Summary
Denna metod beskriver den kombinatoriska syntesen av biologiskt nedbrytbara polyanhydrid film och bibliotek nanopartiklar och hög genomströmning detektion av protein-frisättning från dessa bibliotek.
Abstract
Polyanhydrider är en klass av biomaterial med utmärkt biokompatibilitet och läkemedel leveransförmåga. Medan de har studerats ingående med konventionella ett-prov-till-en-time syntestekniker, har en nyare hög genomströmning metod utvecklats som möjliggör syntes och testning av stora bibliotek av polyanhydrider 1. Detta kommer att underlätta en effektivare optimering och designprocess dessa biomaterial för läkemedel och vaccin leverans applikationer. Metoden i detta arbete beskriver kombinatorisk syntes av biologiskt nedbrytbara polyanhydrid film och bibliotek nanopartiklar och hög genomströmning detektion av protein-frisättning från dessa bibliotek. I denna robot manövrerad metod (figur 1), är linjära ställdon och pumpar sprutan kontrolleras av LabVIEW, vilket möjliggör en hands-free automatiserad protokoll, vilket eliminerar användarfel. Dessutom gör denna metod snabba tillverkning av mikro-skala polymer bibliotek, röducing satsstorleken samtidigt resulterar i skapandet av multivariant polymersystem. Denna kombinatoriska tillvägagångssätt för polymersyntes underlättar syntesen av upp till 15 olika polymerer i en motsvarande mängd tid det skulle ta att syntetisera en polymer konventionellt. Dessutom, kan det kombinatoriska biblioteket polymeren tillverkas till tomma eller protein-laddade geometrier inklusive filmer eller nanopartiklar vid upplösning av polymeren biblioteket i ett lösningsmedel och utfällning i ett icke-lösningsmedel (för nanopartiklar) eller genom vakuumtorkning (för filmer). Vid laddning av en fluorokrom-konjugerat protein i polymerpartiklarna biblioteken, kan protein frisättningskinetik bedömas vid hög genomströmning med en fluorescens-baserad detektionsmetod (figurerna 2 och 3) såsom beskrivits tidigare 1. Denna kombinatoriska plattform har validerats med konventionella metoder 2 och polyanhydrid film och bibliotek nanopartiklar har karaktäriserats med
Protocol
1. Kombinatorisk Polymer Library syntes (varierande i polymerkemi) - se Figur 1 för Robotic inställning
- Lös varje monomer i lämpligt lösningsmedel (koncentration = 25 mg / ml) och ladda varje till en 10cc gastät spruta.
- Fäst lösningsmedelsbeständiga locka lås kapillärrör till slutet av varje spruta.
- Placera sprutorna på sprutan pumpar (New Era programmerbara sprutpumpar) och lås fast.
- Ställ de linjära manöverdonen (Zaber) till utgångsläget.
- Använda klämmor ringstativ, placera slutet av båda kapillärrören i utgångsmaterialet flaskan / brunn för monomer avsättning.
- Initiera LabVIEW programmet, som pumpar variabla volymer av varje monomer i varje brunn beroende på den önskade sampolymerkompositionen. Detta uppnås i programmet genom att instruera Z-axeln manövreringsorgan att sänka kapillärrören i flaskan / brunn och sedan varje pump för att dosera den önskade volymen. NeXT, instruerar programmet Z-manövreringsorganet för att återvända till sitt utgångsläge och de X-och Y-ställdon för att flytta till läget för nästa flaskan / brunn. Detta sker tills varje brunn har önskad volym av monomer deponeras i den.
- Efter monomer-avsättning, är det med flera brunnar eller flera flaska monomer bibliotek överfördes till en i förväg uppvärmd vakuumugn och inkuberades under vakuum under varaktigheten av kondensationspolymerisation reaktionen. För CPH: SA syntes reaktionen utföres vid 180 ° C, 0,3 torr, i 1,5 h, men dessa reaktionsbetingelser varierar mellan olika polymersystem.
2. Kombinatorisk Blank och protein-laddade polymer nanopartiklar och filmbibliotek Fabrication - se figur 1 för Robotic inställning
- Sprutan i den första programmerbara sprutpumpen är fylld med ett lösningsmedel (tomt bibliotek) eller ett lösningsmedel med protein dispergerat i det (protein-laddade bibliotek) medan sprutan i den andra sprutanpumpen lämnas tom. Rör för nanopartikel tillverkning i angränsande provhållaren är fyllda med icke-lösningsmedlet (förhållandet mellan lösningsmedel och icke-lösningsmedel är 1 till 100). För film tillverkning en tom platta med flera brunnar används i stället för rören i intilliggande provhållaren.
- Med hjälp av LabVIEW programmet, lösningsmedlet deponeras i all polymer ampuller / brunnar av biblioteket (koncentration = 20 mg / ml) och inkuberades under 1-5 min. Ett valfritt sonikeringssteg (30 s vid 40 Hz) kan införas för att säkerställa fullständig polymer upplösning.
- Därefter genom att initiera en separat LabVIEW program provet tillbaka in i tomma sprutan, och deponeras i dess motsvarande rör av icke-lösningsmedel (nanopartiklar) eller tom brunn (filmer) i det angränsande provhållaren.
- Denna process utförs för varje komposition av den diskreta polymer-biblioteket.
- Nanopartikel eller filmbibliotek placeras sedan i en vakuumkammare för lösningsmedel och icke-lösningsmedel avlägsnande (nanopartiklar Library kan också utvinnas med användning av vakuumfiltrering).
3. Hög kapacitet Protein frisättningskinetik
- För att undersöka hög genomströmning kinetik protein utsläpp av en polymer bibliotek, 96 djupt vällde (2 ml / brunn), är polypropylen platta modifierad så att den övre 1/3 av den väl väggen i angränsande kolumner (t ex: A och B, C och D, E och F, G och H) avlägsnas för att gränsar brunnarna. De protein-laddade filmer måste tillverkas i eller nanopartiklarna överförs till denna platta för att utföra high-throughput frisättning kinetiska studier. Protein-loaded nanopartiklar eller film prov får endast placeras i en brunn av de angränsande kolumnerna (ex: A, C, E och G). Se Figur 4 för detaljer.
- Efter överföringen av nanopartiklar i 96 djupt vällde Release plattan partiklarna sedimentera. PBS-buffert (0,1 mM, pH 7,4) sättes långsamt till varje provbrunn (kolumnerna A, C, E och G) och sedan till varje angränsande brunn (kolumn B, D, F och H) tills brunnarna är fulla och bufferten är friflytande mellan angränsande brunnar. För nanopartiklar, måste detta förfarande utföras med extra försiktighet för att säkerställa att partiklarna förblir i botten av provbrunnen (kolumnerna A, C, E och G) och inte överföras till angränsande frisättning väl (kolumn B, D, F och H). I vissa fall, är centrifugering krävs att lokalisera nanopartiklar proverna vid botten av provbrunnen (kolumnerna A, C, E och G).
- Därefter frisättningen plattan förseglades med ett lock och placeras vid den önskade temperaturen (dvs. 37 ° C) under omröring under hela experimentet.
- Vid ökande tidpunkter (dvs. 0,04, 1, 2, 3, 5, 7, 9, 12, 15, 19, 24, och 30 dagar) mängden frisatt fluorokrom-konjugerat protein kvantifieras med användning av en 9.400 Typhoon Flatbädd Fluorescerande Scanner ( GE Healthcare). Släppet plattan placeras på skannerns yta skannas med rätt excitations laser och utsläpp filters, och fluorescensintensiteten hos det frisatta proteinet i frisättningen brunnarna (kolumn B, D, F och H) kvantifieras (Image Quant). Det föreslås att protein normer kända koncentrationer ingå i brunnar för att beräkna protein kvantitet och redovisning av fluorokrom härdning.
4. Representativa resultat
Vid tillverkning av polymeren biblioteket har karakterisering utförts med 1 H-NMR, GPC, och FTIR att validera denna metod kombinatoriska 1,7,8,11. Molekylvikter varierar från 10,000-20,000 g / mol, polydispersitetsindex sträcker från 1,5 till 3,0, och den kemiska sammansättningen har visat sig vara korrekt och i överensstämmelse med konventionella metoder för polyanhydrid syntes 12-15. Likaså visade SEM bilder av nanopartiklar biblioteken liknande yta morfologi, storlek och storleksfördelning som för konventionellt tillverkade nanopartiklar 2. Protein Release kinetics från polyanhydrid nanopartiklar eller filmer utförs i en modifierad brunnsplatta såsom beskrivits tidigare 1. Resultaten visade en ungefärlig nollte ordningens frisättning med eller utan en skur beroende protein-lastning och polymerkemi (figurerna 2 och 3) 1,12,14,16.
Figur 1. Kombinatorisk polymerfilm och nanopartiklar tillverkning apparat.
Figur 2 hög kapacitet frisättning av Texas Red bovinserumalbumin (TRBSA) från en CPH:. SA polymer nanopartiklar bibliotek. SA-rika polymer kemier släpper inkapslade TRBSA det snabbast, medan CPH-rika polymer kemiska släpper långsammaste. Felstaplar representerar standardavvikelsening och n = 4. Omtryckt med tillstånd från Petersen et. al. 1. Copyright 2010 American Chemical Society.
Figur 3 hög kapacitet frisättning av Texas Red bovinserumalbumin (TRBSA) från en CPTEG:. CPH polymerfilm bibliotek. CPTEG-rika polymer kemier släpper inkapslade TRBSA det snabbast, medan CPH-rika polymer kemiska släpper långsammaste. Felstaplar representerar standardavvikelse och n = 3.
Figur 4. Bild visar två intilliggande brunnar "före" och "efter" modifiering i 96 djupt vällde polypropylen plattan. Den "efter" modifiering bilden till höger visar även tillsats av en polymerfilm (botten av vänster väl) med en inkapslad fluorescerande molekylsläpps mellan de två brunnarna i en buffertlösning. Den frigjorda fluorescerande molekylen detekteras sedan i rätt väl.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kunskap om de nödvändiga syntesbetingelser och glasövergångstemperaturer (Tg s) hos polymererna som syntetiserade är väsentliga för biblioteket tillverkning. Om Tg s är under rumstemperatur, kan nanopartiklar tillverkningssteget måste utföras i en kontrollerad temperatur miljö under Tg för polymererna. Dessutom bör försiktighet iakttas för att säkerställa att all utrustning som kommer i kontakt med höga temperaturer och lösningsmedel måste vara i stånd att hantera dessa villkor. Flera av parametrarna i detta protokoll kan justeras (dvs. temperatur, vakuum, inkubationstider, lösningsmedel, icke-lösningsmedel, polymerkoncentration, lösningsmedel till icke-lösningsmedel förhållanden, etc.) för att passa olika polymersystem för syntes eller partikel / film tillverkning. I vissa fall, nanopartiklar är inte stabila i lösningsmedel för långa tidsperioder (tillräckligt för avlägsnande av lösningsmedel genom vakuumtorkning) så två alternerande lösningsmedel removala metoder kan användas. 1) Partiklama kan vara långsamt centrifugeras, supernatanten dekanterades lösningsmedlet, och de återstående partiklarna torkade eller 2) partiklarna kan separeras genom vakuumfiltrering och torkades därefter. Efter tillverkning av tomma eller protein-laddade nanopartiklar / filmer, hög genomströmning karakterisering eller tester kan utföras för att screena biomaterial för protein, cellulär eller interaktioner värd. Denna hög genomströmning metod möjliggör snabb optimering av biomaterial prestanda för den önskade applikationen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Författarna erkänner ONR-MURI Award (NN00014-06-1-1176) och US Army Medical Research och Materielverk (Grant No W81XWH-10-1-0806) för ekonomiskt stöd. Detta material är baserad på arbete som stöds av National Science Foundation i Grant No EEG 0552584 och 0851519.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Motorized XYZ Stage: 3x T-LSM050A, 50 mm travel per axis | Zaber Technologies | T-XYZ-LSM050A-KT04 | |
| NE-1000 Single Syringe Pump | New Era Pump Systems | NE-1000 | |
| Pyrex* Vista* Rimless Reusable Glass Culture Tubes | Corning | 07-250-125 | |
| Glass cuvettes | Scientific Strategies | G102 | |
| LabVIEW | National Instruments | 776671-35 | |
| SGE Gas Tight Syringes, Luer Loc | Sigma Aldrich | 509507 | |
| U96 DeepWell Plates 1.3 ml & 2.0 ml | Thermo Scientific: Nunc | 278743 | |
| Well cap mats | Thermo Scientific: Nunc | 276000 | |
| Typhoon 9400 | GE Healthcare | 63-0055-79 | |
| Whatman Grade 50 Circles 90 mm | Whatman | 1450-090 |
References
- Petersen, L. K., Sackett, C. K., Narasimhan, B. A novel, high-throughput method to study in vitro protein release from polymer nanospheres. J. Comb. Chem. 12, 51-56 (2010).
- Petersen, L. K. Activation of innate immune responses in a pathogen-mimicking manner by amphiphilic polyanhydride nanoparticle adjuvants. Biomaterials. 32, 6815-6822 (2011).
- Vogel, B. M., Cabral, J. T., Eidelman, N., Narasimhan, B., Mallapragada, S. K. Parallel synthesis and high-throughput dissolution testing of biodegradable polyanhydride copolymers. J. Comb. Chem. 7, 921-928 (2005).
- Petersen, L. K. High-throughput evaluation of in vivo biodistribution of polyanhydride nanoparticles. Adv. Healthcare Mater. , Forthcoming (2012).
- Petersen, L. K., Narasimhan, B. Combinatorial design of biomaterials for drug delivery: opportunities and challenges. Expert Opin. Drug Deliv. 5, 837-846 (2008).
- Petersen, L. K., Oh, J., Sakaguchi, D. S., Mallapragada, S. K., Narasimhan, B. Amphiphilic polyanhydride films promote neural stem cell adhesion and differentiation. Tissue Eng. 17, 2533-2541 (2011).
- Petersen, L. K., Sackett, C. K., Narasimhan, B. High-throughput analysis of protein stability in polyanhydride nanoparticles. Acta Biomater. 6, 3873-3881 (2010).
- Petersen, L. K., Xue, L., Wannemuehler, M. J., Rajan, K., Narasimhan, B. The simultaneous effect of polymer chemistry and device geometry on the in vitro activation of murine dendritic cells. Biomaterials. 30, 5131-5142 (2009).
- Thorstenson, J. B., Petersen, L. K., Narasimhan, B. Combinatorial/high-throughput methods for the determination of polyanhydride phase behavior. J. Comb. Chem. 11, 820-828 (2009).
- Xue, L., Petersen, L., Broderick, S., Narasimhan, B., Rajan, K. Identifying factors controlling protein release from combinatorial biomaterial libraries via hybrid data mining methods. ACS Comb. Sci. 13, 50-58 (2011).
- Adler, A. F. High-throughput cell-based screening of biodegradable polyanhydride libraries. Comb. Chem. High Through. Screen. 12, 634-645 (2009).
- Determan, A. S., Trewyn, B. G., Lin, V. S., Nilsen-Hamilton, M., Narasimhan, B. Encapsulation, stabilization, and release of BSA-FITC from polyanhydride microspheres. J. Control. Release. 100, 97-109 (2004).
- Determan, A. S., Wilson, J. H., Kipper, M. J., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. Protein stability in the presence of polymer degradation products: consequences for controlled release formulations. Biomaterials. 27, 3312-3320 (2006).
- Torres, M. P., Determan, A. S., Anderson, G. L., Mallapragada, S. K., Narasimhan, B. Amphiphilic polyanhydrides for protein stabilization and release. Biomaterials. 28, 108-116 (2007).
- Torres, M. P., Vogel, B. M., Narasimhan, B., Mallapragada, S. K. Synthesis and characterization of novel polyanhydrides with tailored erosion mechanisms. J. Biomed. Mater. Res. A. 76, 102-110 (2006).
- Carrillo-Conde, B. Encapsulation into amphiphilic polyanhydride microparticles stabilizes Yersinia pestis antigens. Acta Biomater. 6, 3110-3119 (2010).
