) का उपयोग कर उपाय.
- और शाही सेना के नमूने का उपयोग कर Agilent है Bioanalyzer की गुणवत्ता, अखंडता की जाँच करें.
3. शाही सेना की रिवर्स प्रतिलेखन
- शाही सेना की रिवर्स प्रतिलेखन निर्माता (क्विएज़न) के निर्देश के अनुसार miScript रिवर्स प्रतिलेखन किट का उपयोग किया गया था. इस किट में शामिलरिवर्स ट्रांसक्रिपटेस और एक पाली (ए) पोलीमरेज़. miScript आरटी बफर 2 मिलीग्राम शामिल हैं, dNTPs, oligo-dt प्राइमरों, और यादृच्छिक प्राइमरों.
- 10 स्नातकोत्तर और शाही सेना के 1 μg सीडीएनए synthesize करने के बीच का प्रयोग करें. शाही सेना के अधिक से अधिक 1 μg का उपयोग अगर, रैखिक प्रतिक्रिया उचित मात्रा पैमाने पर.
- एक मास्टर मिश्रण तैयार कि 5X miScript आरटी बफर (4 μl), miScript रिवर्स प्रतिलेखन मिक्स (1 μl), और RNase मुक्त पानी 20 μl की अंतिम मात्रा करने के लिए प्रतिक्रियाओं लाने के शामिल है. इसके अलावा मास्टर मिश्रण में टेम्पलेट शाही सेना (1 μg) शामिल हैं.
- 60 मिनट के लिए 37 नमूने सेते हैं डिग्री सेल्सियस 5 मिनट के लिए एक ऊष्मायन से 95 डिग्री सेल्सियस पर तुरंत पीछा यह कदम एक पीसीआर मशीन में किया जा सकता है, ब्लॉक, या पानी स्नान हीटिंग. Thermocyclers सबसे उपयुक्त और सही तरीका है. बर्फ पर सीडीएनए अल्पावधि के लिए, स्टोर और लंबी अवधि के भंडारण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस.
4. एक मानक वक्र उत्पन्न
- अनुभव करने के लिए पहलेलक्ष्य miRNAs साथ iment, एक मानक वक्र उनके पार अंक (वाणिज्यिक पत्र) (चित्रा 2) के खिलाफ ज्ञात सांद्रता के cDNAs का उपयोग करके उत्पन्न होता है.
- 2 गुना, 10 गुना, 50 गुना, 250 गुना, और एक नमूना है कि ब्याज के अपने जीन की एक पर्याप्त अभिव्यक्ति के लिए जाना जाता है की 1250-गुना मूल सीडीएनए dilutions की एक श्रृंखला तैयार.
- पीसीआर भागो धारा 5 miRNA का पता लगाने के लिए वास्तविक समय पीसीआर में निर्दिष्ट के रूप में संशोधन के लिए है कि धारावाहिक स्थिर 40x नहीं मन्दन dilutions में सीडीएनए है के साथ,.
- RelQuant सॉफ्टवेयर (Roche) का उपयोग करने के लिए अपने मानक वक्र उत्पन्न विश्लेषण प्रदर्शन करते हैं.
नोट: एक नया मानक वक्र ब्याज की प्रत्येक जीन के लिए उत्पन्न किया जाना चाहिए.
5. MiRNA की जांच के लिए वास्तविक समय पीसीआर
- MiRNAs के लिए वास्तविक समय पीसीआर के निर्माता (क्विएज़न) के निर्देश के अनुसार miScript SYBR ग्रीन पीसीआर किट और miScript के प्राइमर परख का उपयोग किया गया था. एक मास्टर युक्त मिश्रण तैयार2x QuantiTect SYBR ग्रीन पीसीआर मास्टर मिक्स, 10x miScript यूनिवर्सल प्राइमर, 10x miScript प्राइमर परख, और RNase मुक्त पानी. एक 20 μl मात्रा प्रतिक्रिया के लिए एक मास्टर मिश्रण तैयार करें.
- भजन की पुस्तक परख ब्याज की miRNA के लिए विशिष्ट है. पुनर्गठित 10x miScript प्राइमर परख, शीशी संक्षिप्त अपकेंद्रित्र, और जोड़ने के 550 μl ते बफर, 8.0 पीएच. भंवर शीशी संक्षेप में मिश्रण करने के लिए, छोटे संस्करणों के लिए अशेष भाजक प्राइमरों, -20 डिग्री सेल्सियस पर और दुकान दो प्राइमरों की आवश्यकता है: लक्ष्य जीन और जीन संदर्भ के लिए प्राइमरों RNU6B usedas संदर्भ जीन है.
- -20 डिग्री सेल्सियस पर सीडीएनए 40x और दुकान अतिरिक्त aliquots पतला
- सीडीएनए पीसीआर के लिए टेम्पलेट के रूप में कार्य करता है. 2 40x पतला सीडीएनए की μl का प्रयोग करें और 20 μl प्रकाश cycler के capillaries (Roche) करने के लिए बग़ैर.
- प्रत्येक केशिका मास्टर मिश्रण के 18 μl जोड़ें, और एक केशिका अनुकूलक का उपयोग अपकेंद्रित्र.
- एक केशिका ऐसे 3 LightCycler के रूप में आधारित cycler वास्तविक समय में capillaries रखें.5 वास्तविक समय पीसीआर सिस्टम एक हिंडोला 32 केशिका प्रारूप के साथ.
- के रूप में निम्नानुसार पीसीआर साइकिल प्रोग्राम चलाएँ:
सक्रिय HotStarTaq पोलीमरेज़ कि 2x QuantiTect SYBR ग्रीन पीसीआर मास्टर मिक्स में है, पूर्व में 95 सेते हैं ° सी 15 मिनट के लिए.
के 50 चक्र द्वारा पीछा किया:
विकृतीकरण, 15, 94 डिग्री सेल्सियस;
एनीलिंग, 30, 55 डिग्री सेल्सियस;
विस्तार, 30, 70 डिग्री सेल्सियस - एक नमूना चुनें अंशशोधक होना है, और 1 के लिए अपने सामान्यीकृत लक्ष्य राशि निर्धारित है. अंशशोधक के लिए सभी अन्य नमूनों में miRNA के रिश्तेदार अभिव्यक्ति से तुलना कर लें.
नोट: एक अध्ययन के भीतर, वही औजार नमूना परिणामों की स्थिरता को बनाए रखने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए.
6. डेटा का विश्लेषण
- पीसीआर प्रतिक्रियाओं के लिए प्रवर्धन घटता रेखांकन और संख्यानुसार आण्विक बायोकेमिकल्स LightCycler सॉफ्टवेयर संस्करण 3.5 (Roche) द्वारा चित्रित कर रहे हैं. "मात्रा" टैब में प्रतिक्रियाओं यों,एन डी एक पाठ फ़ाइल से डेटा निर्यात.
- RelQuant विश्लेषण सॉफ्टवेयर (Roche) के लिए डेटा आयात करने के लिए मात्रा का ठहराव परिणाम उत्पन्न. लक्ष्य जीन, संदर्भ, जीन और मानक वक्र डेटा के लिए अलग - अलग फ़ाइलों आयात.
- दोनों लक्ष्य और संदर्भ जीन के लिए अंशशोधक की स्थिति निर्दिष्ट करें. इसके अलावा नमूनों की स्थिति निर्दिष्ट. डेटा लक्ष्य अलग अंशशोधक के संदर्भ अनुपात के लक्ष्य से विभाजित नमूने के अनुपात के संदर्भ के रूप में व्यक्त किया है. मानक वक्र पहले एक विशेष miRNA और जीन गृह व्यवस्था के लिए उत्पन्न अज्ञात सांद्रता के miRNA लक्ष्य के लिए मात्रात्मक डेटा extrapolating के लिए एक संदर्भ मानक के रूप में प्रयोग किया जाता है.
- तीन प्रतिकृति के नमूने को एक समूह के रूप में विश्लेषण कर रहे हैं और मतलब सांद्रता और तीन प्रतियों का मानक विचलन की गणना है. यदि triplicates का एक सेट के आराम के साथ असंगत है, यह कार्यक्रम से बाहर रखा जाएगा.
7. प्रतिनिधि परिणाम
<पी वर्ग = "jove_content"> प्रोस्टेट नमूनों पर qPCR विश्लेषण का एक उदाहरण 3 चित्र में दिखाया जाता है. परिणाम संख्यानुसार चित्रित कर रहे हैं, के रूप में अच्छी तरह के रूप में रेखांकन. संदर्भ जीन, U6 की अभिव्यक्ति के स्तर दिखाने के रेखांकन, के बारे में 20 चक्र में घातीय प्रवर्धन शुरू करने के लिए, जबकि लक्ष्य जीन, मीर-98, की अभिव्यक्ति 25 चक्र में देरी प्रवर्धन लगभग पता चला है. इस प्रयोग से डेटा को पाठ फ़ाइल के रूप में निर्यात किया गया था और RelQuant विश्लेषण सॉफ्टवेयर से विश्लेषण किया. Capillaries के पदों अंशशोधक और नमूने युक्त निर्दिष्ट कर रहे हैं. चित्रा 4 दिखाता है कैसे कैलीब्रेटर 1 सेट कर दिया जाता है, और अन्य अंशशोधक के लिए रिश्तेदार के नमूने की अभिव्यक्ति है.
चित्रा 1 रिवर्स और प्रतिलेखन miScript और वास्तविक समय पीसीआर में विभिन्न चरणों.
चित्रा 2. एक मानक वक्र 2 गुना, 10 गुना, 50 गुना, 250 गुना, और 1250-गुना मूल सीडीएनए नमूना dilutions की एक श्रृंखला का उपयोग करके उत्पन्न होता है.
चित्रा 3. Roche आण्विक बायोकेमिकल्स LightCycler सॉफ्टवेयर रेखांकन प्रयोग और पाठ द्वारा पूरी जानकारी से पता चलता है. मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर प्रवर्धन भूखंडों प्रतिदीप्ति में विभिन्न नमूनों से वृद्धि दिखा.
चित्रा 4 डेटा RelQuant LightCycler विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग मात्रा गया. आमतौर पर, तीन नमूने की प्रतिकृति एक समूह और नमूने है कि उत्पादन स्पष्ट रूप से असंगत परिणाम अपवर्जित कर रहे हैं और मतलब सांद्रता और तीन प्रतियों का मानक विचलन परिकलित किया जाता है के रूप में विश्लेषण कर रहे हैं.
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Discussion
कुछ miRNAs की न्यायपालिका का भाव लगातार किया गया है जब सामान्य 10 ऊतक, और इन miRNAs के कुछ प्रोस्टेट कैंसर के खिलाफ 11 संभावित उपन्यास चिकित्सात्मक एजेंट के रूप में नामित किया गया है की तुलना में प्रोस्टेट ट्यूमर में पाया. इसलिए miRNAs की न्यायपालिका अभिव्यक्ति के स्तर उपयोगी नैदानिक और / या शकुन biomarkers हो सकता है. वास्तविक समय qPCR यहाँ प्रस्तुत पद्धति प्रोस्टेट ट्यूमर ऊतकों में miRNA के स्तर की सही मात्रा का ठहराव के लिए एक परख प्रदान करता है. miScript पीसीआर प्रणाली इस्तेमाल किया परिपक्व miRNAs के बीच एकल nucleotide मतभेदों का पता लगा सकते हैं. miScript miRNA qPCR Assays, तथापि, स्टेम पाश अग्रदूत miRNAs, जिसके लिए अलग miScript अग्रदूत साबित Assays उपलब्ध हैं का पता लगाने के लिए इरादा नहीं कर रहे हैं.
इस तकनीक की विश्वसनीयता इनपुट शाही सेना की गुणवत्ता पर निर्भर करता है, इसलिए एकाग्रता, अखंडता, और शुद्धता और शाही सेना के पूर्व वास्तविक समय पीसीआर के लिए परीक्षण किया जाना चाहिए. इसके अलावा, ribonucleases बहुत stablए और आसानी से शाही सेना नीचा है, इस प्रकार अतिरिक्त सावधानी शाही सेना के निपटने में लिया जाना चाहिए. सभी प्रतिक्रियाओं बर्फ पर स्थापित किया जाना चाहिए आरएनए गिरावट को कम करने. RNase inhibitors के भी प्रतिलेखन रिवर्स पूर्व प्रतिक्रिया के लिए जोड़ा जा सकता है. दस्ताने अक्सर बदल चाहिए, जबकि बाँझ और प्रयोज्य plasticware प्रक्रिया के दौरान इस्तेमाल किया जाना चाहिए.
अगर वहाँ कोई पीसीआर उत्पाद या प्रवर्धन वक्र वास्तविक समय पीसीआर में देर से पता चला है, पीसीआर चक्र की संख्या बढ़ रही है कोशिश, और सुनिश्चित करें कि साइकिल कार्यक्रम HotStarTaq डीएनए पोलीमरेज़ के 15 मिनट के लिए 95 ° सी. सक्रियण शामिल कम प्रवर्धन भी अपर्याप्त शुरू सीडीएनए टेम्पलेट के लिए कारण हो सकता है, इसलिए सीडीएनए की राशि बढ़ाने की कोशिश. देर प्रवर्धन भी एक झूठी सकारात्मक का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस काम कनाडा के कैंसर सोसायटी अनुसंधान संस्थान द्वारा वित्त पोषित किया गया था, कोई अनुदान. +०१९०३८.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596 | |
| miScript Reverse Transcription Kit | Qiagen | 218061 | |
| miScript Primer Assays | Qiagen | Experiment specific | |
| miScript SYBR Green PCR Kit | Qiagen | 218073 | |
| LightCycler 3.5 Real-Time PCR System | Roche Group | ||
| Light Cycler Capillaries | Roche Group | 04929292001 | |
| NanoDrop 1000 spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 2538 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | G2943CA |
References
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