Summary
이 방법은 생분해 성 polyanhydride 필름과 nanoparticle 라이브러리의 조합 합성과 이러한 라이브러리의 단백질 릴리스의 높은 처리량 감지 기능을 설명합니다.
Abstract
Polyanhydrides 우수한 biocompatibility 및 약물 전달 기능을 갖춘 biomaterials의 클래스입니다. 그들은 함께 광범위하게 연구되어 있지만 기존의 한 샘플 - 타임에서 합성 기술, 더 최근의 높은 처리량 접근 방식은 polyanhydrides 1 큰 도서관의 합성 및 테스트를 가능하게 개발되었습니다. 이보다 효율적으로 최적화 및 약물 및 백신 전달 응용 프로그램에 대한 이러한 biomaterials의 설계 과정을 촉진합니다. 이 작품의 방법은 생분해 성 polyanhydride 필름과 nanoparticle 라이브러리의 조합 합성과 이러한 라이브러리의 단백질 릴리스의 높은 처리량 감지 기능을 설명합니다. 이 robotically 작동하는 방법 (그림 1)에서 선형 액츄에이터 및 주사기 펌프는 사용자 오류를 제거, 핸즈프리 자동화 프로토콜을 수 LabVIEW에 의해 제어됩니다. 또한,이 방법은 마이크로 스케일 폴리머 라이브러리의 급속한 제조, 빨간색 수multivariant 폴리머 시스템의 창조의 결과로 동안 배치 크기를 ucing. 고분자 합성이 조합 방식은 통상 한 고분자를 합성하기 위해 취할 것입니다 시간의 상응하는 금액의 15 가지의 폴리머까지의 합성을 촉진시킨다. 또한, 조합 폴리머 도서관 (나노 입자)을 비 용매로 또는 진공 건조 (필름 용)에 의한 용매 및 강수량의 영화 또는 폴리머 라이브러리의 해산시 나노 입자를 포함한 공백 또는 단백질로드 형상으로 가공 할 수 있습니다. 폴리머 라이브러리에 fluorochrome - 복합 단백질을로드되면, 단백질 릴리스 속도론는 이전에 한 설명한 바와 같이 형광 기반의 탐지 방법 (도 2 및도 3)를 사용하여 높은 처리량을 평가 할 수 있습니다. 이 조합 플랫폼은 기존 방법으로 검증 된 2 polyanhydride의 영화와 nanoparticle 라이브러리가와 특징되었습니다
Protocol
1. 조합 폴리머 도서관 합성은 (고분자 화학에 다양한) - 로봇 설치를위한 그림 1 참조
- 적절한 용매 (농도 = 25 MG / ML) 각 단량체를 해산하고 10cc 기밀 주사기에 각각로드합니다.
- 각 주사기의 끝으로 용매 저항성 유혹 잠금 모세관 튜브를 연결합니다.
- 주사기 펌프 (새로운 시대 프로그램 주사기 펌프)에 주사기를 놓고 위치로 고정.
- 시작 위치로 선형 액츄에이터 (Zaber)를 설정합니다.
- 링 스탠드 클램프를 사용 모노머 증착을위한 / 잘 시작 약병에 모세관 튜브 모두의 끝을 위치.
- 하는 각도 원하는 공중 합체 조성물에 따라 펌프로 각 단량체의 변수 볼륨을 LabVIEW 프로그램을 시작합니다. 이 문제는 원하는 볼륨을 투여하기 위하여 유리 병 / 잘하고 각 펌프에 모세관 튜브를 낮출 Z-축 액츄에이터를 지시하여 프로그램에 달성된다. NEXT는, 프로그램은 / 잘 다음 유리 병의 위치로 이동하기 위해 집 위치와 X와 Y-액츄에이터로 돌아갑니다 Z-액츄에이터를 지시합니다. 각이 잘 단량체의 원하는 볼륨이에 입금 될 때까지이 작업은 수행됩니다.
- 단량체 증착 후, 멀티 잘 또는 다중 유리 병 모노머 라이브러리는 미리 온수 진공 오븐에 전송되고 응축 중합 반응의 기간 동안 진공 incubated. 에 대한 CPH : SA의 1.5 시간에 대한 합성 반응은 180에서 수행된다 ° C, 0.3 토르, 이러한 반응 조건이 다른 폴리머 시스템마다 다를 수 있습니다.
2. 조합의 공백과 단백질 -로드 고분자 Nanoparticle 및 필름 라이브러리 제작이 - 로봇 설치를위한 그림 1 참조
- 첫 번째 프로그램 주사기 펌프에 주사기는 용매로 가득 (빈 라이브러리) 또는 단백질과 용매는 두 번째 주사기에 주사기 동안 (단백질로드 라이브러리) 거기에 분산되어펌프는 비어 있습니다. 인접한 샘플 홀더에 nanoparticle 제조를위한 튜브가 아닌 용매로 가득합니다 (비 용매에 용매의 비율은 1-100입니다.) 필름 제조를 들어 빈 다 잘 판은 인접 샘플 홀더에있는 튜브 대신 사용됩니다.
- LabVIEW 프로그램을 사용하여 용매는 도서관의 모든 폴리머 튜브 / 우물 (농도 = 20 MG / ML)로 입금하고 1-5 분 동안 incubated 수 있습니다. 선택 sonication 단계 (40 Hz에서 30들)은 전체 폴리머 용해을 보장하기 위해 도입 할 수 있습니다.
- 다음, 별도의 LabVIEW 프로그램을 시작하여 샘플은 빈 주사기로 배출되고, 인접 샘플 홀더가 아닌 용매 (나노 입자) 또는 빈도 (필름)의 해당 관에 입금.
- 이 프로세스는 분리 된 폴리머 라이브러리의 각 구성에 대해 수행됩니다.
- nanoparticle 또는 필름 라이브러리는 다음 용매와 비 용매 제거 (nanoparticle의 천칭 자리를위한 진공 챔버에 배치됩니다보시지도) 진공 여과를 사용하여 복구 할 수 있습니다.
3. 높은 처리량 단백질 출시 속도론
- , 폴리머 라이브러리에서 높은 처리량 단백질 릴리스 속도론에 대해 조사를위한 96 (2 ML / 잘) 깊은 거리 던걸, 폴리 프로필렌 플레이트는 수정 같은 그 상단 이웃 열에 잘 벽의 1 / 3 (예 : A와 B, C와 D, E 및 F, G 및 H)은 우물을 인접하고 제거됩니다. 단백질로드 필름에 제조하거나 나노 입자는 높은 처리량 출시 동력학 연구를 수행하려면이 판에 전송해야합니다. 단백질로드 nanoparticle 또는 필름 샘플은 인접한 열 (: A, C, E 및 G 예) 잘 하나에 배치해야합니다. 자세한 내용은 그림 4를 참조하십시오.
- 96 깊은 거리 던걸 출시 판에 나노 입자의 전송 후, 입자는 해결 할 수 있습니다. PBS 버퍼 (0.1 MM, 산도 7.4)이 서서히 각 이웃도 (열 B, D 그 다음에 잘 각 샘플에 추가 (열 A, C, E 및 G)되고, F, 및 H) 우물가 가득하며 버퍼가 인접한 우물 사이에 흐르는 무료입니다 때까지. 나노 입자의 경우이 과정은 입자가 시료의 하단에 잘 (열 A, C, E 및 G)와 인접한 버전에 전송되지도 (열 B, D, F를 유지하기 위해 특히주의를 수행해야 , 그리고 H). 어떤 경우에는 원심 분리는 (열 A, C, E 및 G) 잘 샘플의 하단에있는 nanoparticle 샘플을 현지화하는 데 필요합니다.
- 다음 릴리스 판은 뚜껑을 밀봉하고 실험 기간 동안 교반에 따라 원하는 온도 (예 : 37 ° C)에 배치됩니다.
- 증분 시간 포인트 (즉, 0.04, 1, 2, 3, 5, 7, 9, 12, 15, 19, 24, 30 일)에서 발표 fluorochrome - 복합 단백질의 양이 9400 태풍 평판 형광 스캐너 사용 (계량입니다 GE 헬스 케어). 출시 판은 스캐너 표면에 배치, 적절한 여기 레이저 및 방출 filte를 사용하여 스캔RS, 그리고 릴리스 우물 (열 B, D, F 및 H)가 (이미지 양의) 계량되어에 출시 단백질의 형광 강도. 그것은 알려진 농도의 단백질 표준 fluorochrome 해소를위한 단백질 수량과 회계 계산 잘 판에 포함하는 것이 좋습니다.
4. 대표 결과
폴리머 라이브러리의 제조시, 특성화이 조합 메소드 1,7,8,11의 유효성을 검사하는 데 1 H NMR, GPC 및 FTIR을 수행하고 있습니다. 10,000-20,000에서 분자 무게 범위는 g / 몰, polydispersity 인덱스 범위 1.5-3.0에서, 그리고 화학 성분은 정확하고 polyanhydride 합성 12-15 종래의 방법으로 계약 할 표시되었습니다. 마찬가지로, 나노 입자 라이브러리의 SEM 이미지 유사한 표면 형태, 크기, 통상 제조 나노 입자 2의 것과 크기 분포를 보여 주었다. 단백질 릴리스 kinetipolyanhydride의 나노 입자 나 영화에서 CS는 이전에 한 설명 된대로 수정도 플레이트에서 수행됩니다. 결과는이 있거나 단백질 로딩 및 고분자 화학 (도 2 및도 3) 1,12,14,16 의존 버스트없이 대략 제로 주문 릴리스를 발표했다.
그림 1. 조합 폴리머 필름 nanoparticle 제조 장치.
그림 2 CPH에서 알부민 텍사스 레드 소 혈청 (TRBSA)의 높은 처리량 출시 :. SA 폴리머 nanoparticle 라이브러리를 제공합니다. CPH 풍부한 고분자 화학이 가장 느린를 공개 반면 SA 풍부한 고분자 화학은 가장 빠르게 TRBSA 캡슐화 놓습니다. 오류 막대는 표준에게도을 나타냅니다기과 n = 4. 피터슨 동부 표준시의 허가를 재 인쇄. 알. 1. 저작권 2010 미국 화학 학회.
그림 3 CPTEG에서 알부민 텍사스 레드 소 혈청 (TRBSA)의 높은 처리량 출시 :. CPH 폴리머 필름 라이브러리를 제공합니다. CPH 풍부한 고분자 화학이 가장 느린를 공개 반면 CPTEG 풍부한 고분자 화학은 가장 빠르게 TRBSA 캡슐화 놓습니다. 오류 막대는 표준 편차와 N = 3을 나타냅니다.
그림 4. "전에"두 이웃 우물을 보여주는 이미지와 96 깊은 거리 던걸 폴리 프로필렌 판에서 "후"수정. 오른쪽에있는 "후"수정 이미지는 캡슐화 된 형광 분자와 폴리머 필름 (왼쪽 물론 하단)의 추가 묘사완충 용액에 두 우물 사이에 출시된다. 출시 형광 분자 그런 다음 잘 권리가 검출된다.
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Discussion
필요한 합성 조건 및 합성되는 고분자의 유리 전이 온도 (T g들)의 지식은 도서관 제조에 필수적입니다. T g s는 실내 온도보다 낮은 경우, nanoparticle의 제조 단계는 고분자의 T g 아래의 제어 온도 환경에서 수행해야 할 수 있습니다. 또한주의는 높은 온도와 용제과 접촉 모든 장비가 해당 조건을 처리 할 적합한 있어야합니다 수 있도록주의해야한다. 이 프로토콜의 매개 변수 중 일부는 합성 또는 입자 / 영화에 대해 서로 다른 폴리머 시스템을 수용 할 수 (즉, 온도, 진공, 배양 시간, 용매, 비 용제, 폴리머 농도가 아닌 용매에 용매 비율 등)을 조정할 수 있습니다 제조. 어떤 경우에는 나노 입자는 (진공 건조하여 용매 제거를위한 충분한) 오랜 기간에 대한 용매에 안정되지되도록 두 다른 용매 수치타원형 방법을 사용할 수 있습니다. 1) 입자는 천천히, centrifuged 표면에 뜨는 용매는 decanted, 나머지 입자는 건조 또는 2) 입자가 진공 여과에 의해 분리 할 수 있으며 다음 건조 할 수 있습니다. 공백 또는 단백질로드 나노 입자 / 영화, 높은 처리량 특성 또는 테스트 후 제조는 단백질, 세포, 또는 호스트 상호 작용에 대한 biomaterials을 검진 실시 할 수 있습니다. 이 높은 처리량 방법은 원하는 응용 프로그램에 대한 biomaterial 성능의 급속한 최적화 할 수 있습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
저자는 재정 지원을위한 ONR - MURI 상 (NN00014-06-1-1176)과 미국 육군 의학 연구 및 Materiel 명령을 (부여 번호 W81XWH-10-1-0806)을 인정합니다. 본 자료는 교부금 번호 EEC 0,552,584 및 0,851,519 아래의 국립 과학 재단 (National Science Foundation)의 지원 작업에 기반을두고 있습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Motorized XYZ Stage: 3x T-LSM050A, 50 mm travel per axis | Zaber Technologies | T-XYZ-LSM050A-KT04 | |
| NE-1000 Single Syringe Pump | New Era Pump Systems | NE-1000 | |
| Pyrex* Vista* Rimless Reusable Glass Culture Tubes | Corning | 07-250-125 | |
| Glass cuvettes | Scientific Strategies | G102 | |
| LabVIEW | National Instruments | 776671-35 | |
| SGE Gas Tight Syringes, Luer Loc | Sigma Aldrich | 509507 | |
| U96 DeepWell Plates 1.3 ml & 2.0 ml | Thermo Scientific: Nunc | 278743 | |
| Well cap mats | Thermo Scientific: Nunc | 276000 | |
| Typhoon 9400 | GE Healthcare | 63-0055-79 | |
| Whatman Grade 50 Circles 90 mm | Whatman | 1450-090 |
References
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