Summary
在此，我们描述了小鼠肺泡巨噬细胞，居住在肺先天免疫细胞，并检查其激活，共培养酸酐纳米收获的协议。
Abstract
可生物降解的纳米粒子已经出现作为一个通用平台的设计和实施新鼻内疫苗对呼吸道传染病。具体来说，酸酐纳米脂肪癸二酸（SA），芳香1,6 -双（P-羧基苯氧）正己烷（CPH），或双亲1,8 -双（P-羧基苯氧）-3,6 - dioxaoctane组成（CPTEG）显示独特的体积和表面侵蚀动力学1,2和可利用缓慢释放功能的生物大分子（如蛋白抗原，免疫球蛋白等） 在体内 3,4,5。这些纳米粒子也具有内在的辅助活动，使他们6,7,8疫苗交付平台的一个很好的选择。
为了阐明机制激活先天免疫后鼻腔粘膜接种，必须评估的分子和细胞反应的抗原P怨恨细胞（APC）负责启动免疫反应。树突状细胞是进行气管中发现的主要装甲运兵车，而在肺实质9,10,11（AMɸ）肺泡巨噬细胞为主。 AMɸ是非常有效地清除病原微生物和细胞碎片12,13肺部。此外，这种细胞类型发挥宝贵的作用在运输微生物抗原的淋巴结，这是一个重要的第一步启动适应性免疫反应9。 AMɸ也表达水平升高的先天模式识别和清道夫受体，分泌促炎介质，和总理幼稚T细胞12,14。一个人口相对纯的AMɸ（例如，大于80％），可以很容易地获得通过肺灌洗在实验室中研究。从免疫动物AMɸ收获的居民提供了一个代表性的表型的巨噬细胞，将encounter的粒子在体内的疫苗。在此，我们描述了从小鼠到收获和文化AMɸ使用的协议和检查酸酐纳米粒子在体外治疗后的巨噬细胞的激活型。
Protocol
1。鼠标采用肺灌洗收获（AMɸ）肺泡巨噬细胞
- 穿白大褂，一次性手套，和适当的保护眼睛，如适当的个人防护装备（PPE）。
- 开始收获前准备完整AMɸ（cAMɸ）培养基。新增2.5青霉素/链霉素（笔/链球菌）解决方案，250β-巯基乙醇微升（巯基乙醇）和25热灭活胎牛血清（FBS），毫升222.25 Dulbelcco的修改鹰培养基（DMEM培养基）毫升毫升。过滤消毒cAMɸ介质在真空条件下使用0.2微米的孔大小瓶顶过滤器。
- 安乐死二氧化碳窒息在euthanization室的一个健康的鼠标。虽然C57BL / 6小鼠（6-8周龄），用于该项目的目的，这种肺灌洗技术，可以进行任何的小鼠品系。使用压缩气瓶为1分钟，让气体进入腔流前鼠标放置在CH琥珀色，以保证室完全与CO 2收费。在会议厅内放置至少一分钟安乐死鼠标鼠标。此外，作为一个物理的方法如1.4中所述确认鼠标死亡，各组小鼠心脏穿刺抽血通过。
- 躺在它的背部（背侧），喷用70％乙醇的鼠标，找到胸骨，并在30度角从腹部到胸腔的23号针（1毫升注射器插入50毫米左右） 。针妥善安置，应尽可能收集血液取决于鼠标的大小介于0.4至1毫升。检查停止生命迹象的动物。
- 将鼠标在实验室工作台上，以便它躺在其腹部（腹面）。喷雾用70％乙醇消毒工作环境的鼠标。约一半，脊柱鼠标捏皮肤。使用夹层已用70％乙醇消毒的剪刀，通过皮肤小切口。</ LI>
- 抢在切口两侧的皮肤和鼠标颅尾轴沿相反的方向拉的皮肤。正确完成后，皮肤会被删除从底层的胴体。
- 现在应该显示鼠标的脖子外露的肌肉和腺体。仔细削减该组织和拉对前钳使用鼠标，从而暴露喉，气管，食管鼠标。避免切割颈内静脉或颈内动脉。
- 现在可见气管和识别是与它周围的软骨环的组织。微妙的用钳子举行气管，轻轻抬起，并分开的，这是位于背侧的食管气管。
- 做一个小切口前，其中一个持有喉气管后。应在约45°度角的切口。另外，不完全横切气管，因为这将防止从收回体腔。
- 填充用无菌PBS汤姆猫准备的导管插入导管，气管管腔装有1毫升注射器。使用镊子握住气管，并与你的手按住导管尖端，以提高控制和轻轻插入气管切开网站。轻轻插入到气管导管约20毫米。夹住气管导管，大约是释放另一方面。
- 使用装有导管1毫升的注射器，轻轻注入肺部0.75毫升无菌PBS室温，然后轻轻地吸的PBS后进入注射器。三次重复此过程，同时外部按摩胸部。从导管拔下注射器和分配到15 mL离心管灌洗液。 0.75毫升的新鲜PBS填充注射器和导管重新连接注射器后，重复步骤1.9和1.10两次，每次鼠标。液体复苏可能是局部的，取得比VO卢梅注入。如果从多个鼠标收集细胞，15 mL管放置在冰上收获细胞，肺灌洗，直到所有已执行。
2。肺灌洗AMɸ收获加工
- 10分钟在4°C离心250×Ğ肺灌洗液
- 到适当的废物容器内的生物安全柜使用无菌技术，倒出上清液。轻轻耙整个试管架顶部的离心管，重悬细胞沉淀。加入1毫升cAMɸ培养基悬浮细胞。
- 枚举的使用1库尔特颗粒计数器Z1的第二稀释剂Isoton到10毫升，库尔特计数器瓶吸取20μL细胞的细胞。添加到小瓶3至4滴ZAP-oglobin的第二裂解试剂，轻轻倒置3至4倍，然后加载到柜台样品瓶获得细胞的浓度。一定编程与稀释倍数为2×10 4的计数器显示细胞浓度为每毫升细胞数。
- 使用cAMɸ介质稀释细胞以2.5×每毫升10 5。
- 免除2 mL 2.5×10 5细胞/毫升到每个井的6孔的组织培养皿中。
- 用5％的CO 2为6小时的气氛，以丰富为37℃加湿孵化器内孵化AMɸ，培养皿，使细胞坚持到井底。轻轻吸出上清液，以不破坏贴壁细胞。
- 使用无菌PBS（钙，镁的自由），除去非贴壁细胞和碎片冲洗井。 cAMɸ培养基中加入2毫升，每口井。
- 孵育前5％的CO 2气氛，37℃培养箱培养箱内过夜细胞除了兴奋剂。这个浓缩步骤后，约87％的细胞是阳性的巨噬细胞标记CD11b和F4/80的（ 图2c）。
3。新增的Polyanhydridé纳米粒子和控制处理
- 编造通过酸酐反溶剂nanoencapsulation的15纳米。在这个过程中，聚合物溶解在二氯甲烷（4°在浓度为25毫克/毫升）和戊烷（-20°C〜1:200的比例二氯甲烷：戊烷）沉淀。
- 掂量出酸酐纳米粒子，用消毒纸张重量上的平衡，可以准确地测量微克量。加入到1.5 mL离心管中的颗粒。
- 悬浮纳米颗粒在冰冷cAMɸ的。计算不超过0.3毫升培养基添加到每口井，以获得所需浓度的纳米粒子。置于冰上直到纳米粒子添加到文化的再悬浮颗粒。
- 添加纳米的AMɸ文化之前，使用微尖板凳顶sonicator超声颗粒。消毒喷洒70％乙醇和wipin的微尖g与无菌Kimwipe事先向超声。超声在10-20焦耳为30至45秒，同时保持在冰上管。肉眼观察到纳米粒子悬浮。如果颗粒没有得到充分的分散，使悬挂设置1至2分钟，上冰，以确保纳米粒子聚合物的玻璃化转变温度低于前再次超声分散为30至45秒。这种超声一步的目的是充分分散纳米粒子，作为50:50 CPTEG的：青山医院纳米粒子往往聚集时，接触到水环境。然而，一些小的纳米粒子聚集可能仍然暂停。
- 纳米粒子悬浮液（充分分散）应保持在冰上，并立即使用，以防止过早表面糜烂或聚集。
- 取出培养皿中含有从孵化AMɸ在生物安全柜的地方。倾斜板在约45度角和关闭的Medi量移液器UM将被添加到纳米粒子悬浮液（它不应该超过0.3毫升）。移除介质时，请勿打扰的贴壁细胞。
- 涡酸酐纳米粒子悬浮简要之前将它添加到相应的井。吸取到具体的井（S）（不超过0.3毫升）的纳米粒子悬浮量，但是，不吸取了上下混合。这个动作可以分离附着AMɸ从井里。这些粒子将落户到井底，接触的细胞。对于在本报告所述的研究，纳米粒子与AMɸ合作培养的最终浓度为125微克/毫升。随后的水井和理想的治疗组进行。包括正面和负面的控制，如中等只有200毫微克/毫升脂多糖（LPS）到指定的井组。
- 返回的培养皿中，以37°C间湿润的孵化器与5％CO 2 48小时的气氛。在我们laborator动力学研究y有证明48小时内是最佳培养时期的细胞表面标记的表达和分泌细胞因子的转录和蛋白合成发生，因为它允许有足够的时间评估。虽然扩展文化时期（即72小时）期间积累更高水平的细胞因子，评估在这个时间点的细胞表面标志的表达，可以混淆的细胞因子水平升高的贡献。观察表面标志表达的变化可能并不直接归属与纳米粒子本身的刺激。
4。评价AMɸ激活使用流式细胞仪
- 准备荧光激活细胞分选（FACS）缓冲液（0.1％叠氮化钠和0.1％牛血清白蛋白（BSA））在0.1 M磷酸缓冲液（pH值7.4）之前收获镀巨噬细胞与纳米Ø已共同培养ŕ兴奋剂。
- 准备工作阻断缓冲区和单克隆抗体的解决方案。准备块缓冲，稀释抗体（Sigma公司）和anti-CD16/32（eBioscience）为1 mg / mL和10μg/ ml的大鼠，分别在流式细胞仪缓冲区。稀释表面标记抗体在流式细胞仪缓冲面板制造商建议的浓度或用户优化浓度。在这项工作中提出的结果，表面标志面板组成的MHC II类，CD86，CD40和CIRE（CD209）抗体。面板中还包括抗鼠抗体对巨噬细胞标记F4/80的和CD11b积极识别数据分析过程中的巨噬细胞的表型。时，选择对MHC II类分子的抗体，为近交系小鼠品系，往往在他们的MHC二单体型不同，必须小心。选定的抗体必须与您感兴趣的小鼠品系表达了特定的MHC同种抗原反应。
- 经过48小时的孵化与纳米粒子和/或兴奋剂，冰20分钟的地方细胞培养皿。从板块中删除的贴壁的巨噬细胞，24厘米细胞刮刀轻轻刮去井。
- 使用5毫升血清吸管，轻轻吸细胞和中等上下五次产生单细胞悬液。成独立的5毫升聚苯乙烯管吸取个别井的内容，所以不能混在一起从不同的试验性治疗的细胞。
- 每管加入2毫升流式细胞仪缓冲。
- 管细胞在4°C离心10分钟，在250×Ğ。
- 倒出上清，在剩余液轻轻重悬细胞沉淀，耙管穿过一个试管架的顶部。
- 为了防止非特异性结合的单克隆抗体，每管细胞添加10μL封闭液（4.2准备）。涡流管和孵育30分钟冰。
- 每个管和incub的加入适当稀释的单克隆抗体体积在冰上15分钟的暗吃。包含要分析的样品管应该得到的polycromatic面板（应个别实验室进行抗体结合以前的优化）抗体结合。其他对照组应包括正确设置流式细胞仪上采集参数，包括一管没有标记的细胞，并补偿管对应单独使用每一个单一的颜色来标记细胞。要正确设置流式细胞仪分析的大门，荧光减一（FMO）的控制，应包括在收购。鱼类统营处的控制面板上除了一个用来取代其各自的同型对照与所有的荧光标记的抗体标记细胞。正面和负面的人群（即，与阳性对照兴奋剂和中等细胞单独分装），也应包括在鱼类统营处和补偿控制管。
- 耙管穿过一个试管架的顶部，倒出上清液和残余液重悬细胞沉淀。
- 如果抗体面板组成，但不直接结合到荧光抗体，生物素，而不是共轭，荧光标记的链霉亲和需要形象化的表面标志。在此步骤中，加入稀释的荧光标记的链霉亲和适当的音量，并在黑暗中孵育15分钟冰。在4.2，将稀释的链霉制造商推荐的浓度或用户优化。这一步只需要含有生物素化抗体的面板。
- 执行在4.10中所述的洗涤步骤。
- 屋宇署稳定在去离子水1:3的固定液稀释适当的音量。每管加入100μL稀释固定液而轻轻VOrtexing，以防止细胞聚集。标记和固定细胞可以稳定储存在4°C大约一个星期之前收购流式细胞仪在黑暗中。
5。具有代表性的数据
在步骤3.1制备纳米粒子的平均直径163±24 nm和形态的与5,16以往的研究结果一致。在解决前，后超声纳米如图1所示，证明超声的需要，以确保足够分散的颗粒。通过肺灌洗获得的收获AMɸs流仪分析如图2所示。 CD11b和抗鼠抗小鼠F4/80的抗体以及相应的鱼类统营处控制相结合的细胞标记允许建立背景标签，，确定AMɸs门作进一步的分析。与酸酐的肺泡巨噬细胞治疗纳米粒子增强活化增加，平均荧光强度（ 图3）MHC II类分子CD40，CD86，CIRE所示。
图1 50:50 CPTEG：本院纳米（一）之前和之后（二）30超声小号。
图2。流（一）的Alexa Fluor 700抗CD11b和PE-Cy7鱼类统营处控制（B）的Alexa Fluor 700鱼类统营处控制和PE-Cy7 anti-F4/80标记的收获肺泡巨噬细胞的流式细胞仪分析和（C ）的Alexa Fluor 700抗CD11b和PE-Cy7 anti-F4/80。在右上角的数字代表双阳性细胞的百分比。
图3。直方图显示荧光INTEN增加电视大学50:50 CPTEG肺泡巨噬细胞共培养后表面的表达，CD86，MHC II类（甲），CD40分子（乙）（C）和CIRE（四）：青山医院酸酐纳米为48小时。直方图描绘为鱼类统营处控制为AMɸ标记（ 
），未经处理的AMɸ对所有的细胞表面标志的抗体标记（ 
）和AMɸ纳米粒子和培养，对所有的细胞表面标志的抗体标记（ 
）。
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Discussion
酸酐纳米疫苗平台显示效果时，给予单剂量疗法5滴鼻。在此疫苗交付平台引起的肺部测量驻地吞噬细胞群的激活，允许评估其潜在的能力，最终促进适应性免疫反应。
具体来说，从肺灌洗液中收获肺泡巨噬细胞和不同配方的纳米粒子治疗提供了不同的粒子化学能力的见解，激活巨噬细胞，导致抗原提呈6,8。此外， 在体外研究中，这些都是用于评估这些颗粒佐剂配方的能力，激活肺泡巨噬细胞前开始和体内研究更复杂的。实验应始终包含一个水面的积极控制治疗é标记，如脂多糖，Toll样受体4激动剂上调。在规划实验前应小心收获肺泡巨噬细胞作为这个协议可能无法产生足够数量的细胞需要在一个实验中的多种治疗。肺灌洗，因此可能需要在多个小鼠进行更多的治疗组的实验，以确保足够的细胞数量（〜5.0×10 5细胞每鼠标）。大鼠肺容量肺灌洗技术，也为其他物种的报道，并利用流体量是成正比的物种正在研究（即小鼠肺容量为1毫升，10毫升和人类的肺容量为6升17。
酸酐纳米制定和干粉形式储存，以防止过早地表侵蚀。因为静态的相互作用，在粒子聚集的结果，超声之前除了细胞培养是必要的。这一STEP可以均匀分布，并导致更多的可重复性的结果。肺泡巨噬细胞，使用流式细胞仪定量分析细胞表面标志是复杂的，强大的自体荧光信号。这个障碍是可以克服的优化流式细胞仪抗体浓度，多色荧光组合，流式细胞仪捕获参数（即，使用补偿控制）。鱼类统营处控制在一个时间允许一个荧光参数的变化，设置每个抗体的大门，使正确的定量分析细胞表面标志的表达。在小鼠品系的差异，也应考虑在选择的抗体，尤其是单体型特异性的MHC II类。
有标准化的方法来确定活化抗原提呈细胞在肺是很重要的，因为这将大大促进不同的实验室和机构之间的新型生物材料的比较。根肺泡巨噬细胞erating一致的群体，通过这里介绍的方法，提供最佳条件下，获得有用的数据，对不同配方的纳米粒子和自身免疫的提高潜力。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
作者想感谢来自衣阿华州立大学流式细胞设施美国陆军医学研究和装备司令部（格兰特W81XWH-09-1-0386和W81XWH-10-1-0806号）的财政支持和肖恩·里格比博士他的专家技术援助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cAM Media | |||
| DMEM | Cellgro | 15-013-CV | |
| 50 mM 2-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M3148-25ML | |
| Penicillin/Streptomycin 10,000 μg/ mL Solution | Cellgro | 30-002-CI | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| FACS Buffer | |||
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S671-500 | |
| Sodium phosphate | Fisher Scientific | MK7868500 | |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P217500 | |
| Potassium phosphate | Fisher Scientific | P288-200 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma-Aldrich | A7888 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Antibodies | |||
| Rat IgG | Sigma-Aldrich | I4341 | |
| Anti-Ms CD16/32 | eBioscience | 16-0161 | |
| Anti-Ms MHC II haplotype I-A/I-E, clone M5/114.15.2, conjugated to fluorescein isothiocyanate (FITC) | eBioscience | 11-5321 | |
| Anti-mouse CD86, clone GL-1, conjugated to allophycocyanin (APC)-Cy7 | Biolegend | 105030 | |
| Anti-mouse CD40, clone 1C10, conjugated to APC | eBioscience | 17-0401 | |
| Anti-mouse CD209, clone 5H10, conjugated to Biotin | eBioscience | 13-2091 | |
| Anti-mouse CD11b, clone M1/70, conjugated to Alexa Fluor 700 | eBioscience | 56-0112 | |
| Anti-mouse F4/80, clone BM8, conjugated to phyc–rythrin (PE)-Cy7 | eBioscience | 25-4801 | |
| PE-Texas red conjugated Streptavidin | BD Biosciences | 551487 | |
| Other Supplies and Reagents | |||
| Ethanol | Fisher Scientific | A405-20 | Used as 70% (v/v) |
| Compressed CO2 | Linweld | 16000060 | |
| 1 mL Syringe | BD Biosciences | 309659 | |
| Sovereign 3 ½" Fr Tom Catcatheter | Kendall | 703021 | |
| Biosafety Cabinet | NUAIRE | Series 22 | |
| Dissection Scissors | Fisher Scientific | 138082 | |
| Forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-8254 | |
| PBS, 1X without calcium and magnesium | Cellgro | 21-040-CM | |
| 15 mL Centrifuge Tubes with Screw Cap | VWR international | 21008-216 | |
| Six-well Tissue Culture Treated Plates | Costar | 3516 | |
| Plastic Tube Racks | Nalge Nunc international | 5970 | |
| Cell Scraper 24 cm | Techno Plastic Products | 99002 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube | Falcon BD | 352008 | |
| Pipet-aid XL | Drummond Scientific | 4-000-105 | |
| 10, 5, and 2 mL Pipettes | Fisher Scientific | 13-675 | |
| 200 and 10 μL micropipettors | Gilson Pipetman | F123601 | |
| 200 and 10 μL pipette tips | Fisher Scientific | 02-707 | |
| BD Stabilizing Fixative | BD Biosciences | 338036 | |
| Isoton II Diluent | Beckman Coulter Inc. | 8546719 | |
| Zap-oglobin II Lytic Reagent | Beckman Coulter Inc. | 7546138 | |
| Coulter Counter Polystyrene Vials | Beckman Coulter Inc. | 14310-684 | |
| Test Tubes | BD Biosciences | 352008 | |
| Equipment | |||
| Refrigerated Centrifuge | Labnet International | 50075040 | |
| Humidified Incubator CO2 | Nuaire | Model Autoflow 8500 | |
| FACSCanto Flow Cytometer | BD Biosciences | 338960 | |
| Coulter Particle Counter Z1 | Beckman Coulter Inc. | WS-Z1DUALPC | |
| Sonicator Liquid Processing Equipment with Microtip | Misonix | Model No. S-4000 | |
References
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