Summary
Этот метод описывает комбинаторного синтеза биологически фильм полиангидрид и наночастиц библиотек и высокую пропускную способность обнаружения белка освобождение от этих библиотек.
Abstract
Полиангидриды представляют собой класс биоматериалов с превосходной биосовместимостью и возможности доставки лекарств. В то время как они были изучены с обычными один образец-на-времени методы синтеза, более поздняя высокой пропускной подход был разработан позволяя синтеза и испытаний крупных библиотек полиангидриды 1. Это будет способствовать более эффективной оптимизации и процесс проектирования этих биоматериалов для применения лекарств и вакцин доставки. Метод В этой работе описывается комбинаторного синтеза биологически фильм полиангидрид и наночастиц библиотек и высокой пропускной способностью обнаружения белка освобождение от этих библиотек. В этой управлением робота методом (рис. 1), линейные приводы и шприцевые насосы находятся под контролем LabVIEW, которая позволяет громкой автоматизированный протокол, устраняя ошибки пользователя. Кроме того, этот метод позволяет быстро изготовления микро-масштабе библиотеки полимера, красныйucing размер пакета в то время как в результате создания многовариантной системы полимер. Это комбинаторный подход к синтезу полимеров способствует синтезу до 15 различных полимеров в эквивалентное количество времени, которое потребуется для синтеза одного полимера условно. Кроме того, библиотека комбинаторного полимеров могут быть изготовлены в пустой или белка загруженных геометрии в том числе фильмов или наночастиц при растворении в библиотеке полимера в растворителе и осадки в не-растворитель (наночастиц) или вакуумной сушки (для пленок). При загрузке флуорохромом сопряженных белка в библиотеках полимеров, кинетики белка выпуска может быть оценена на высокой пропускной способности, используя флуоресценции на основе метода обнаружения (рис. 2 и 3), как описано ранее 1. Это комбинаторное платформа была подтверждена с помощью традиционных методов 2 и фильм полиангидрид и наночастиц библиотеки были характеризуются
Protocol
1. Комбинаторные библиотеки Синтез полимерных (Изменение в химии полимеров) - см. Рисунок 1 Роботизированная установка
- Растворите каждого мономера в соответствующем растворителе (= концентрация 25 мг / мл) и загружать каждую в 10cc газонепроницаемого шприца.
- Прикрепить растворителям приманки замок капилляров в конце каждого шприца.
- Положите шприц на шприц насосов (New Era Программируемый насос шприца) и зафиксируйте в этом положении.
- Установить линейные приводы (Zaber) в исходное положение.
- Использование зажима кольца стенда, поместить конец обоих капилляров в стартовый флакон / а для мономера осаждения.
- Инициировать программу LabVIEW, который насосов переменного объема каждого мономера в каждую лунку в зависимости от желаемого состава сополимера. Это достигается в программе инструктажа Z-оси привода, чтобы снизить капилляра в пробирку / ну а потом каждый насос для дозирования требуемого объема. НебраскаXT, программа предписывает Z-приводом, чтобы вернуться в исходное положение и X-и Y-приводы для перехода к позиции следующего флакон / а. Это осуществляется до каждой скважины желаемый объем мономера на хранение в нее.
- После осаждения мономера, мульти-хорошо или нескольких флаконов мономера библиотеки переведены в предварительно нагретую вакуумную печь и выдерживают под вакуумом для продолжительности реакции полимеризации конденсации. Для CPH: SA синтеза реакцию проводят при 180 ° С, 0,3 торр, в течение 1,5 часа, но эти условия реакции будут разными в различных полимерных систем.
2. Комбинаторные Бланк и белка загруженных наночастиц полимеров и изготовление фильмов Библиотека - см. рисунок 1 для роботизированной установки
- Шприц в первый программируемый шприцевой насос заполнен растворителя (пустой библиотеке) или растворителя с белком, диспергированные в ней (белка загруженной библиотеке), а шприц во втором шприцеНасос остается пустым. Трубы для изготовления наночастиц в соседних держатель образца заполняются без растворителя (отношение растворителя к нерастворителя составляет от 1 до 100). Для изготовления фильм пустой мульти-луночный планшет используется вместо труб в соседних держатель образца.
- Используя программу LabVIEW, растворитель хранение во всех полимеров флаконов / скважин библиотеки (концентрация = 20 мг / мл) и выдерживают в течение 1-5 мин. Необязательный этап обработки ультразвуком (30 с при 40 Гц) может быть введен, чтобы обеспечить полное растворение полимера.
- Далее, путем инициирования отдельную программу LabVIEW, образец отозвана в пустой шприц и хранение в соответствующую трубку не содержащих растворителей (наночастиц) или пустой колодец (фильмов) в соседних держатель образца.
- Этот процесс осуществляется для каждой композиции дискретных библиотеки полимеров.
- Наночастиц или фильмотеку затем помещают в вакуумную камеру для растворителя и не удаление растворителя (наночастицы Весыры могут быть восстановлены с помощью вакуумной фильтрации).
3. Высокая пропускная способность Кинетика белка релиз
- Для расследования высокой пропускной кинетики белка освобождение от библиотеки полимера, 96 глубоких навернулись (2 мл / лунку), полипропилена пластины модифицированы таким образом, что верхняя 1/3 от стенки скважины в соседних столбцах (например: А и Б, C и D, E и F, G и H) удаляется примыкать к скважинам. Белка загруженных фильмов должны быть изготовлены или наночастицы переносили в этой пластины для выполнения высокой пропускной кинетики высвобождения исследований. Белки загруженных наночастиц или пленки образцы должны быть размещены только в одной скважине соседней колонны (например: A, C, E и G). См. Рисунок 4 для деталей.
- После переноса наночастиц в 96 глубоких навернулись релиз пластинки, частицы осаждаются. PBS буфера (0,1 мМ, рН 7,4) медленно добавляют к каждому образцу и (столбцы A, C, E и G), а затем к каждой соседней скважины (столбцы B, D, F и H), пока скважин полной и буфер сыпучих между соседними скважинами. Для наночастиц, этот процесс должен проводиться с особой осторожностью, чтобы обеспечить частицы остаются на дне лунки (столбцы A, C, E и G) и не передаются в соседнюю релизе хорошо (столбцы B, D, F и H). В некоторых случаях, центрифугирования, необходимое для локализации наночастиц образца на дне лунки (столбцы A, C, E и G).
- Далее, релиз пластинки закрыты крышкой и помещают в нужной температуры (например, 37 ° C) при перемешивании в течение всего срока эксперимента.
- В дополнительных временных точках (0,04 т.е. 1, 2, 3, 5, 7, 9, 12, 15, 19, 24 и 30 дней) сумма выпустила флуорохромом сопряженных белок количественно, используя 9400 Typhoon планшетный сканер флуоресцентные ( GE Healthcare). Выпуск пластина помещается в сканер поверхности, проверенных с помощью соответствующего лазерного возбуждения и испускания FilteRS, и интенсивность флуоресценции белка выпущен в релиз скважин (столбцы B, D, F и H) количественно (Image Quant). Предполагается, что белок стандарты известных концентраций быть включены в луночный планшет для расчета количества белка и учета флуорохромом закалки.
4. Представитель Результаты
При изготовлении полимера библиотеки, характеристика была проведена с 1 Н-ЯМР, GPC, и ИК для проверки этой комбинаторный метод 1,7,8,11. Молекулярная диапазон веса от 10,000-20,000 г / моль, диапазон полидисперсности от 1.5-3.0, и химическому составу было показано, быть точными и в согласии с традиционными методами синтеза полиангидрид 12-15. Кроме того, СЭМ изображения наночастиц библиотеки показали аналогичные морфологии поверхности, размер и распределение по размерам, как и обычно изготовлены наночастицы 2. Белки выпуска kinetiCS от полиангидрид наночастиц или фильмов осуществляется в измененном также пластины, как описано ранее 1. Результаты показали, приближенных нуля выпуска порядке с или без всплеска зависит от нагрузки белка и химии полимеров (рис. 2 и 3) 1,12,14,16.
Рисунок 1. Комбинаторные полимерной пленки и устройство изготовления наночастиц.
Рисунок 2 Высокая пропускная выпуск Texas Red бычьего сывороточного альбумина (TRBSA) от CPH. SA полимер наночастицы библиотеки. SA богатый полимера химические выпустить инкапсулированные TRBSA наиболее быстро, в то время как CPH богатых химии полимеров выпустит самый медленный. Планки погрешностей представляют стандартное отклонениения и п = 4. Печатается с разрешения Петерсен и др.. ал. 1. Copyright 2010 American Chemical Society.
Рисунок 3 Высокая пропускная выпуск Texas Red бычьего сывороточного альбумина (TRBSA) от CPTEG. CPH полимерной пленки библиотеки. CPTEG богатых химии полимеров выпустить инкапсулированные TRBSA наиболее быстро, в то время как CPH богатых химии полимеров выпустит самый медленный. Планки погрешностей представляют стандартное отклонение и п = 3.
Рисунок 4. Изображение с изображением двух соседних скважин "до" и "после" модификации в 96 глубоких навернулись полипропиленовые плиты. "После" модификации изображение справа также показаны добавлением полимерной пленки (в нижней части левой а) с закрытым флуоресцентные молекулывыпускается двух скважин в буферный раствор. Выпустила флуоресцентные молекулы, то обнаружил в правой хорошо.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Знания необходимые условия синтеза и температуры стеклования (T г ы) полимеров синтезируется имеют важное значение для библиотеки изготовления. Если T ^ S ниже комнатной температуры, шаг наночастиц изготовление, возможно, придется проводить в контролируемых условиях температуры ниже Т с полимеров. Кроме того, следует проявлять осторожность, чтобы убедиться, что все оборудование, которое вступает в контакт с высокими температурами и растворители должны быть пригодными для обработки этих условий. Некоторые из параметров этого протокола может быть изменена (т.е. температура, вакуум, время инкубации, растворители, не растворители, концентрация полимера, растворителя нерастворителя отношения и т.д.) для размещения различных полимерных систем для синтеза или частиц / фильм изготовление. В некоторых случаях наночастицы не являются стабильными в растворителях в течение длительного периода времени (достаточного для удаления растворителя путем вакуумной сушки), поэтому два альтернативных растворителей бэровальной методы могут быть использованы. 1) частицы могут быть медленнее, центрифугируют, супернатант сливают растворитель, а остальные частицы сушат или 2) частицы могут быть отделены с помощью вакуумной фильтрации и сушат. После изготовления пустой или белка загруженных наночастиц / фильмы с высокой пропускной характеристике или испытания могут быть проведены на экран биоматериалов для белков, клеточных, или хост взаимодействия. Этот высокой пропускной методология позволяет быстро оптимизации производительности биоматериала для нужного приложения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Авторы признают, ОНР-MURI Award (NN00014-06-1-1176) и армии США медицинских исследований и материального Command (грант № W81XWH-10-1-0806) за финансовую поддержку. Этот материал основан на работе, поддержанной Национальным научным фондом под Грантом Номер ЕЭС 0552584 и 0851519.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Motorized XYZ Stage: 3x T-LSM050A, 50 mm travel per axis | Zaber Technologies | T-XYZ-LSM050A-KT04 | |
| NE-1000 Single Syringe Pump | New Era Pump Systems | NE-1000 | |
| Pyrex* Vista* Rimless Reusable Glass Culture Tubes | Corning | 07-250-125 | |
| Glass cuvettes | Scientific Strategies | G102 | |
| LabVIEW | National Instruments | 776671-35 | |
| SGE Gas Tight Syringes, Luer Loc | Sigma Aldrich | 509507 | |
| U96 DeepWell Plates 1.3 ml & 2.0 ml | Thermo Scientific: Nunc | 278743 | |
| Well cap mats | Thermo Scientific: Nunc | 276000 | |
| Typhoon 9400 | GE Healthcare | 63-0055-79 | |
| Whatman Grade 50 Circles 90 mm | Whatman | 1450-090 |
References
- Petersen, L. K., Sackett, C. K., Narasimhan, B. A novel, high-throughput method to study in vitro protein release from polymer nanospheres. J. Comb. Chem. 12, 51-56 (2010).
- Petersen, L. K. Activation of innate immune responses in a pathogen-mimicking manner by amphiphilic polyanhydride nanoparticle adjuvants. Biomaterials. 32, 6815-6822 (2011).
- Vogel, B. M., Cabral, J. T., Eidelman, N., Narasimhan, B., Mallapragada, S. K. Parallel synthesis and high-throughput dissolution testing of biodegradable polyanhydride copolymers. J. Comb. Chem. 7, 921-928 (2005).
- Petersen, L. K. High-throughput evaluation of in vivo biodistribution of polyanhydride nanoparticles. Adv. Healthcare Mater. , Forthcoming (2012).
- Petersen, L. K., Narasimhan, B. Combinatorial design of biomaterials for drug delivery: opportunities and challenges. Expert Opin. Drug Deliv. 5, 837-846 (2008).
- Petersen, L. K., Oh, J., Sakaguchi, D. S., Mallapragada, S. K., Narasimhan, B. Amphiphilic polyanhydride films promote neural stem cell adhesion and differentiation. Tissue Eng. 17, 2533-2541 (2011).
- Petersen, L. K., Sackett, C. K., Narasimhan, B. High-throughput analysis of protein stability in polyanhydride nanoparticles. Acta Biomater. 6, 3873-3881 (2010).
- Petersen, L. K., Xue, L., Wannemuehler, M. J., Rajan, K., Narasimhan, B. The simultaneous effect of polymer chemistry and device geometry on the in vitro activation of murine dendritic cells. Biomaterials. 30, 5131-5142 (2009).
- Thorstenson, J. B., Petersen, L. K., Narasimhan, B. Combinatorial/high-throughput methods for the determination of polyanhydride phase behavior. J. Comb. Chem. 11, 820-828 (2009).
- Xue, L., Petersen, L., Broderick, S., Narasimhan, B., Rajan, K. Identifying factors controlling protein release from combinatorial biomaterial libraries via hybrid data mining methods. ACS Comb. Sci. 13, 50-58 (2011).
- Adler, A. F. High-throughput cell-based screening of biodegradable polyanhydride libraries. Comb. Chem. High Through. Screen. 12, 634-645 (2009).
- Determan, A. S., Trewyn, B. G., Lin, V. S., Nilsen-Hamilton, M., Narasimhan, B. Encapsulation, stabilization, and release of BSA-FITC from polyanhydride microspheres. J. Control. Release. 100, 97-109 (2004).
- Determan, A. S., Wilson, J. H., Kipper, M. J., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. Protein stability in the presence of polymer degradation products: consequences for controlled release formulations. Biomaterials. 27, 3312-3320 (2006).
- Torres, M. P., Determan, A. S., Anderson, G. L., Mallapragada, S. K., Narasimhan, B. Amphiphilic polyanhydrides for protein stabilization and release. Biomaterials. 28, 108-116 (2007).
- Torres, M. P., Vogel, B. M., Narasimhan, B., Mallapragada, S. K. Synthesis and characterization of novel polyanhydrides with tailored erosion mechanisms. J. Biomed. Mater. Res. A. 76, 102-110 (2006).
- Carrillo-Conde, B. Encapsulation into amphiphilic polyanhydride microparticles stabilizes Yersinia pestis antigens. Acta Biomater. 6, 3110-3119 (2010).
