Summary
Cuantitativa de la polimerasa en tiempo real de reacción en cadena (PCR cuantitativa) es un método rápido y sensible para investigar los niveles de expresión de microARN (miRNA varias) moléculas en las muestras tumorales. El uso de este método de expresión de cientos de moléculas de diferentes miARN puede ser amplificada, cuantificado y analizado desde la misma plantilla de cDNA.
Abstract
Los microARN (miRNA) son de cadena sencilla, 18-24 nucleótidos de largo, no codificantes moléculas de ARN. Ellos están involucrados en prácticamente todos los procesos celulares incluyendo el desarrollo de 1, 2 la apoptosis y la regulación del ciclo celular 3. MiRNAs se estima que regulan la expresión de 30% a 90% de los genes humanos 4 mediante la unión a sus ARNs diana mensajero (ARNm) 5. La desregulación generalizada de los miRNAs se ha informado en diversas enfermedades y subtipos de cáncer 6. Debido a su prevalencia y la estructura única, estas pequeñas moléculas tienden a ser la próxima generación de biomarcadores, agentes terapéuticos y / o objetivos.
Los métodos utilizados para investigar la expresión de miRNA son SYBR Green I con base de tinte, así como Taqman-qPCR basado en la sonda. Si los miRNAs se utiliza con eficacia en el ámbito clínico, es imprescindible que su detección en muestras clínicas frescas y / o archivados ser exacto, reproducible, y specific. qPCR ha sido ampliamente utilizado para la validación de expresión de miRNAs en los análisis de todo el genoma, tales como estudios de microarrays 7. Las muestras utilizadas en este protocolo fueron de pacientes que se sometieron a prostatectomía radical por cáncer de próstata clínicamente localizado, sin embargo otros tejidos y líneas celulares se pueden sustituir in biopsias de próstata fueron broche de congelados en nitrógeno líquido después de la resección. Las variables clínicas y la información de seguimiento para cada paciente se recogieron para su análisis posterior 8.
La cuantificación de los niveles de miRNA en muestras de tumores de próstata. Los pasos principales en el análisis de qPCR de los tumores son: extracción de RNA total, síntesis de ADNc, y la detección de productos específicos qPCR utilizando miRNA-cebadores. El ARN total, que incluye mRNA, Mirna, y otros pequeños RNAs fueron extraídos de las muestras con el reactivo TRIzol. Sistema de Qiagen miScript fue utilizado para sintetizar cDNA y realizar qPCR (Figura 1). MiRNAs endógenos no son polyadenylated, tanto durante el proceso de transcripción inversa, un poli (A) polimerasa polyadenylates el miARN. El miARN se utiliza como una plantilla para sintetizar cDNA utilizando oligo-dT y la transcriptasa inversa. Una secuencia de etiqueta universal en el extremo 5 'de los cebadores de oligo-dT facilita la amplificación de cDNA en el paso de PCR. Amplificación por PCR producto es detectado por el nivel de fluorescencia emitida por SYBR Green, un colorante que se intercala en el ADN de doble cadena. Cebadores específicos miARN, junto con una imprimación universal que se une a la secuencia de etiqueta universal amplificar secuencias específicas miARN.
Los ensayos Primer miScript están disponibles para más de un millar de miRNAs específicos de los humanos, y cientos de ratón específicos de miRNAs. Método de cuantificación relativa se utiliza aquí para cuantificar la expresión de miRNAs. Para corregir la variabilidad entre las diferentes muestras, los niveles de expresión de un miARN objetivo se normaliza a los niveles de expresión de un gen de referencia. La elección de un GEne en que para normalizar la expresión de los objetivos es crítico en el método de cuantificación relativa de análisis. Ejemplos de genes de referencia típicamente utilizados en esta capacidad son la RNU6B ARN pequeño, RNU44, y RNU48 ya que se consideran para ser expresado de forma estable en la mayoría de las muestras. En este protocolo, RNU6B se utiliza como el gen de referencia.
Protocol
1. Recogida de muestras de próstata
- Recoger las muestras de la próstata en el momento de la prostatectomía. La muestra se orienta utilizando puntos de referencia anatómicos. La próstata y las vesículas seminales están pintadas de la siguiente manera: verde, lado derecho, lado izquierdo azul.
- Una sección media transversal al azar de la próstata se toma perpendicularmente a la superficie rectal, se congelaron en nitrógeno líquido, y se almacenó a -80 ° C 9.
- Rebanadas de muestras depositadas son fotocopias, orientado (anterior, posterior, derecha e izquierda), quadrisected. Las secciones se cortan con el criostato.
- Las secciones se tiñeron con H & E y revisado por un patólogo para determinar y delimitar las áreas tumorales en comparación con lo normal en las diapositivas de colores y una imagen correspondiente. Las áreas marcadas son usadas como una guía para indicar las zonas de la que extraer el tejido tumoral de que el ARN se extrajo en los pasos subsiguientes.
2. Aislamiento de ARN total, incluidos el miRNA, a partir de muestras
- Colocar las muestras congeladas de próstata en hielo seco y refiriéndose a la delineada fotocopia, cortar una pequeña porción del tumor de próstata (entre 50 a 100 mg).
- Homogeneizar el tejido del tumor de próstata en 1 ml de reactivo TRIzol. Las cantidades en los siguientes pasos se basan en el uso de 1 ml de reactivo TRIzol.
Nota: Aquí hemos utilizado reactivo TRIzol para extraer ARN, sin embargo otros kits que aíslan pequeños ARN que contienen ARN total también se puede utilizar.
- Se incuban las muestras homogeneizadas durante 5 minutos a temperatura ambiente.
- Añadir 0,2 ml de cloroformo para las muestras y agitar enérgicamente durante 15 segundos. Incubar las muestras durante 3 minutos a temperatura ambiente, luego se centrifuga a 12.000 xg durante 15 minutos a 4 ° C.
- Transferir la fase acuosa superior incolora a tubos nuevos, y añadir 0,5 ml de alcohol isopropílico.Incubar las muestras durante 10 minutos a temperatura ambiente, luego se centrifuga a 12.000 xg durante 10 minutos a 4 ° C.
- Aspirar cuidadosamente el sobrenadante sin perturbar el sedimento que contiene el ARN. Lavar el precipitado de ARN con 1 ml de etanol al 75%. Vortex la muestra y de re-sedimento por centrifugación durante 5 minutos a 7.500 xg a 4 ° C.
- Aspirar cuidadosamente el sobrenadante y secar el pellet de ARN durante 5-10 minutos, asegurándose de que el precipitado de ARN no está completamente seca. Vuelva a disolver en agua libre de nucleasa apropiado para el tamaño de pellets. Medir la concentración de ARN utilizando el espectrofotómetro NanoDrop 1000 (absorbancia medida a 260 nm y 280 nm).
- Compruebe la calidad y la integridad de las muestras de ARN utilizando Agilent Bioanalyzer.
3. La transcripción inversa del ARN
- La transcripción inversa del ARN se realizó utilizando el Kit de miScript transcripción reversa de acuerdo a las instrucciones del fabricante (Qiagen). Este kit incluye untranscriptasa inversa y una polimerasa poli (A). El tampón miScript RT incluye Mg 2 +, dNTPs, oligo-dT primers y cebadores aleatorios.
- Utilizar entre 10 pg y 1 g de ARN para sintetizar ADNc. Si utiliza más de 1 mg de ARN, ampliar la reacción linealmente con el volumen apropiado.
- Prepare una mezcla maestra que contiene 5 veces miScript RT Buffer (4 l), Reverse miScript Mix transcripción (1 l), y el agua libre de ARNasa para que las reacciones a volumen final de 20 l. También se incluyen plantillas de ARN (hasta 1 g) en la mezcla maestra.
- Se incuban las muestras durante 60 minutos a 37 ° C, seguido inmediatamente por una incubación durante 5 minutos a 95 ° C. Este paso puede realizarse en una máquina de PCR, calentando baño bloque, o agua. Termocicladores son el método más adecuado y preciso. Guarde el cDNA en el hielo para el corto plazo, y -20 ° C para el almacenamiento a largo plazo.
4. Generación de una curva estándar
- Antes de experperimento con miARNs diana, una curva estándar se genera mediante el uso de cDNAs de concentraciones conocidas en contra de sus puntos de cruce (CP) (Figura 2).
- Preparar una serie de diluciones de dos veces, 10 veces, 50 veces, 250-veces, y 1250-pliegue del cDNA original de una muestra que se sabe que tiene una expresión sustancial de su gen de interés.
- Ejecute el PCR como se especifica en la Sección 5 "en tiempo real PCR para la detección de miRNA", con la salvedad de que ADNc está en diluciones en serie no es una dilución 40x estática.
- Realizar un análisis utilizando el software de RelQuant (Roche) para generar la curva estándar.
Nota: una nueva curva estándar se debe generar para cada gen de interés.
5. PCR en tiempo real para la detección de miRNA
- PCR en tiempo real de miRNAs se ha realizado mediante miScript SYBR Green PCR kit de ensayo y miScript Primer acuerdo a las instrucciones del fabricante (Qiagen). Prepare una mezcla maestra que contenía2x QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix, 10x Primer miScript Universal, ensayo 10x Primer miScript, y el agua libre de RNasa. Prepare una mezcla maestra para una reacción de volumen de 20 l.
- El Ensayo de imprimación es específica para el miARN de interés. Para reconstituir 10x Ensayo imprimación miScript, centrifugar el vial brevemente, y añadir 550 l de tampón TE, pH 8,0. Vortex el vial brevemente para mezclar, cebadores alícuotas a volúmenes más pequeños, y almacenar a -20 ° C. Dos cebadores se requiere:. Cebadores para el gen diana y el gen de referencia RNU6B usedas es el gen de referencia.
- Diluir las alícuotas de cDNA adicionales 40x y almacenar a -20 ° C.
- ADNc sirve como molde para la PCR. Utilice 2 l de cDNA diluido 40x y dispensar a los 20 l luz de ciclo, los capilares (Roche).
- Añadir 18 l de la mezcla maestra a cada capilar, y centrifugar utilizando un adaptador capilar.
- Coloque los vasos capilares en un capilar basada en tiempo real termociclador, como LightCycler 3.5 Real-Time PCR System con un formato de carrusel 32-capilar.
- Ejecutar el programa de ciclos de PCR como sigue:
Para activar la polimerasa HotStarTaq que está en el 2x QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix, pre-incubar a 95 ° C durante 15 minutos.
Seguido por 50 ciclos de:
La desnaturalización, 15 s, 94 ° C;
Recocido, 30 s, 55 ° C;
Extensión, 30 s, 70 ° C. - Selección de una muestra para ser el calibrador, y establecer su importe objetivo normalizado a 1. Comparar la expresión relativa de los genes miARN en todas las otras muestras en el calibrador.
Nota: En un estudio, la misma muestra de calibración se debe utilizar para mantener la consistencia de los resultados.
6. Análisis de datos
- Curvas de amplificación de la reacción de PCR se representan de forma gráfica y numérica por la versión del software Molecular bioquímicos LightCycler 3.5 (Roche). Cuantificar las reacciones en la "cuantificación" ficha, unaª exportar los datos a un archivo de texto.
- Importar los datos al software de análisis RelQuant (Roche) para generar resultados de la cuantificación. Importación de archivos separados para gen diana, el gen de referencia, y los datos estándar de la curva.
- Especifique la posición del calibrador para tanto el objetivo como gen de referencia. También debe especificar las posiciones de las muestras. Los datos se expresan como el objetivo para hacer referencia a relación de las diferentes muestras, dividido por el objetivo de proporción de referencia del calibrador. La curva estándar generada previamente por un miRNA particular y limpieza de genes se utiliza como patrón de referencia para la extrapolación de los datos cuantitativos de los genes miARN objetivos de concentraciones desconocidas.
- Tres repeticiones de muestras son analizadas como un grupo y las concentraciones medias y desviaciones estándar de la triplicado, se calcula. Si uno de los triplicados es incompatible con el resto del conjunto, se excluyó por el programa.
7. Los resultados representativos
<clase p = "jove_content"> Un ejemplo de qPCR análisis sobre muestras de próstata se muestra en la Figura 3. Los resultados se representan numéricamente, así como gráficamente. Los gráficos que muestran los niveles de expresión del gen de referencia, U6, comenzar la amplificación exponencial a aproximadamente ciclo 20, mientras que la expresión del gen diana, MIR-98, mostró una amplificación retraso aproximadamente en el ciclo 25. Los datos de este experimento se exporta como archivo de texto y analizadas por el software de análisis RelQuant. Las posiciones de los capilares que contienen el calibrador y las muestras se especifican. Figura 4 ilustra cómo el calibrador está dispuesto a ser 1, y la expresión de otras muestras relativas al calibrador.
Figura 1. Varios pasos en miScript transcripción inversa y PCR en tiempo real.
Figura 2. Una curva estándar se genera mediante una serie de diluciones de dos veces, 10 veces, 50 veces, 250-veces, y 1250-pliegue del cDNA muestra original.
Figura 3. Roche Molecular bioquímicos LightCycler Software muestra la información completa de la experiencia gráfica y de texto. Cuantitativa en tiempo real las parcelas de amplificación de PCR muestran un aumento en la fluorescencia de las muestras diferentes.
Datos de la Figura 4. Se cuantificaron utilizando el software de análisis de RelQuant LightCycler. Por lo general, tres réplicas de las muestras se analizan como un grupo y las muestras que producen resultados claramente inconsistentes son excluidos y las concentraciones medias y desviaciones estándar de la triplicado, se calcula.
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Discussion
Expresiones aberrantes de algunos miRNAs han sido encontrados en los tumores de próstata en comparación con el tejido normal de 10, y algunos de estos miRNAs han sido mencionados como potenciales nuevos agentes terapéuticos contra el cáncer de próstata 11. Por lo tanto los niveles de expresión de miRNAs aberrantes pueden ser útiles biomarcadores de diagnóstico y / o pronóstico. La metodología qPCR en tiempo real se presenta aquí proporciona un ensayo para la cuantificación exacta de los niveles de miRNA en los tejidos tumorales de próstata. El sistema miScript PCR utilizado puede detectar diferencias individuales de nucleótidos entre los miRNAs maduros. Los ensayos miARN miScript qPCR, sin embargo, no se destina a la detección de miRNAs madre precursoras de asa, para el que diferentes ensayos precursores miScript están disponibles.
La fiabilidad de esta técnica depende de la calidad de la entrada de ARN, por lo tanto, la concentración, la integridad y la pureza del ARN debe ser probado antes de la PCR en tiempo real. Además, ribonucleasas son muy Stablcorreo y de fácil degradación del ARN, por lo tanto mucho cuidado se debe tomar en el manejo de la ARN. Todas las reacciones deben ser creado en el hielo para reducir al mínimo la degradación del ARN. Inhibidores de la RNasa también se puede añadir a la reacción antes de la transcripción inversa. Los guantes deben cambiarse con frecuencia, mientras que recipientes de plástico estéril y desechable debe ser utilizado durante todo el procedimiento.
Si no hay ningún producto de PCR o de la curva de amplificación se detecta un retraso en la PCR en tiempo real, trate de aumentar el número de ciclos de PCR, y asegúrese de que el programa de ciclos incluye la activación de la DNA polimerasa HotStarTaq durante 15 minutos a 95 ° C. Bajo amplificación también puede ser debido a insuficiente plantilla de cDNA de partida, por lo tanto tratar de aumentar la cantidad de cDNA. Amplificación de última hora también pueden representar un falso positivo.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por la Sociedad Canadiense del Cáncer del Instituto de Investigación, conceder ninguna. 019038.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596 | |
| miScript Reverse Transcription Kit | Qiagen | 218061 | |
| miScript Primer Assays | Qiagen | Experiment specific | |
| miScript SYBR Green PCR Kit | Qiagen | 218073 | |
| LightCycler 3.5 Real-Time PCR System | Roche Group | ||
| Light Cycler Capillaries | Roche Group | 04929292001 | |
| NanoDrop 1000 spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 2538 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | G2943CA |
References
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