Summary
AVEXIS 세포 인식 프로세스에 관련된 소설 세포 수용체 - 리간드 쌍을 체계적 화면으로 개발된 높은 처리량 단백질 상호 작용 분석이다. 그것은 구체적으로 다른 높은 처리량 접근 방식을 사용하여 식별하기 어려운 일시적인 단백질 상호 작용을 감지할 수 있도록 설계되었습니다.
Abstract
세포외 단백질 : 분비 또는 멤브레인 - 곁에 단백질 간의 단백질 상호 작용은 다세포 유기체 내에서 두 세포 사이 커뮤니케이 션을 시작하고 보장 결합에 중요합니다. 단백질은 세포의 상호 작용이 인간의 유전자 약 1 분기까지 인코딩됩니다 형성 예측하지 않았지만, 그들의 중요성과 풍요로움에도 불구하고, 이러한 단백질의 대부분은 아무런 구속력 파트너를 문서화했습니다. 주로, 이것은 그들의 생화 학적 다루기 힘듦로 인한 것입니다 : 멤브레인 - 임베디드 단백질들의 기본 형태에 solubilise하기가 어렵습니다 그리고 구조적으로 - 중요한 posttranslational 수정 사항이 포함되어 있습니다. 또한, 수용체 단백질 간의 상호 작용 동질성은 종종 많은 일반적으로 사용되는 높은 처리량 방법 2 그들 감지 precluding 매우 낮은 상호 작용 강점 (반 생활 <1 초)을 특징으로하고 있습니다.
여기서는 AVEXIS은 (욕망 기반 EXtracellu, 분석을 설명낮은 거짓 긍정적인 속도 3 매우 약한 단백질 상호 작용 (T 2분의 1 ≤ 0.1 초)의 검출을 가능하게 이러한 기술적 과제를 극복 고맙다 상호 작용 스크린). 분석은 일반적으로 편리한 microtitre 플레이트 형식의 상호 작용 (그림 1)의 많은 수천의 체계적인 심사를 활성화하기 위해 높은 처리량 형식으로 구현됩니다. 그것은 상호 작용을 위해 구분할 어느 이내에 세포 표면 수용체이나 분비 단백질 ectodomain 포함할 수용성 재조합 단백질 라이브러리의 생산에 의존하므로, 이러한 방식은 유형에 적합 I, 타입 II, GPI-연결된 세포 표면 수용체와 분비 단백질하지만 이러한 이온 채널 또는 전송기와 같은 multipass 막 단백질입니다.
재조합 단백질 라이브러리는 같은 glycosyla 같은 중요한 posttranslational 수정을 위해, 편리하고 높은 수준의 포유류의 표현 시스템 4를 사용하여 생산됩니다기 및 disulphide 채권이 추가됩니다. 심사에 적합한 streptavidin-코팅 견고한 위상에 캡처할 수 biotinylated 미끼, 그리고 pentamerised 효소 - 태그를 (β-lactamase) 먹이 : 표현 재조합 단백질은 매체와 두 가지 형태로 생산으로 분비된다. 유인 먹이 단백질은 종래의 엘리사 (그림 1)과 비슷한 둘 사이에 직접적인 상호 작용을 검출하는 바이너리 방식으로 서로 제공됩니다. 먹이의 단백질의 pentamerisation은 연골의 oligomeric 모체 단백질 (광고)에서 펩타이드 시퀀스를 통해 달성함으로써 심지어 아주 과도 상호 작용이 감지 수 있도록 큰 욕망 향상을 제공 ectodomains의 지방 농도를 증가하고 있습니다. 미끼 및 심사에 앞서 미리 정해진 수준으로 먹이 모두의 활동을 정상화함으로써, 우리는 0.1 초 중 monomeric 하프 생명을 가진 상호 작용이 낮은 거짓 긍정적인 속도로 3 감지할 수 것으로 나타났습니다.
Protocol
1. 미끼와 먹이 플라스미드 표현 벡터의 라이브러리 컴파일
- 세포 표면 수용체와 상호 작용을 위해 상영되는 관심 분비 단백질의 목록을 컴파일하고 적절한 단백질 서열 데이터베이스로부터 시퀀스를 검색할 수 있습니다. N-터미널 분비 신호 펩티드를 포함하는 대부분의 단백질은 (이 전을 입력 GPI-링크 및 분비 단백질 포함) 적합합니다. 일반적으로 단백질 가족 (예 : 면역 글로불린 superfamily이나 적혈구와 같은 특정 세포 유형으로 제한 모든 수용체)을 선택됩니다.
- 단백질 기능 예측 소프트웨어를 사용하여 신호 펩티드와 transmembrane 지역의 위치를 식별하여 세포외 영역의 범위를 결정합니다. 우리는 일반적으로 SignalP 3.0 5 TMHMM V2.0 6을 사용.
- 각 수용체에 대한 전체 ectodomain 조각을 증폭 디자인 프라이머 세트. 우리가 이러한 목적에 적합 유인 먹이 벡터의 제품군을 가지고Addgene (에서 vailable http://www.addgene.org/~~V ). NotI 제한 효소 사이트 및 최적 Kozak 시퀀스를 포함하는 메티오닌 시작 주변의 감각 프라이머를 디자인, 이것은 정확히 일치하는 유전자에 특정한 시퀀스 (그림 2A)의 25 기본 쌍 뒤에는됩니다.
- 직전 예측 transmembrane 지역에 대한 수용성 재조합 단백질로서 전체 ectodomain을 표현하는만큼 유형 I 수용체 단백질을 잘라야 안티 센스 프라이머를 디자인합니다. 다음의 C-말단 쥐 Cd4d3 4 단백질 태그 7 (그림 2A)에 프레임에 번역해야이 프라이머의 AscI 제한 사이트를 포함합니다.
- 이러한 primers를 사용하여 모든 유전자에서 ectodomain 조각을 증폭하고 미끼 또는 먹이 벡터로 그들을 복제. 우리는 때로는 적절한 포유 동물 발현 벡터에 subcloning 전에, 우리가 pTT3 벡터 3,4의 파생을 사용하는 첫번째 셔틀 벡터로 그들을 복제하는 것이 도움이 되었습니까. 유인 먹이 벡터 contai 모두다음과 같이 N C-말단 단백질 태그 (그림 2B).
- Baits : E.coli BirA 효소에 대한 기판입니다 펩타이드 시퀀스 뒤에 따라서 특정 라이신 잔기에 monobiotinylated 수있는 쥐 CD4 (Cd4d3 4) 단백질의 도메인 3과 4를 포함하는 태그 (그림 2B) . Cd4d3 4 태그는 OX68 단클론 항체에 의해 인식되고 엘리사에 의해 미끼 단백질의 표현을 계량하는 데 사용됩니다. 미끼 단백질 따라서 monomeric 및 monobiotinylated 있습니다. biotinylatable 펩타이드가 정화를위한 6 사람 태그로 바뀝니다 추가 미끼 단백질 벡터를 사용할 수 있습니다.
- 놈일 : 놈일 또한 쥐 연골 oligomeric 매트릭스 단백질 (광고) 및 C-β-lactamase 터미널 효소의 펩타이드 시퀀스 뒤에 쥐의 Cd4d3 4 태그를 포함합니다. 검색 펩타이드는 먹이의 양식 pentamers 한번 (그림 2B) 표현 보장합니다.
2. 먹이와 미끼 - 단백질 표현
우리가 사용하는우리의 단백질 라이브러리를 생산하는 HEK293E 세포주 4 서스펜션 문화, 그러나 어떤 포유류의 표현 시스템을 사용하여 편리하게 높은 수준의 표현 시스템은 적합해야합니다. 상용 대안은 자유형 시스템입니다. 세포가 일상적 37 떨고 플랫폼 (125 RPM)에서 배양해됩니다 ° C에서 5 % 70% 상대 습도에서 CO 2. 긍정과 부정 모두 제어 단백질도 표현되어야합니다. 쥐 Cd4d3 4 태그 전용 조각 유인 먹이가 모두 같이 사용할 수 있고 적합한 부정적인 컨트롤입니다. 마찬가지로 긍정적인 컨트롤을 인코딩 유인 먹이 벡터 (Addgene) 사용할 수 있습니다, 우리는 일반적으로 쥐 Cd200-Cd200R 상호 작용 8을 사용합니다.
- 종자 HEK293E 세포에게 2.5 × 10 5 세포의 밀도 ML -1에서 이전에 transfection에 일. 제조 업체의 권고에 따라 Freestyle293 미디어 50 ML의 볼륨에서 우리는 정기적으로 문화의 세포. 효율적인 biotinylation을 보장하기 위해, T를 보완그는 세포 배양 매체 100 μm의의 최종 농도로 D-비오틴과 미끼 단백질을 생산하는 데 사용됩니다. 먹이의 단백질을 표현하는 데 사용되는 매체는 추가적인 D-비오틴과 보완 필요가 없습니다.
- 다음 날, transfect 세포 (예 293fectin) 적당한 transfections 시약을 사용합니다. 50 ML 문화를 transfect하는 미끼 또는 먹이 플라스미드 구조의 25 μg을 사용합니다. biotinylated baits를 생산하기 위해 공동 transfect 플라스미드 인코딩 미끼 E.coli 단백질 비오틴 ligase (중 분비 양식을 인코딩 그 플라스미드로 구성 Addgene에서 구할 수 있습니다 BirA). 플라스미드 인코딩 분비 BirA 단백질의 10시 1분 비율 (2.5 μg)에서 공동 transfect 미끼 plasmids.
- 첫 번째 필터 0.22 μm의를 통해 뜨는의 여과 다음 20 분 동안 3,000 X g에서 원심 분리하여 세포를 pelleting하여 수확 문화 오일 포스트 transfection.
[팁 : 미끼와 먹이 단백질의는 4 ° C에서 undiluted 및 일반적인 지침은 년 이내에 사용해야합니다으로 저장해야합니다. 같은 50 μg / ML polymyxin B 황산염 또는 supernatants의 세균 오염을 방지하는 10 밀리미터 난이 3 등 bacteriostatics를 추가합니다.]
3. 미끼와 먹이 샘플 Normalisation
AVEXIS 분석의 주요 특징 중 하나는 재조합 단백질이 분비되기 때문에 그들이 이전 분석에서 사용하기 위해 설립 요건 활동 이내로 희석 또는 (표준) 집중 수있다는 것입니다. 진도 4까지 주문 - - 등 정상화 단계는 크게 화면 중 잘못된 반응의 수를 줄일 우리는 재조합 단백질이 표현되는시 수치가 광범위에 걸쳐있는 것으로 나타났습니다.
3.1 베이트 정상화
참고 : 이것은 biotinylated 바이와 경쟁하기 때문에 D-비오틴 Unconjugated는 매체 (일반적으로 투석에 의한)에서 제거되어야합니다바인딩 사이트를 streptavidin하는 바인딩하기 위해 T 단백질.
- 투석 튜브, 라벨로 미끼 supernatants 전송, 안전 클립과 무료 비오틴을 제거하는 등 PBS와 같은 적절한 버퍼에 대해 광범위하게 dialyse.
[팁 : 우리는 충분한 투석이 일반적으로 24 시간 정도 지나면 사 변경 PBS 4.5 L의 볼륨에 대해 6 X 50 ML의 미끼 supernatants에 대해 이루어집니다 것으로 나타났습니다. 불충 분한 투석은 미끼 정규화 단계에서 낮은 dilutions에서 단백질 결합의 억제에 의해 관찰할 수있다 (그림 3A).
- 미끼 단백질이 표현되는시 상대적인 수준을 결정하기 위해 엘리사를 수행합니다. biotinylated 미끼 단백질의 희석 시리즈를 준비하고 streptavidin-코팅 microtitre 판에 그들을 잡으. 단클론 항체 (OX68)를 사용하여 캡처한 미끼 단백질을 감지하고 수치 쥐 Cd4d3 4 태그를 사용합니다. 모든 biot을 포화하는 데 필요한 최소 금액으로 미끼 단백질을 집중하거나 희석streptavidin - 코팅 강판의 우물에 바인딩 사이트 인치
- 인산염과 streptavidin - 코팅 접시의 우물을 차단 saline/0.1 % 십대 초반-20 (PBST) / 2퍼센트 소 용 (BSA) 알부민 혈청 15 분 버퍼.
- 별도의 접시에 streptavidin-코팅 접시의 PBST / 2 % BSA 및 우물에 이전에 미끼 단백질의 희석 시리즈 (4 1시 3분 dilutions은 보통 충분)를 확인하십시오. 실온에서 1 시간 동안 알을 품다.
- PBST로 3 배 씻는다. 2 μg / ML 실온에서 1 시간 정도 마우스 안티 쥐 Cd4d3 4 IgG (OX68) 알을 품다 100 μL를 추가합니다.
- PBST로 3 배 씻는다. PBST / 2% BSA의 1:5,000 희석에 안티 마우스 알칼리성 인산 가수 분해 효소의 100 μL을 넣고 실온에서 1 시간 정도 알을 품다.
- PBST로 3 배 씻어 및 잔류 세제를 제거하는 PBS에서 최종 세척을 수행합니다. 1 MG / diethanolamine 버퍼 (10 % diethanolamine (V / V), 0.5mM MgCl 2, 10 MM 할머니 3, pH9.8, 4에서 빛으로부터 보호에 저장 104 ML 기판의 100 μL를 추가하십시오° C).
- 이후에 시간, 405 nm의 흡광도에서 측정. 대표 미끼 정규화 결과는 그림 3A에 표시됩니다.
- streptavidin - 코팅 강판의 모든 비오틴 결합 사이트를 포화에 충분하지가 수준에서 표현됩니다 미끼 단백질은 undiluted 사용하면 Vivaspin concentrators을 (Vivascience, 10kDa MWCO)를 사용하여 집중해야합니다. 가이드로, 우리는 전형적인 미끼 단백질 (~ 80 kDa)의 ~ 5 μg은 96 잘 접시를 포화하기에 충분하다고 예상하고 있습니다.
- 높은 수준의 표현 미끼 단백질은 streptavidin-코팅 플레이트를 포화 수 있도록 충분한 농도로 PBST / 2 % BSA에 희석 수 있습니다. baits의 활동들은 streptavidin - 코팅 강판의 모든 비오틴 구속력이 사이트를 포화되도록 희석 또는 농축 후 다시 확인해한다.
3.2 먹이를 정규화
- β-lactamase를 사용하여 먹이 단백질이 표현되는시 상대적인 수준을 계량효소 활동.
- 첫째, PBST에서 먹이 단백질 / 2% BSA 버퍼를 포함 뜨는의 희석 시리즈를합니다. 그렇다면 242 μm의 (0.125 밀리그램 / ML) nitrocefin 솔루션 (Calbiochem)의 60 μL로 dilutions 20 μL를 추가합니다.
- 즉시 상온에서 20 분 동안 485 nm의 매 순간에서 흡광도 측정 소요 microtitre 플레이트 리더로 접시를 전송합니다. 대표 먹이 정규화 결과는 그림 3B에 표시됩니다.
- 원심 concentrators를 사용하여 샘플을 집중하거나 nitrocefin 중 ~ 2 nmol 분 -1 회전율의 문턱 활동에 도달하도록 PBST / 2 % BSA 관련 희석. 모든 nitrocefin가 ~ 7 분 이내에 hydrolysed있다해도, 이것은 이루어진다.
4. AVEXIS 심사 절차
- PBST에서 streptavidin - 코팅 접시를 씻으십시오.
- 각도에 PBST / 2 % BSA 100 μL를 추가하고 각 잘 내에 가짜 단백질 바인딩 사이트를 차단하는 30 분간 부화.
[팁 : 세척 단계 후 잔여 세차 버퍼를 제거하기 위해 플레이트가 도청되고 - 강력 - 종이 타올에]
- 싱크대 위에 접시의 스마트 영화와 차단 솔루션을 제거하고 적절한 우물에 100 μL 표준 biotinylated monomeric 미끼를 추가하고 실온에서 1 시간 정도 알을 품다.
- 접시를 upturning하고 smartly 싱크를 통해 flicking하여 접시에서 미끼 샘플을 제거하고 PBST로 3 회 씻는다.
- 정규 pentamerized의 먹이의 100 μL 각 잘으로 구축하고 1 시간 동안 상온에서 부화 단계 4.4에서와 같이 씻어 오직 PBS과 하나가 마지막 세차를 수행 추가합니다.
- 242 μm의 nitrocefin 솔루션 (DMSO 500 μL에 nitrocefin 5 MG를 해산, 더 플레이트에 추가하기 전에 필터 0.22 μm의를 통해 40 ML PBS에 nitrocefin을 희석하고 통과 철저하고 믹스) 60 μL을 넣고 상온에서 부화 . 긍정적인 상호 작용을 관찰할 수있다이후 눈으로 노란 nitrocefin은 붉은 색으로 hydrolysed됩니다. 플레이트 판독기를 사용하여 485 nm의 흡광도에서 읽는 계량. 전형적인 접시와 quantitation는 그림에 표시됩니다. 4.
[팁 : 접시는 모든 잠재적인 상호 작용이 감지되도록 만 16 시간 동안 4 ° C에 위치해야 있지만 긍정적인 상호 작용은 일반적으로 상온에서 2 시간 이내에 관찰된다. 우리는 또한 스크래치 / 지문 등 microtitre 판의 플라스틱에 시켰던 nitrocefin 및 결함 가끔없이 명백한 nitrocefin 가수 분해에도 불구하고 485 nm의에서 artefactual 잘못된 반응을 초래할 수있는 것으로 나타났습니다. 그것은 시각적으로 우물의 nitrocefin 매상을 기록 접시의 사진을하는 것이 좋습니다.]
5. 대표 결과
대표 AVEXIS 심사 접시의 예제는 그림 4에 표시됩니다. 하나의 nitrocefin 기판의 가수 분해를 (빨간색으로 노란색) 관찰해야합니다10 분 이내에 긍정적인 제어 우물 (항체 - 매개 먹이 캡쳐 제어 또한 긍정적인 제어 상호 작용 모두). 화면 내에서 어떤 상호 작용도이 시간 척도 내에서 관찰하고 있지만 나머지는 오래 걸릴 수 있습니다 (몇 시간) 표시. 일반적으로 0.4-0.6 % 정도 (상영되는 모든 150-250 상호 작용에 대한 긍정적인 상호 작용)의 타격 속도가 상영되는 단백질 라이브러리에 따라 전형이다.
1 그림. AVEXIS를 사용하여 세포 인식 프로세스를 중재 수용체 - 리간드 상호 작용 확인. 회로도는 멤브레인 - 임베디드 수용체 단백질 사이에 만들어진 상호 작용을 통해 정보를 교환하는 두 상호 작용하는 세포 (A와 B)를 보여줍니다. AVEXIS 특별히 매우 약한 상호 작용의 강점에 의해 특징 소설 수용체 - 리간드 쌍을 식별하도록 설계된 확장 가능한 단백질 상호 작용 분석이다. 그래서 재조합두 세포의 세포 표면 수용체 레퍼토리의 전체 ectodomain을 나타내는 luble 단백질 라이브러리 (셀 타입) 또는 monomeric 비오틴 - 태그를 baits (셀 타입 B)를 pentameric β-lactamase-태그를 놈일로 두 컴파일됩니다. 놈일의 pentamerisation도 매우 과도 상호 작용이 감지 수 있도록 전반적인 욕망 게인 어떤 영향을 미치는 ectodomains의 지방 농도를 증가시킵니다. 미끼 라이브러리는 streptavidin-코팅 접시에 arrayed하고 체계적으로 먹이 단백질과 상호 작용에 대해 탐색할 수 있습니다. 간단한 세차 후에는, 캡처한 놈일은 먹이와 연관된 β-lactamase 활동을 사용하여 감지됩니다.
그림 2. 미끼와 먹이의 구조 설계. () 쥐 Cd200 수용체 단백질은 세포 표면 수용체 단백질의 전체 ectodomains가 결정되며 primers가 미끼를 모두 수 있도록 설계하는 방법의 예제대로 제시됩니다그리고 먹이의 표현 구조. cDNA와 번역된 단백질 시퀀스는 N-말단의 신호 펩티드의 쥐 Cd200의 멤브레인 - 스패닝 transmembrane 영역에 표시됩니다. 감각 프라이머는 Cd200 cDNA 시퀀스에 정확히 일치하는 순서의 25 기지 다음 5 'NotI 제한 효소 사이트 및 최적 Kozak 시퀀스를 포함하도록 설계되었습니다. 안티 센스 프라이머는 AscI 사이트 및 즉시 상류 선택한 ectodomain 잘라내기 잔여물의 위치 정확히 일치하는 순서의 25 기지를 포함하고 있습니다. 쥐 Cd4d3 4 태그와 프레임에 ectodomain을 유지하려면 AscI 사이트 Gly-살라 - 프로로 번역한다. (B) 유인 먹이 표현 구조의 도식 표현. 각각 NotI 및 AscI 사이트와 Cd4d3 4 태그 어귀 수용체 ectodomains가 포함되어 있습니다. baits 특히 플라스미드가 분비 BirA 효소를 표출로 cotransfection하여 monobiotinylated 수있는 C-말단 펩타이드 시퀀스를 포함합니다. 놈일는 pentamerisation 시퀀스 다음에 있습니다연골의 oligomeric 모체 단백질 (광고)와 β-lactamase 효소에서.
그림 3. 유인 먹이 단백질의 Normalisation. 미끼 정상화 () 대표 예입니다. 네 가지 dialysed 미끼 supernatants의 희석 시리즈는 안티 - CD4 태그 단클론 항체를 사용 엘리사에 의해 발견되었다. 네 가지 baits는 다른 레벨 1> 2> 3> 4에 표현됩니다. Baits는 각 우물에 비오틴 구속력 사이트를 saturates 임계값 수준으로 정규화해야합니다. 높은 표현 baits이 단백질을 절약하기 위해 희석 수 있습니다 (예 : 미끼 1 ~ 1:100 희석 수있다), 그리고 저조한 표현 baits이 집중. 낮은 dilutions의 감소 수치는 불완전 투석에 의한 unconjugated D-비오틴의 존재에 기인하는 것입니다 일부 baits (예 : 미끼 2)에서 관찰됩니다. (B) 단백질을 먹이로되는 수준은 전직입니다다림질은 β-lactamase 기판, nitrocefin의 가수 분해 율을 사용하여 계량한다. 표시된 예제에서는 세 개의 놈일는 여러 수준에서 표현됩니다 : 먹이 1> 2> 3. 놈일는 (예 : 먹이 1) ~ 7 분 이내에 14.5 nmol nitrocefin의 가수 분해를 완료하기 위해 해당 ~ 2 nmol 분 -1의 활동을 정상화해야한다. 이 예제에서 다른 놈일은 심사에 사용하기 전에 집중해야합니다.
4 그림. 대표 AVEXIS 심사 결과입니다. () 대표 AVEXIS 심사 접시의 사진. 먹이 단백질은 41 가지 baits에 대해 탐지하고 긍정적인 상호 작용이 잘 E2에서 감지된다. 심사 접시에 사용되는 컨트롤은 다음과 같습니다 : Cd200R과 (미끼) Cd200R (먹이)이 임계값 희석에 사용되는 먹이 쥐 Cd200 : 모든 먹이의 단백질을 캡처 biotinylated 항 CD4 항체가 잘 (G6), 제어 상호 작용에 추가 (H3) 1시 10분 (H4)와 1:100 (H5). 부정적인 통제했다 : Cd4d3 4 미끼는 먹이 단백질은 (H1) 상영된다는 것에 대한 탐지 및 Cd200R의 먹이 (H2). (B) 세중의에서 수행한 동일한 화면의 흡광도 값 중 부량. 데이터 포인트는 평균 ± SD 있습니다.
Discussion
살아있는 세포가 생체내에서 관찰하면, 자신의 플라즈마 점막은 매우 역동적인 동작을 전시 : 그들이 연락하여 그들의 이웃이와 통신으로 확장하고 retracting 막 프로세스. 다음 연락처에 많은 중재 멤브레인 - 임베디드 수용체 단백질 사이의 물리적 상호 작용이 높은 운동성이있는 행위를 허용하는만큼 매우 약한 것으로 진화했습니다. 그것은 50 μm의 같은 약하 monomeric 상호 작용 강도는 매우 2,10 도전 소설 상호 작용을 검출하게 생리학 수용체 밀도 9시 자발적인 상호 작용을 유발하기에 충분있을 것으로 추정되었습니다. 낮은 거짓 긍정적인 속도로 확장 가능한 방식으로 구현할 수있는 단백질 상호 작용 : 여기에서 설명한 AVEXIS 방식 과도 세포외 단백질을 검출하는 민감한 방법을 제공합니다. 다른 확장 방법은, 세포 상호 작용 11-15 감지하기 위해 개발되어 있지만AVEXIS 중 하나 장점은 미끼와 먹이 활동과 같은 실험 매개 변수가 낮은 허위 양성 반응 속도 3을 유지하면서도 (T 2분의 1 ≤ 0.1 s의) 상호 작용의 약한를 감지 계량되어있다는 것입니다. 또한, 간편하고 강력한 시료 준비 과정은 다른 assays보다 훨씬 더 큰 규모로 구현되어이 분석을 활성화했으며 최근 ~ 16,500 잠재적인 상호 작용을 통해 총 16 체계적인 상호 작용 화면을 설명했습니다.
분석은 그것이 수용성 재조합 단백질 조각을 표현하는 것이 가능하는 모든 단백질을 수행할 수 있습니다. 이것은 따라서 이러한 유형 I, GPI-링크 및 분비 단백질과 같은 N-터미널 신호 펩티드를 포함하는 단백질이 포함되어 있습니다. 우리는 최근에 지금 우리가 baits 17로 타입 II 단백질을 표현할 수 있도록 벡터의 제품군을 설계했습니다. 분석은 일반적으로 이러한 이온 수송 등 multipass 막 단백질에 적합하지s 또는 그들이 올바르게 플라즈마 막의 컨텍스트 외부 접혀되지 않을 수 있습니다 있기 때문에 펌프. 우리는 zebrafish 3,16,18, 인간, 마우스 및 P.으로부터 세포외 단백질을 서로 다른 다양한 시스템에 이것을 적용하고 성공적으로 표현했습니다 상호 작용 화면에 대한 falciparum.
AVEXIS 화면을 설정하는 데 필요한 자원의 측면에서 우리는 상당한 병목 현상이 선정, 건설 및 표현 plasmids의 전체 시퀀싱 것으로 나타났습니다. 메서드의 이러한 양상은 ~ 100 유인 먹이 구조를 만들기 위해 일년까지 걸릴 수 있으나, 유전자 합성의 감소 비용과 함께, 우리는 프로젝트의이 부분을 아웃소싱 상업적으로 선호. 대형 떨고 조직 문화 인큐베이터 (우리가 INFORS HT Multitron 전지 사용)와 함께 포유류의 표현 시스템은 표현하고 ~ 100 유인 먹이 단백질 개월까지 정상화하기위한 하나의 연구원 수 있습니다. 단백질은 생산 초, 정상화되면상호 작용에 대한 creening하면 편리 하루에 처리되는 정오까지 96 - 웰 플레이트와 빠른 속도입니다. 우리가 단백질 등 다수의 생산을 촉진하기 위해 개발한 것으로 유일 주문품의 장비는 병렬 0.22μm 필터를 통해 다섯 supernatants까지 전달하는 데 사용되는 압축 공기 구동 피스톤입니다.
이러한 상호 작용의 일부가 3 감지할 수 있지만 문학 (거짓 네거티브 필름)에서 예상 상호 작용에 비해 놓칠 수있을 상호 작용의 주 클래스는 homophilic 상호 작용입니다. 예상되는 상호 작용이 감지되지 않는 경우에, 우리는이 그때 고정화 미끼 단백질로 추가 상호 작용을 방지 먹이 단백질 (먹이 "마스킹"효과)에 의해 homophilic 상호 작용의 형성에 의한 것을 믿습니다. 상호 작용이 발견되는 빈도가 상영되는 단백질 라이브러리의 내용에 따라 달라집니다. 리더에 대한 안내,> 30의 화면으로, zebrafish 면역 글로불린 superfamily 이내 000 상호 작용 188 긍정적 결과 - 0.6 % 3,16,18의 주파수를. 모든 긍정적인 조회수를 확인하는 데 수행할 수 매우 빠른 검사는 상호 작용이 미끼 - 먹이의 방향 모두에서 감지할 수 있는지 여부를 확인하는 것입니다,, 같은 상호 작용은 미끼 중으로 바인딩 단백질이 존재하는지 여부에 관계없이 감지할 수있다 그 또는 먹이. 우리가이 왕복 동작을 관찰했을 때마다 바인딩은 연속적 표면 plasmon 공명을 사용하여 단백질 투석을 직접 saturable 바인딩을 시연하여 명확하게 표시되었습니다. 그것은 우리가 인위적으로 먹이 단백질을 pentamerising하여 바인딩 욕망을 증가하기 때문에, 우리는 양적 상호 작용의 장점을 비교하기위한 적절한 분석을 고려하지 않는 것이 강조되어야한다. 우리가 monomeric 단백질 및 표면 plasmon의 공명을 사용하여 상호 작용 biophysical 바인딩 매개 변수를 구하십시오. 마지막으로 한 상호 작용이 확인되었습니다, 안녕하세요분석의 GH 처리량 자연은 항체 또는 상호 작용을 차단하는 작은 분자와 같은 시약을위한 화면 분석을 적응하기가 비교적 쉽습니다.
Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
이 작품은 Wellcome 신탁 기금 번호 [077108]에 의해 지원되었다 GJW에게 수여.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Freestyle media | Invitrogen | 12338018 | |
| Nitrocefin | Calbiochem | 484400 | |
| SA-coated microtitre plates | Nalge Nunc international | 734-1284 | |
| OX68 antibody | AbD Serotec | MCA1022R | |
| Dialysis tubing | Pierce, Thermo Scientific | PN68100 | |
| Polymyxin B | Sigma-Aldrich | P4932 | |
| D-biotin | Sigma-Aldrich | B4639-5G | |
| Substrate-104 | Sigma-Aldrich | 1040-506 | |
| Vivaspin-20 centrifugal concentrators | Sartorius AG | VS2002 | |
| 0.22 μm filters | Nalge Nunc international | 190-2520 |
References
- Fagerberg, L., Jonasson, K., von Heijne, G. Prediction of the human membrane proteome. Proteomics. 10, 1141-1141 (2010).
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