Summary
इस विधि biodegradable polyanhydride फिल्म और nanoparticle पुस्तकालयों की मिश्रित संश्लेषण और उच्च throughput इन पुस्तकालयों से प्रोटीन रिहाई का पता लगाने का वर्णन करता है.
Protocol
1. मिश्रित पॉलिमर लाइब्रेरी (बहुलक रसायन शास्त्र में परिवर्तनीय) संश्लेषण रोबोट सेटअप के लिए 1 चित्र देखें
- उपयुक्त विलायक एकाग्रता (= 25 मिलीग्राम / एमएल) में प्रत्येक monomer भंग और एक 10cc गैस तंग सिरिंज में प्रत्येक लोड.
- प्रत्येक सिरिंज के अंत विलायक प्रतिरोधी लालच ताला केशिका ट्यूब संलग्न.
- सिरिंज पंप (नए युग निर्देशयोग्य सिरिंज पंप) पर सीरिंज प्लेस और स्थिति में ताला.
- रैखिक actuators (Zaber) सेट शुरू करने की स्थिति में है.
- अंगूठी स्टैंड clamps का उपयोग, monomer बयान के लिए शुरू / अच्छी तरह से शीशी में दोनों केशिका ट्यूबों के अंत की स्थिति.
- LabVIEW कार्यक्रम, पंपों जो प्रत्येक अच्छी तरह से वांछित copolymer संरचना पर निर्भर करता है में प्रत्येक monomer की चर मात्रा आरंभ. इस कार्यक्रम में actuator z-अक्ष निर्देश शीशी / अच्छी तरह से और फिर प्रत्येक पंप में केशिका ट्यूब को कम करने के लिए वांछित मात्रा बांटना द्वारा हासिल की है. NeXT, Z-actuator कार्यक्रम करने के लिए अपने घर की स्थिति और एक्स और वाई actuators पर लौटने के लिए अगले शीशी की स्थिति / अच्छी तरह से करने के लिए ले जाने के निर्देश है. यह किया जाता है जब तक प्रत्येक अच्छी तरह monomer के वांछित मात्रा में जमा है.
- Monomer बयान के बाद, बहु - अच्छी तरह से या बहु शीशी monomer पुस्तकालय एक वैक्यूम पूर्व गर्म ओवन में स्थानांतरित कर रहा है और संक्षेपण polymerization प्रतिक्रिया के अवधि के लिए वैक्यूम के अंतर्गत incubated. CPH: SA संश्लेषण प्रतिक्रिया 180 पर बाहर किया जाता है डिग्री सेल्सियस, 0.3 torr 1.5 घंटे के लिए, लेकिन इन स्थितियों की प्रतिक्रिया अलग बहुलक प्रणालियों के बीच अलग अलग होंगे.
2. मिश्रित खाली और प्रोटीन लोड बहुलक nanoparticle और फिल्म पुस्तकालय निर्माण - रोबोट सेटअप के लिए 1 चित्र देखें
- 1 प्रोग्राम सिरिंज पंप में सिरिंज एक विलायक से भर जाता है (रिक्त पुस्तकालय) या प्रोटीन के साथ एक विलायक में छितरी हुई (पुस्तकालय प्रोटीन भरी हुई) जबकि दूसरे सिरिंज में सिरिंजपंप खाली छोड़ दिया जाता है. आसन्न नमूना धारक में nanoparticle निर्माण के लिए ट्यूब गैर विलायक से भर रहे हैं (गैर विलायक विलायक का अनुपात 1 से 100 है). फिल्म निर्माण के लिए एक खाली प्लेट आसन्न नमूना धारक में ट्यूब की जगह में बहु - अच्छी तरह से उपयोग किया जाता है.
- LabVIEW कार्यक्रम का उपयोग करना, विलायक सभी बहुलक शीशियों / कुओं पुस्तकालय की एकाग्रता (= 20 मिलीग्राम / एमएल) में जमा किया जाता है और 1-5 मिनट के लिए incubated. एक वैकल्पिक sonication कदम (40 हर्ट्ज पर 30 एस) के लिए पूरा बहुलक विघटन को सुनिश्चित करने के लिए शुरू किया जा सकता है.
- अगले, एक अलग LabVIEW कार्यक्रम की शुरुआत से, नमूना खाली सिरिंज में वापस ले लिया है, और अपनी आसन्न नमूना धारक में (नैनोकणों) गैर विलायक या खाली अच्छी तरह से (फिल्मों) की इसी ट्यूब में जमा.
- इस प्रक्रिया से बाहर असतत बहुलक पुस्तकालय की प्रत्येक रचना के लिए किया जाता है.
- nanoparticle या फिल्म पुस्तकालय तो विलायक और गैर विलायक हटाने (nanoparticle तुला के लिए एक निर्वात चैम्बर में रखाry भी वैक्यूम निस्पंदन का उपयोग बरामद किया जा सकता है).
3. उच्च throughput प्रोटीन रिलीज कैनेटीक्स
- एक बहुलक पुस्तकालय से उच्च throughput प्रोटीन रिलीज कैनेटीक्स की जांच के लिए, एक 96 गहरे welled (2 मिलीग्राम / अच्छी तरह से), polypropylene प्लेट संशोधित किया गया है कि इस तरह के पड़ोसी स्तंभों में अच्छी तरह से दीवार के शीर्ष 1/3 (पूर्व: ए और बी, सी और डी, ई और एफ, जी और एच) कुओं adjoin निकाल दिया जाता है. प्रोटीन से भरी हुई फिल्मों में निर्मित किया जाना चाहिए या नैनोकणों इस थाली में स्थानांतरित करने के लिए उच्च throughput रिलीज कैनेटीक्स अध्ययन करते हैं. प्रोटीन से भरी हुई nanoparticle या फिल्म नमूनों केवल आसपास के कॉलम (ए, सी, ई, और जी पूर्व) की अच्छी तरह से एक में रखा जाना चाहिए. विवरण के लिए चित्रा 4 देखें.
- नैनोकणों के 96 गहरे welled रिहाई प्लेट को हस्तांतरण के बाद, कणों को बसने की अनुमति दी हैं. PBS बफर (0.1 मिमी, 7.4 पीएच) धीरे प्रत्येक नमूने के लिए अच्छी तरह से (एक कॉलम, सी, ई और जी) और फिर अच्छी तरह से प्रत्येक पड़ोसी (स्तंभों B & D,, एफ, और एच) जब तक कुओं पूरा कर रहे हैं और आसपास के कुओं के बीच बह बफर मुक्त है. नैनोकणों के लिए, इस प्रक्रिया को अतिरिक्त सावधानी के साथ किया जाना चाहिए के लिए सुनिश्चित करें कणों नमूना के नीचे अच्छी तरह से (स्तंभों ए, सी और ई, जी) और आसपास के रिहाई में नहीं स्थानांतरित अच्छी तरह से (स्तंभों बी, डी, एफ, में रहते हैं और, एच). कुछ मामलों में, centrifugation नमूना के नीचे nanoparticle नमूने अच्छी तरह से स्थानीय बनाना (स्तंभों ए, सी, ई और जी) की आवश्यकता है.
- अगला, रिहाई की थाली एक ढक्कन के साथ बंद है और आंदोलन के तहत वांछित तापमान पर (यानी 37 डिग्री सेल्सियस) प्रयोग की अवधि के लिए रखा जाता है.
- वृद्धिशील समय अंक (0.04 यानी, 1, 2, 3, 5, 7, 9, 12, 15, 19, 24, और 30 दिनों) में जारी प्रोटीन fluorochrome संयुग्मित की राशि एक ९,४०० Typhoon Flatbed प्रतिदीप्त स्कैनर का उपयोग मात्रा निर्धारित है ( हेल्थकेयर जीई). रिहाई की थाली स्कैनर सतह पर रखा गया है, उचित उत्तेजना लेजर और उत्सर्जन filte उपयोग स्कैनरुपये, और प्रोटीन की रिहाई कुओं (स्तंभों बी, डी, एफ, और एच) (छवि क्वांट मात्रा निर्धारित है) में जारी प्रतिदीप्ति तीव्रता. यह सुझाव दिया है कि ज्ञात सांद्रता के प्रोटीन मानकों प्रोटीन मात्रा और fluorochrome शमन के लिए लेखांकन की गणना करने के लिए अच्छी तरह से थाली में शामिल किया जाना है.
4. प्रतिनिधि परिणाम
बहुलक पुस्तकालय के निर्माण पर, लक्षण एच 1 एनएमआर, GPC, और FTIR के साथ किया गया है बाहर ले जाने के लिए इस मिश्रित विधि 1,7,8,11 को मान्य. 10,000-20,000 से आण्विक वजन रेंज 1.5-3.0 से छ / mol, polydispersity सूचकांक पर्वतमाला और रासायनिक संरचना करने के लिए सही और polyanhydride 12-15 संश्लेषण के पारंपरिक तरीकों के साथ समझौते में होना दिखाया गया है. इसी तरह, नैनोकणों पुस्तकालयों के SEM छवियों समान सतह morphology, आकार, आकार और पारंपरिक गढ़े 2 नैनोकणों के रूप में वितरण दिखाया. प्रोटीन रिहाई kinetiसीएस polyanhydride नैनोकणों या फिल्मों से बाहर एक संशोधित अच्छी तरह से थाली में किया जाता है 1 के रूप में पहले से वर्णित है. परिणाम एक अनुमानित साथ या एक प्रोटीन लोड हो रहा है और (2 आंकड़े और 3) बहुलक रसायन शास्त्र 1,12,14,16 पर निर्भर फट के बिना शून्य क्रम रिहाई का पता चला.
चित्रा 1. मिश्रित बहुलक फिल्म और nanoparticle निर्माण उपकरण.
चित्रा 2 एक CPH से उच्च throughput टेक्सास रेड गोजातीय albumin सीरम (TRBSA) की रिहाई: SA बहुलक nanoparticle पुस्तकालय. एसए अमीर बहुलक chemistries जारी सबसे तेजी TRBSA समझाया है, जबकि CPH अमीर बहुलक chemistries धीमी रिलीज. त्रुटि सलाखों मानक devia का प्रतिनिधित्व करते हैंtion और n = 4. पीटरसन एट से अनुमति के साथ पुनर्प्रकाशित. अल 1. 2010 अमेरिकन केमिकल सोसायटी कॉपीराइट.
चित्रा 3 एक CPTEG से उच्च throughput टेक्सास रेड गोजातीय albumin सीरम (TRBSA) की रिहाई: CPH बहुलक फिल्म पुस्तकालय. CPTEG अमीर बहुलक chemistries जारी सबसे तेजी TRBSA समझाया है, जबकि CPH अमीर बहुलक chemistries धीमी रिलीज. त्रुटि सलाखों के मानक विचलन और n = 3 का प्रतिनिधित्व करते हैं.
चित्रा 4 "से पहले" दो पड़ोसी कुओं दिखा छवि और 96 गहरे welled polypropylene प्लेट में "के बाद" संशोधन. "के बाद" सही पर संशोधन छवि भी एक समझाया फ्लोरोसेंट अणु के साथ एक बहुलक फिल्म (छोड़ दिया अच्छी तरह से नीचे) के अलावा दर्शाया गया हैकिया जा रहा है एक बफर समाधान में दो कुओं के बीच जारी किया. जारी फ्लोरोसेंट अणु तो अच्छी तरह से सही में पता चला है.
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Discussion
ज्ञान आवश्यक संश्लेषण शर्तों और जा रहा संश्लेषित पॉलिमर के कांच संक्रमण तापमान (टी एंड जी) के पुस्तकालय के निर्माण के लिए आवश्यक हैं. यदि टी छ कमरे के तापमान से नीचे हैं, nanoparticle निर्माण कदम के लिए बाहर पॉलिमर के टी छ नीचे एक नियंत्रित तापमान वातावरण में किया जा आवश्यकता हो सकती है. इसके अतिरिक्त, सावधानी के लिए सुनिश्चित करें कि सभी उपकरण है कि उच्च तापमान और सॉल्वैंट्स के साथ संपर्क में आता है, उन स्थितियों को संभालने के लिए फिट होना चाहिए लिया जाना चाहिए. इस प्रोटोकॉल के मापदंडों के कई समायोजित किया जा सकता है (यानी, तापमान, निर्वात, ऊष्मायन बार, सॉल्वैंट्स, गैर सॉल्वैंट्स, बहुलक एकाग्रता, विलायक गैर विलायक अनुपात, आदि) संश्लेषण कण / या फिल्म के लिए अलग बहुलक प्रणालियों को समायोजित निर्माण. कुछ मामलों में, नैनोकणों लंबे समय अवधि के लिए सॉल्वैंट्स में स्थिर नहीं कर रहे हैं (निर्वात सुखाने द्वारा विलायक को हटाने के लिए पर्याप्त) तो दो वैकल्पिक विलायक लोकलक्षीअंडाकार तरीकों का इस्तेमाल किया जा सकता है. ) 1 कण धीरे हो सकता है, centrifuged तैरनेवाला विलायक decanted, और शेष कणों सूख या) 2 कणों निर्वात निस्पंदन द्वारा अलग किया जा सकता है और फिर सूख. खाली या प्रोटीन से भरी हुई नैनोकणों / फिल्मों, उच्च throughput लक्षण वर्णन या परीक्षण के बाद निर्माण के लिए प्रोटीन, सेलुलर, या मेजबान बातचीत के लिए biomaterials स्क्रीन आयोजित किया जा सकता है. इस पद्धति उच्च throughput वांछित आवेदन लिए biomaterial प्रदर्शन के तेजी से अनुकूलन के लिए सक्षम बनाता है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
लेखकों ONR - मूरी (NN00014-06-1-१,१७६) और वित्तीय सहायता के लिए अमेरिकी सेना चिकित्सा अनुसंधान और materiel कमान (अनुदान सं W81XWH-10-1-0806) पुरस्कार को स्वीकार करते हैं. इस सामग्री अनुदान सं 0552584 और 0851519 EEC के तहत राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन द्वारा समर्थित काम पर आधारित है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Motorized XYZ Stage: 3x T-LSM050A, 50 mm travel per axis | Zaber Technologies | T-XYZ-LSM050A-KT04 | |
| NE-1000 Single Syringe Pump | New Era Pump Systems | NE-1000 | |
| Pyrex* Vista* Rimless Reusable Glass Culture Tubes | Corning | 07-250-125 | |
| Glass cuvettes | Scientific Strategies | G102 | |
| LabVIEW | National Instruments | 776671-35 | |
| SGE Gas Tight Syringes, Luer Loc | Sigma Aldrich | 509507 | |
| U96 DeepWell Plates 1.3 ml & 2.0 ml | Thermo Scientific: Nunc | 278743 | |
| Well cap mats | Thermo Scientific: Nunc | 276000 | |
| Typhoon 9400 | GE Healthcare | 63-0055-79 | |
| Whatman Grade 50 Circles 90 mm | Whatman | 1450-090 |
References
- Petersen, L. K., Sackett, C. K., Narasimhan, B. A novel, high-throughput method to study in vitro protein release from polymer nanospheres. J. Comb. Chem. 12, 51-56 (2010).
- Petersen, L. K. Activation of innate immune responses in a pathogen-mimicking manner by amphiphilic polyanhydride nanoparticle adjuvants. Biomaterials. 32, 6815-6822 (2011).
- Vogel, B. M., Cabral, J. T., Eidelman, N., Narasimhan, B., Mallapragada, S. K. Parallel synthesis and high-throughput dissolution testing of biodegradable polyanhydride copolymers. J. Comb. Chem. 7, 921-928 (2005).
- Petersen, L. K. High-throughput evaluation of in vivo biodistribution of polyanhydride nanoparticles. Adv. Healthcare Mater. , Forthcoming (2012).
- Petersen, L. K., Narasimhan, B. Combinatorial design of biomaterials for drug delivery: opportunities and challenges. Expert Opin. Drug Deliv. 5, 837-846 (2008).
- Petersen, L. K., Oh, J., Sakaguchi, D. S., Mallapragada, S. K., Narasimhan, B. Amphiphilic polyanhydride films promote neural stem cell adhesion and differentiation. Tissue Eng. 17, 2533-2541 (2011).
- Petersen, L. K., Sackett, C. K., Narasimhan, B. High-throughput analysis of protein stability in polyanhydride nanoparticles. Acta Biomater. 6, 3873-3881 (2010).
- Petersen, L. K., Xue, L., Wannemuehler, M. J., Rajan, K., Narasimhan, B. The simultaneous effect of polymer chemistry and device geometry on the in vitro activation of murine dendritic cells. Biomaterials. 30, 5131-5142 (2009).
- Thorstenson, J. B., Petersen, L. K., Narasimhan, B. Combinatorial/high-throughput methods for the determination of polyanhydride phase behavior. J. Comb. Chem. 11, 820-828 (2009).
- Xue, L., Petersen, L., Broderick, S., Narasimhan, B., Rajan, K. Identifying factors controlling protein release from combinatorial biomaterial libraries via hybrid data mining methods. ACS Comb. Sci. 13, 50-58 (2011).
- Adler, A. F. High-throughput cell-based screening of biodegradable polyanhydride libraries. Comb. Chem. High Through. Screen. 12, 634-645 (2009).
- Determan, A. S., Trewyn, B. G., Lin, V. S., Nilsen-Hamilton, M., Narasimhan, B. Encapsulation, stabilization, and release of BSA-FITC from polyanhydride microspheres. J. Control. Release. 100, 97-109 (2004).
- Determan, A. S., Wilson, J. H., Kipper, M. J., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. Protein stability in the presence of polymer degradation products: consequences for controlled release formulations. Biomaterials. 27, 3312-3320 (2006).
- Torres, M. P., Determan, A. S., Anderson, G. L., Mallapragada, S. K., Narasimhan, B. Amphiphilic polyanhydrides for protein stabilization and release. Biomaterials. 28, 108-116 (2007).
- Torres, M. P., Vogel, B. M., Narasimhan, B., Mallapragada, S. K. Synthesis and characterization of novel polyanhydrides with tailored erosion mechanisms. J. Biomed. Mater. Res. A. 76, 102-110 (2006).
- Carrillo-Conde, B. Encapsulation into amphiphilic polyanhydride microparticles stabilizes Yersinia pestis antigens. Acta Biomater. 6, 3110-3119 (2010).
