Summary
שיטה זו מתארת את הסינתזה קומבינטורית של סרט polyanhydride מתכלה וספריות nanoparticle וזיהוי התפוקה גבוהה של שחרור חלבון מהספריות הללו.
Abstract
Polyanhydrides הוא קבוצה של חומרים ביולוגיים עם biocompatibility מצוין ויכולות אספקת סמים. בזמן שהם נחקרו רבים עם קונבנציונלי אחד מדגם ב-A-זמן טכניקות סינתזה, גישה אחרונה יותר תפוקה גבוהה פותחה מאפשרת סינתזה והבדיקה של ספריות גדולות של 1 polyanhydrides. זה יאפשר ביצוע אופטימיזציה יעילה יותר ותהליך עיצוב של biomaterials אלה עבור יישומי משלוח סמים וחיסון. שיטת עבודה זו מתארת את הסינתזה קומבינטורית של סרט polyanhydride מתכלה וספריות nanoparticle וזיהוי התפוקה גבוהה של שחרור חלבון מהספריות הללו. בשיטת רובוט מופעל זה (איור 1), ומפעיל ליניארי ומשאבות מזרק נשלטים על ידי LabVIEW, המאפשר פרוטוקול אוטומטי ללא ידות, ביטול שגיאות משתמש. יתר על כן, שיטה זו מאפשרת ייצור המהיר של ספריות פולימר מייקרו בקנה מידה, אדוםucing הגודל יצווה תוך כתוצאה מהיצירה של מערכות פולימרי multivariant. גישה זו לסינתזה קומבינטורית פולימר מאפשרת סינתזה של עד 15 פולימרים שונים בסכום שווה ערך של זמן זה ייקח לסנתז פולימר 1 כמקובל. בנוסף, ספריית פולימר קומבינטורית יכולה להיות מפוברקת בגיאומטריות ריקות או חלבון טעונים כוללים סרטים או חלקיקים עם פיזורה של ספריית הפולימר בממס ומשקעים אל הלא ממס (עבור חלקיקים) או על ידי ייבוש ואקום (לסרטים). בעקבות טעינת חלבון fluorochrome מצומדות לספריות הפולימר, קינטיקה שחרור החלבון ניתן להעריך בתפוקה גבוהה באמצעות שיטת זיהוי מבוססת פלואורסצנטי (איורים 2 ו 3) כפי שתואר לעיל 1. פלטפורמת קומבינטורית זו אומתה בשיטות קונבנציונליות 2 וסרט polyanhydride וספריות nanoparticle התאפיינו עם
Protocol
1. סינתזה קומבינטורית פולימר הספרייה (משתנה בכימיה של פולימרים) - ראה איור 1 להגדרת רובוטית
- ממס מונומר אחד ב( הריכוז = 25 מ"ג / מ"ל) הממס המתאים ולטעון בכל לתוך מזרק גז הדוק 10cc.
- חבר את צינורות הממס עמיד לפתות נעילת נימים לסוף כל מזרק.
- הנח את המזרקים על משאבות המזרק (משאבות מזרק לתכנות חדשות Era) ולנעול למקומו.
- הגדר את המפעילים ליניארי (Zaber) למצב ההתחלתי.
- באמצעות מהדק מעמד טבעת, למקם את סוף שני צינורות נימים לתוך הבקבוקון מתחיל / גם בתצהיר מונומר.
- ליזום תכנית LabVIEW, שמשאבות נפחים משתנים של מונומר אחד לכל באר בהתאם להרכב קופולימר הרצוי. זו מושגת בתכנית על ידי מורה למפעיל Z-הציר להנמיך את צינורות נימים לתוך הבקבוקון / גם ואז כל משאבה לוותר עצמה הרצויה. NeXT, התכנית מורה Z-המפעיל לחזור לעמדה שלו ואת בית ה-X ו-Y-המפעילים לעבור לעמדתו של הבקבוקון הבא / כן. זה מתבצע עד שכל אחד יש גם את הנפח הרצוי של מונומר הופקד לתוכו.
- בעקבות תצהיר מונומר, ספריית מונומר רב היטב או בקבוקון רב מועברת לתנור מחומם מראש ואקום וטופחה תחת ואקום למשך תגובת פילמור העיבוי. לCPH: סינתזת SA התגובה מתבצעת ב 180 מעלות צלזיוס, 0.3 Torr, עבור 1.5 שעות אבל תנאי תגובה אלה ינועו בין מערכות פולימרים שונות.
2. בלנק קומבינטורית וNanoparticle חלבון טעון פולימרים וייצור ספריית סרטים - ראו איור 1 להגדרת רובוטית
- המזרק במשאבת המזרק לתכנות הראשון מלא ממס (ספרייה ריקה) או ממס עם חלבון מפוזר בזה (ספריית חלבון טעון) ואילו את המזרק במזרק השנימשאבה נשארה ריקה. צינורות לייצור nanoparticle בבעל המדגם הסמוך מתמלאים בהלא ממס (יחס של ממס להלא ממס הוא 1 ל 100). עבור ייצור סרט צלחת ריקה רבה מנוצלת היטב במקומם של הצינורות בבעל המדגם הסמוך.
- באמצעות תוכנת LabVIEW, הממס מופקד לכל בקבוקוני הפולימר / בארות של הספרייה (ריכוז = 20 מ"ג / מ"ל) וטופח ל1-5 דקות. צעד sonication אופציונלי (30 של ב 40 הרץ) יכול להיות הציג על מנת להבטיח פירוק פולימר שלם.
- בשלב בא, על ידי ייזום תכנית LabVIEW נפרדת, המדגם נסוג לתוך המזרק הריק, ויופקד בצינור המקביל שלה היטב שאינם ממס-(חלקיקים) או ריק (סרטים) בבעל המדגם הסמוך.
- תהליך זה מתבצע עבור כל רכב פולימר הספרייה הדיסקרטית.
- Nanoparticle או ספריית סרטים הועבר אז בתא ואקום להסרת ממס ואינו ממס (מאזני nanoparticleר"י גם ניתן לשחזר באמצעות סינון ואקום).
3. קינטיקס שחרור חלבון תפוקה גבוהה
- לחקירת קינטיקה שחרור חלבון תפוקה גבוהה מספריית פולימר, 96 עמוקים גאו (2 מ"ל / היטב), צלחת פוליפרופילן היא לשנות כך את ראש 1/3 מהקיר גם בטורים שכנים (לשעבר: A ו-B, C ו-D, E, F, G, H) יוסרה לצרף את הבארות. סרטי חלבון הטעונים חייבים להיות מפוברקים באו החלקיקים הועברו לצלחת זה לביצוע מחקרי קינטיקה שחרור תפוקה גבוהה. דגימות nanoparticle חלבון טעון או סרט חייבות להיות ממוקמות רק בבאר אחת מהעמודות הצמודות (לשעבר: A, C, E, ו-G). ראה תרשים 4 לפרטים.
- בעקבות ההעברה של החלקיקים לצלחת שחרורו עמוק נקוותה 96, החלקיקים הרשו להם להתיישב. PBS חיץ (0.1 מ"מ, pH 7.4) הוא הוסיף באיטיות לכל דגימה היטב (עמודות A, C, E ו-G) ולאחר מכן לכל השכן היטב (עמודות B, D, F, ו-H) עד הבארות מלאות והחיץ הוא זורם חופשי בין בארות סמוכות. עבור חלקיקים, תהליך זה צריך להתבצע בזהירות נוספת על מנת להבטיח את החלקיקים יישארו בתחתית גם הדגימה (עמודות, C, E ו-G) ואינו מועבר לשחרור הסמוך היטב (עמודות B, D, F , ו-H). במקרים מסוימים, צנטריפוגה נדרשה למקם את דגימות nanoparticle בתחתית הדגימה היטב (עמודות A, C, E ו-G).
- בשלב הבא, את צלחת שחרורו היא חתום עם מכסה והניחה בטמפרטורה הרצויה (כלומר 37 מעלות צלזיוס) מתחת לתסיסה לתקופת הניסוי.
- בנקודתי זמן מצטברות (כלומר 0.04, 1, 2, 3, 5, 7, 9, 12, 15, 19, 24, ו 30 ימים) כמות החלבון fluorochrome מצומדות פרסם היא לכמת באמצעות סורק 9400 טיפון משטח פלורסנט ( GE Healthcare). צלחת שחרורו מונחת על משטח הסורק, שנסרק באמצעות ליזר העירור המתאים ופליטת filteRS, ועוצמת הקרינה של החלבון שוחרר בשחרור הבארות (עמודות B, D, F ו-H) הוא לכמת (קוואנט תמונה). הוא הציע כי סטנדרטים של ריכוזי חלבון ידוע להיכלל בצלחת גם לחישוב כמות חלבון וחשבונאי למרווית fluorochrome.
4. נציג תוצאות
עם הייצור של פולימר הספרייה, אפיון בוצע עם H NMR 1, GPC, וכדי לאמת את שיטת FTIR קומבינטורית זה 1,7,8,11. טווח משקלים מולקולרי מ10,000-20,000 ג'/ mol, מדד נע polydispersity 1.5-3.0, והרכב כימי הוכח כמדויק ובהסכם עם שיטות קונבנציונליות של סינתזת polyanhydride 12-15. כמו כן, תמונות SEM של ספריות חלקיקים הראו מורפולוגיה דומה לפני שטח, גודל והתפלגות גודל כמו זה של חלקיקים מפוברקים קונבנציונלי 2. חלבון השחרור kinetics מחלקיקי polyanhydride או סרטים מתבצע בצלחת גם שונה כפי שתואר לעיל 1. התוצאות הראה שחרור כדי לאפס משוער עם או בלי פרץ תלוי העמסת חלבון וכימית פולימר (איורים 2 ו -3) 1,12,14,16.
איור 1. סרט קומבינטורית פולימר ומנגנון הייצור nanoparticle.
איור 2 שחרור תפוקה גבוהה של טקסס האדומה השור אלבומין (TRBSA) מCPH:. ספריית פולימר nanoparticle SA. chemistries הפולימר SA-עשיר לשחרר מארז TRBSA במהירות הרבה ביותר, ואילו chemistries הפולימר CPH העשיר לשחרר האיטי ביותר. ברי שגיאה מייצגים סטנדרטית לסטייהtion וn = 4. הודפס מחדש באישור מפטרסן et. אל. 1. כל זכויות שמורה 2010 אגודה אמריקנית לכימיה.
איור 3 לשחרר תפוקה גבוהה של טקסס האדומה השור אלבומין (TRBSA) מCPTEG:. ספריית סרטי פולימר CPH. chemistries הפולימר CPTEG העשיר לשחרר מארז TRBSA במהירות הרבה ביותר, ואילו chemistries הפולימר CPH העשיר לשחרר האיטי ביותר. ברי שגיאה מייצגים סטיית תקן וn = 3.
איור 4. תמונה שמציגה שתי בארות שכנות "לפני" ושינוי "אחרי" בצלחת עמוקה פוליפרופילן גאה 96. התמונה "אחרי" השינוי בימין גם מתארת את התוספת של סרט פולימר (חלק תחתון של שמאל גם) עם מולקולת ניאון כמוסהששוחרר בין שתי בארות לפתרון חיץ. אז מולקולת הניאון שוחרר הוא זוהה בימין גם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ידע של תנאי הסינתזה הדרושות ואת טמפרטורות מעבר הזכוכית (T g ים) של הפולימרים המסונתזים חיוני לייצור ספרייה. אם T g שלהם מתחת לטמפרטורת חדר, צעד ייצור nanoparticle ייתכן שיצטרך להתבצע בסביבה מבוקרת טמפרטורה מתחת T g של הפולימרים. בנוסף, זהירות יש לנקוט על מנת להבטיח שכל הציוד שבא במגע עם טמפרטורות גבוהות והממסים חייב להיות בכושר כדי להתמודד עם תנאים אלה. כמה מהפרמטרים של פרוטוקול זה יכול להיות מותאם (כלומר, טמפרטורה, ואקום, זמני דגירה, ממסים, ממסים-עישון, ריכוז פולימר, יחסי ממס שאינם ממסים, וכו ') כדי להתאים את מערכות פולימרים שונות לסינתזה או חלקיק / סרט דיה. במקרים מסוימים, חלקיקים אינם יציבים בממסים לתקופות זמן ארוכות (מספיק להסרת ממס ידי ייבוש ואקום) ולכן 2 rem ממס חלופישיטות סגלגלות ניתן להשתמש. 1) החלקיקים ניתן centrifuged לאט, ממס supernatant יצק, ואת החלקיקים הנותרים מיובשים או 2) החלקיקים יכולים להיות מופרדים על ידי סינון ואקום ולאחר מכן התייבשו. בעקבות ייצור של חלקיקים ריקים או חלבון טעונים / סרטים, אפיון תפוקה גבוהה או בדיקות ניתן לבצע כדי להקרין את biomaterials לחלבון, תאית, או אינטראקציות מארחות. המתודולוגיה תפוקה גבוהה זה מאפשרת אופטימיזציה המהירה של ביצועים ביולוגיים ליישום הרצוי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
החוקרים מכירים בפרס ONR-Muri (NN00014-06-1-1176) והצבא האמריקאי למחקר הרפואי וציוד הפיקוד (גרנט מס W81XWH-10-1-0806) לתמיכה כספית. חומר זה מבוסס על העבודה הנתמכת על ידי הקרן הלאומי למדע תחת גרנט המספר 0552584 EEC ו0851519.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Motorized XYZ Stage: 3x T-LSM050A, 50 mm travel per axis | Zaber Technologies | T-XYZ-LSM050A-KT04 | |
| NE-1000 Single Syringe Pump | New Era Pump Systems | NE-1000 | |
| Pyrex* Vista* Rimless Reusable Glass Culture Tubes | Corning | 07-250-125 | |
| Glass cuvettes | Scientific Strategies | G102 | |
| LabVIEW | National Instruments | 776671-35 | |
| SGE Gas Tight Syringes, Luer Loc | Sigma Aldrich | 509507 | |
| U96 DeepWell Plates 1.3 ml & 2.0 ml | Thermo Scientific: Nunc | 278743 | |
| Well cap mats | Thermo Scientific: Nunc | 276000 | |
| Typhoon 9400 | GE Healthcare | 63-0055-79 | |
| Whatman Grade 50 Circles 90 mm | Whatman | 1450-090 |
References
- Petersen, L. K., Sackett, C. K., Narasimhan, B. A novel, high-throughput method to study in vitro protein release from polymer nanospheres. J. Comb. Chem. 12, 51-56 (2010).
- Petersen, L. K. Activation of innate immune responses in a pathogen-mimicking manner by amphiphilic polyanhydride nanoparticle adjuvants. Biomaterials. 32, 6815-6822 (2011).
- Vogel, B. M., Cabral, J. T., Eidelman, N., Narasimhan, B., Mallapragada, S. K. Parallel synthesis and high-throughput dissolution testing of biodegradable polyanhydride copolymers. J. Comb. Chem. 7, 921-928 (2005).
- Petersen, L. K. High-throughput evaluation of in vivo biodistribution of polyanhydride nanoparticles. Adv. Healthcare Mater. , Forthcoming (2012).
- Petersen, L. K., Narasimhan, B. Combinatorial design of biomaterials for drug delivery: opportunities and challenges. Expert Opin. Drug Deliv. 5, 837-846 (2008).
- Petersen, L. K., Oh, J., Sakaguchi, D. S., Mallapragada, S. K., Narasimhan, B. Amphiphilic polyanhydride films promote neural stem cell adhesion and differentiation. Tissue Eng. 17, 2533-2541 (2011).
- Petersen, L. K., Sackett, C. K., Narasimhan, B. High-throughput analysis of protein stability in polyanhydride nanoparticles. Acta Biomater. 6, 3873-3881 (2010).
- Petersen, L. K., Xue, L., Wannemuehler, M. J., Rajan, K., Narasimhan, B. The simultaneous effect of polymer chemistry and device geometry on the in vitro activation of murine dendritic cells. Biomaterials. 30, 5131-5142 (2009).
- Thorstenson, J. B., Petersen, L. K., Narasimhan, B. Combinatorial/high-throughput methods for the determination of polyanhydride phase behavior. J. Comb. Chem. 11, 820-828 (2009).
- Xue, L., Petersen, L., Broderick, S., Narasimhan, B., Rajan, K. Identifying factors controlling protein release from combinatorial biomaterial libraries via hybrid data mining methods. ACS Comb. Sci. 13, 50-58 (2011).
- Adler, A. F. High-throughput cell-based screening of biodegradable polyanhydride libraries. Comb. Chem. High Through. Screen. 12, 634-645 (2009).
- Determan, A. S., Trewyn, B. G., Lin, V. S., Nilsen-Hamilton, M., Narasimhan, B. Encapsulation, stabilization, and release of BSA-FITC from polyanhydride microspheres. J. Control. Release. 100, 97-109 (2004).
- Determan, A. S., Wilson, J. H., Kipper, M. J., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. Protein stability in the presence of polymer degradation products: consequences for controlled release formulations. Biomaterials. 27, 3312-3320 (2006).
- Torres, M. P., Determan, A. S., Anderson, G. L., Mallapragada, S. K., Narasimhan, B. Amphiphilic polyanhydrides for protein stabilization and release. Biomaterials. 28, 108-116 (2007).
- Torres, M. P., Vogel, B. M., Narasimhan, B., Mallapragada, S. K. Synthesis and characterization of novel polyanhydrides with tailored erosion mechanisms. J. Biomed. Mater. Res. A. 76, 102-110 (2006).
- Carrillo-Conde, B. Encapsulation into amphiphilic polyanhydride microparticles stabilizes Yersinia pestis antigens. Acta Biomater. 6, 3110-3119 (2010).
