Summary
इस के साथ साथ, हम murine वायुकोशीय मैक्रोफेज, जो सहज प्रतिरक्षा कोशिकाओं के फेफड़ों में निवास कर रहे हैं, और सह संस्कृति के जवाब में polyanhydride नैनोकणों के साथ अपने सक्रियण की जांच की कटाई के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन.
Abstract
Biodegradable नैनोकणों श्वसन संक्रामक रोगों के खिलाफ नए intranasal टीके के डिजाइन और कार्यान्वयन के लिए एक बहुमुखी मंच के रूप में उभरा है. विशेष रूप से, polyanhydride स्निग्ध sebacic एसिड (एसए), सुरभित (पी carboxyphenoxy) 1,6 - बीआईएस हेक्सेन (CPH), या amphiphilic (पी carboxyphenoxy) 1,8 - बीआईएस -3,6 dioxaoctane से बना नैनोकणों (CPTEG) अद्वितीय थोक और सतह कटाव कैनेटीक्स 1,2 प्रदर्शन और धीरे 3,4,5 vivo में कार्यात्मक biomolecules के (जैसे, प्रोटीन प्रतिजनों, immunoglobulins, आदि) जारी करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. ये भी अधिकारी आंतरिक सहायक गतिविधि नैनोकणों, उन्हें 6,7,8 एक वैक्सीन वितरण मंच के लिए एक उत्कृष्ट पसंद बना.
आदेश में intranasal mucosal टीकाकरण के बाद सहज रोगक्षमता की सक्रियण संचालन तंत्र को स्पष्ट करने के लिए, एक प्रतिजन पी की आणविक और सेलुलर प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन करना होगाresenting (APCs) कोशिकाओं प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की शुरुआत के लिए जिम्मेदार है. वृक्ष के समान कोशिकाओं प्रिंसिपल APCs वायुमार्ग आयोजन में पाया है, जबकि वायुकोशीय मैक्रोफेज (AMɸ) फेफड़ों पैरेन्काइमा 9,10,11 में प्रबल होना. AMɸ माइक्रोबियल रोगज़नक़ों और कक्ष 12,13 मलबे के फेफड़ों समाशोधन में अत्यधिक कुशल हैं. इसके अलावा, इस सेल प्रकार से draining लिम्फ नोड्स, जो एक अनुकूली प्रतिरक्षा 9 प्रतिक्रिया की दीक्षा में एक महत्वपूर्ण पहला कदम है माइक्रोबियल प्रतिजनों के परिवहन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है. AMɸ भी सहज पैटर्न मान्यता और मेहतर रिसेप्टर्स, छिपाना समर्थक भड़काऊ मध्यस्थों, और प्रधानमंत्री भोले टी कोशिकाओं 12,14 का ऊंचा स्तर व्यक्त करते हैं. AMɸ (उदाहरण के लिए, 80% से अधिक) के एक अपेक्षाकृत शुद्ध आबादी आसानी से प्रयोगशाला में अध्ययन के लिए फेफड़ों के पानी से धोना के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है. निवास AMɸ प्रतिरक्षा सक्षम जानवरों से काटा मैक्रोफेज है कि encounte के एक प्रतिनिधि फेनोटाइप प्रदानr vivo में कण आधारित टीका. इस के साथ साथ, हम चूहों से फसल और संस्कृति AMɸ के लिए इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल का वर्णन है और इन विट्रो में polyanhydride नैनोकणों के साथ इलाज के बाद मैक्रोफेज की जांच सक्रियण फेनोटाइप.
Protocol
1. फेफड़े Lavage माउस का उपयोग कर से वायुकोशीय मैक्रोफेज (AMɸ) फसल काटने वाले
- उपयुक्त एक प्रयोगशाला कोट, डिस्पोजेबल दस्ताने, और उचित नेत्र सुरक्षा के रूप में व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई) पहनें.
- फसल की दीक्षा से पहले पूरा AMɸ (cAMɸ) मध्यम तैयार. पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन / (/ कलम strep) समाधान, β-mercaptoethanol 250 μL (दो - mercaptoethanol), और है Dulbelcco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) 222.25 एमएल गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के 25 एमएल की 2.5 एमएल जोड़ें. फ़िल्टर बाँझ cAMɸ वैक्यूम के अंतर्गत 0.2 माइक्रोन रोमकूप आकार बोतल शीर्ष फिल्टर का उपयोग कर मध्यम.
- सीओ 2 एक euthanization कक्ष में asphyxiation द्वारा स्वस्थ माउस Euthanize के. हालांकि एक C57BL / 6 माउस (पुराने 6-8 सप्ताह) इस परियोजना के उद्देश्यों के लिए इस्तेमाल किया गया था, यह फेफड़ों के पानी से धोना तकनीक माउस के किसी भी तनाव पर निष्पादित किया जा सकता है. एक संकुचित गैस सिलेंडर का प्रयोग, 1 मिनट के लिए कक्ष में गैस प्रवाह से पहले हम चर्चा में माउस को रखने के लिएएम्बर विश्वास दिलाता हूं कि कक्ष सीओ 2 के साथ पूरी तरह से चार्ज किया जाता है. कक्ष में कम से कम एक मिनट के लिए माउस euthanize के लिए माउस रखें. इसके अलावा, हृदय गति समस्या के माध्यम से एक शारीरिक के लिए माउस मौत की पुष्टि के रूप में 1.4 में वर्णित विधि के रूप में प्रत्येक माउस रक्तहीन करना.
- अपनी वापस (पृष्ठीय पक्ष), 70% इथेनॉल के साथ स्प्रे पर माउस रखना, उरोस्थि का पता लगाने और, पेट से एक 30 डिग्री के कोण पर, वक्ष गुहा में 50 मिमी के बारे में एक 23 गेज सुई (1 एमएल सिरिंज से जुड़ी) सम्मिलित . सुई के उचित स्थान के साथ, यह संभव हो सकता है माउस के आकार के आधार पर रक्त का 0.4 के बीच 1 एमएल इकट्ठा करना चाहिए. महत्वपूर्ण संकेत की समाप्ति के लिए पशु जांच करते हैं.
- प्रयोगशाला बेंच पर जगह माउस इतना है कि यह अपने पेट (उदर ओर) पर झूठ बोल रही है. 70% इथेनॉल के साथ काम कर पर्यावरण बाँझ स्प्रे माउस. के बारे में माउस की रीढ़ की हड्डी के नीचे आधे रास्ते त्वचा चुटकी. है कि 70% इथेनॉल के साथ निष्फल है विच्छेदन कैंची का प्रयोग, त्वचा के माध्यम से एक छोटा सा चीरा बनाते हैं. </ Li>
- चीरा के दोनों पक्षों पर त्वचा को पकड़ो और माउस की कपाल - दुम का अक्ष के साथ विपरीत दिशाओं में त्वचा खींच. जब सही ढंग से किया, त्वचा अंतर्निहित शव से निकाल दिया जाएगा.
- अब माउस की गर्दन उजागर मांसपेशियों और ग्रंथियों को दिखाना चाहिए. ध्यान से कि ऊतक में कटौती और यह संदंश का उपयोग कर माउस के पूर्वकाल की ओर खींच, जिससे गला, ट्रेकिआ, माउस की और घुटकी को उजागर. गले नस या मन्या धमनी में कटौती करने से बचें.
- ट्रेकिआ अब दिखाई है और यह चारों ओर कार्टिलेजीनस के छल्ले के साथ ऊतक के रूप में पहचाने जाने योग्य है. नाजुक संदंश के साथ ट्रेकिआ पकड़ और धीरे से उठा और घुटकी है, जो पृष्ठीय पक्ष पर स्थित है से ट्रेकिआ अलग.
- जहां एक ट्रेकिआ लेकिन गला के पीछे रखती है एक छोटा सा चीरा पूर्वकाल. चीरा लगभग 45 ° डिग्री के कोण पर किया जाना चाहिए. इसके अलावा, पूरी तरह से ट्रेकिआ नहीं आड़ा काट नहीं है, के रूप में इस retracting से इसे रोकने जाएगाशरीर गुहा.
- 1 सीसी की तैयारी में टॉम बिल्ली कैथेटर बाँझ पीबीएस के साथ ट्रेकिआ के लुमेन में कैथेटर के साथ फिट सिरिंज भरें. संदंश का उपयोग ट्रेकिआ पकड़ और अपने हाथ से कैथेटर टिप करने के लिए करीब पकड़ नियंत्रण बढ़ाने के लिए और धीरे से सांस की नली चीरा साइट में सम्मिलित है. धीरे ट्रेकिआ में 20 मिमी के बारे में कैथेटर. ट्रेकिआ है कि कैथिटर ट्यूब चारों ओर है, दूसरी ओर मुक्त पकड़.
- 1 एमएल कैथेटर साथ फिट सिरिंज का प्रयोग, धीरे से फेफड़ों में कमरे के तापमान, बाँझ पीबीएस 0.75 एमएल पानी में डालना और फिर धीरे से सिरिंज में पीबीएस वापस महाप्राण (व्यंजन). इस प्रक्रिया को तीन बार दोहराएँ जबकि बाह्य छाती की मालिश. कैथेटर से सिरिंज डिस्कनेक्ट और एक 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में पानी से धोना तरल पदार्थ के बग़ैर. ताजा पीबीएस 0.75 एमएल के साथ सिरिंज को भरने और कैथेटर के लिए सिरिंज पुन: कनेक्ट करने के बाद, प्रत्येक माउस कदम के लिए दो बार 1.9 और 1.10 दोहराएँ. तरल पदार्थ वसूली आंशिक हो, वो से कम प्राप्त कर सकते हैंlume संचार. यदि एक से अधिक माउस से कोशिकाओं को इकट्ठा करने, बर्फ पर काटा कोशिकाओं के साथ 15 एमएल ट्यूब जगह तक सभी फेफड़ों lavages के प्रदर्शन किया गया है.
2. फेफड़े Lavage हार्वेस्ट AMɸ के प्रसंस्करण
- X 250 ग्राम से कम 10 मिनट 4 डिग्री सेल्सियस के लिए फेफड़ों के पानी से धोना द्रव अपकेंद्रित्र
- एक जैव सुरक्षा कैबिनेट के अंदर उचित अपशिष्ट कंटेनर में बाँझ तकनीक का प्रयोग, निथारना सतह पर तैरनेवाला. सेल गोली Resuspend धीरे एक टेस्ट ट्यूब रैक के शीर्ष भर में अपकेंद्रित्र ट्यूब raking के द्वारा. 1 cAMɸ मध्यम एमएल जोड़ें कोशिकाओं resuspend है.
- Isoton द्वितीय मंदक की 10 एमएल में कल्टर काउंटर शीशी में कोशिकाओं के 20 μL pipetting द्वारा एक कल्टर कण काउंटर Z1 का उपयोग कोशिकाओं की परिगणना करने में. जैप oglobin द्वितीय lytic अभिकर्मक की शीशी में 3 से 4 बूँदें जोड़ें, धीरे पलटना 3 से 4 बार और फिर काउंटर पर नमूना शीशी लोड करने के लिए एक सेल एकाग्रता प्राप्त. 2 10 एक्स 4 के कमजोर पड़ने कारक के साथ काउंटर कार्यक्रम प्रदर्शित करने के लिए सुनिश्चित करेंएमएल प्रति कोशिकाओं की संख्या के रूप में सेल एकाग्रता.
- X 2.5 5 एमएल प्रति 10 कोशिकाओं पतला cAMɸ माध्यम का उपयोग.
- 2 x 2.5 10 5/6 अच्छी तरह से एक ऊतक संस्कृति पकवान की हर अच्छी तरह से में कोशिकाओं एमएल एमएल बांटना.
- AMɸ, एक 37 डिग्री सेल्सियस humidified इनक्यूबेटर अंदर सेते हैं संस्कृति व्यंजन के लिए 6 घंटे के लिए एक 5% सीओ 2 के वातावरण के साथ समृद्ध कोशिकाओं को अच्छी तरह से नीचे का पालन करने की अनुमति. धीरे सतह पर तैरनेवाला के रूप में पक्षपाती कोशिकाओं को बाधित नहीं करने के लिए महाप्राण (व्यंजन).
- बाँझ पीबीएस (कैल्शियम और मुक्त मैग्नीशियम) का उपयोग करने के लिए गैर पक्षपाती कोशिकाओं और मलबे को हटाने के कुओं कुल्ला. प्रत्येक अच्छी तरह से cAMɸ मध्यम की 2 एमएल जोड़ें.
- एक 5% सीओ 2 के वातावरण के साथ एक 37 डिग्री सेल्सियस humidified इनक्यूबेटर अंदर रातोंरात कोशिकाओं में उत्तेजक के अलावा पूर्व सेते हैं. इस संवर्धन कदम के बाद, लगभग कोशिकाओं के 87% को बृहतभक्षककोशिका मार्करों CD11b और F4/80 (चित्रा -2 सी) के लिए सकारात्मक रहे हैं.
3. Polyanhydrid के जोड़नेई नैनोकणों और नियंत्रण उपचार
- बनाना विरोधी विलायक polyanhydride के 15 nanoencapsulation के माध्यम से नैनोकणों. इस प्रक्रिया में, बहुलक क्लोराइड में भंग कर रहा है (4 ° सी 25 मिलीग्राम / एमएल की एकाग्रता में) और pentane (-20 डिग्री अनुपात 1:200 क्लोराइड सी: पैंटेन के) में उपजी.
- Polyanhydride निष्फल एक संतुलन है कि सही माइक्रोग्राम मात्रा उपाय कर सकते हैं पर कागज वजन का उपयोग नैनोकणों वजन. एक 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब कणों जोड़ें.
- बर्फ cAMɸ ठंड में नैनोकणों Resuspend. गणना ऐसी है कि मध्यम के प्रत्येक अच्छी तरह से अधिक नहीं की तुलना में 0.3 एमएल नैनोकणों के वांछित एकाग्रता प्राप्त करने के लिए जोड़ा जाता है बना रहे हैं. बर्फ पर resuspended कणों तक नैनोकणों संस्कृति के लिए जोड़ रहे हैं और अच्छी तरह से रखें.
- पहले नैनोकणों AMɸ संस्कृतियों को जोड़ने के लिए, एक microtip साथ एक बेंच शीर्ष sonicator कणों का उपयोग sonicate. 70% इथेनॉल और wipin के साथ छिड़काव द्वारा microtip जीवाणुरहितsonication के लिए एक बाँझ पूर्व Kimwipe साथ जी. 30 से 45 के लिए 10-20 joules पर Sonicate जबकि बर्फ पर ट्यूब रखने. Macroscopically nanoparticle के निलंबन का निरीक्षण करते हैं. यदि कण पर्याप्त नहीं बिखरे हैं, की अनुमति निलंबन बर्फ पर 1 से 2 मिनट के लिए सेट करने के लिए सुनिश्चित करना है कि नैनोकणों 30 से 45 सेकंड के लिए फिर से sonicating पहले बहुलक का गिलास संक्रमण तापमान नीचे हैं. इस sonication कदम के इरादे के लिए पर्याप्त रूप से नैनोकणों 50:50 CPTEG के रूप में फैलाने के लिए है: CPH नैनोकणों कुल के लिए करते है जब एक जलीय वातावरण से अवगत कराया. हालांकि, नैनोकणों के कुछ छोटे समुच्चय अभी भी निलंबन में रह सकती है.
- Nanoparticle निलंबन पर्याप्त रूप से छितरी बर्फ पर रखा जाना चाहिए और तुरंत इस्तेमाल किया जा करने के लिए समय से पहले सतह कटाव या एकत्रीकरण को रोकने के.
- संस्कृति इनक्यूबेटर से AMɸ और जैव सुरक्षा कैबिनेट में जगह युक्त बर्तन निकालें. लगभग एक 45 डिग्री के कोण और दवा की राशि बंद विंदुक पर ज़ोर प्लेटउम है कि nanoparticle के निलंबन (0.3 एमएल से अधिक नहीं होनी चाहिए) में जोड़ा जाएगा. परेशान जब मध्यम हटाने नहीं पक्षपाती कोशिकाओं.
- भंवर polyanhydride nanoparticle के पूर्व यह उचित कुओं को जोड़ने के लिए संक्षिप्त निलंबन. विशिष्ट अच्छी तरह से () में nanoparticle निलंबन (अधिक नहीं की तुलना में 0.3 एमएल) की राशि पिपेट, तथापि, नहीं विंदुक और नीचे मिश्रण करने के लिए. यह कार्रवाई पक्षपाती अच्छी तरह से अलग AMɸ सकता. कणों को अच्छी तरह से नीचे के लिए व्यवस्थित करने और कोशिकाओं से संपर्क करेंगे. इस रिपोर्ट में उल्लिखित अध्ययन के लिए, नैनोकणों के अंतिम एकाग्रता AMɸ साथ सह - सुसंस्कृत 125 / μg एमएल था. बाद में कुओं और वांछित उपचार समूहों के साथ आगे बढ़ें. केवल मध्यम और 200 एनजी / एमएल (LPS) lipopolysaccharide के नामित कुओं के रूप में सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण समूहों, शामिल हैं.
- 37 के लिए संस्कृति व्यंजन लौटें डिग्री सेल्सियस 48 ज के लिए एक 5% सीओ 2 के वातावरण के साथ इनक्यूबेटर humidified. हमारे laborator में काइनेटिक पढ़ाईवाई दोनों सेल सतह मार्कर अभिव्यक्ति और cytokine स्राव मूल्यांकन के रूप में यह प्रतिलेखन और प्रोटीन संश्लेषण के लिए होते हैं के लिए पर्याप्त समय परमिट के लिए इष्टतम संस्कृति अवधि के लिए 48 घंटे का प्रदर्शन किया है. हालांकि साइटोकिन्स का अधिक से अधिक स्तर पर एक विस्तारित संस्कृति (यानी, 72 घंटा) की अवधि के दौरान जमा है, इस समय बिंदु पर सेल सतह मार्कर अभिव्यक्ति का मूल्यांकन साइटोकिन्स का ऊंचा स्तर के योगदान से चकित किया जा सकता है. सतह मार्कर अभिव्यक्ति में परिवर्तन मनाया सीधे नैनोकणों के साथ खुद को उत्तेजना के कारण नहीं हो सकता है.
4. AMɸ फ्लो का उपयोग सक्रियकरण का मूल्यांकन
- प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS) बफर (0.1% सोडियम के azide और 0.1% गोजातीय सीरम albumin (BSA)) 0.1 एम फॉस्फेट खारा बफर से पूर्व मढ़वाया मैक्रोफेज किया गया है कि नैनोकणों ओ के साथ सह सुसंस्कृत कटाई करने के लिए (7.4 पीएच) तैयारआर उत्तेजक.
- अवरुद्ध बफर और मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के समाधान काम तैयार करें. ब्लॉक बफर तैयार करने के लिए, चूहा (सिग्मा) आईजीजी और anti-CD16/32 (eBioscience) 1 मिलीग्राम / एमएल और 10 μg / एमएल पतला, क्रमशः FACS बफर में. या तो निर्माता की सिफारिश की एकाग्रता या उपयोगकर्ता अनुकूलित एकाग्रता FACS बफर में सतह मार्कर एंटीबॉडी पैनल पतला. इस काम में प्रस्तुत परिणामों के लिए, सतह मार्कर पैनल MHC द्वितीय, CD86, CD40 और cire (CD209) के खिलाफ एंटीबॉडी के होते हैं. बृहतभक्षककोशिका F4/80 मार्करों और CD11b के खिलाफ विरोधी माउस एंटीबॉडी भी पैनल में शामिल हैं सकारात्मक डेटा विश्लेषण के दौरान बृहतभक्षककोशिका phenotype की पहचान. केयर जब MHC द्वितीय अणुओं के खिलाफ एंटीबॉडी का चयन, के रूप में जन्मजात माउस उपभेदों अक्सर उनके MHC द्वितीय haplotypes में अलग रखा जाना चाहिए. चयनित एंटीबॉडी विशिष्ट MHC ब्याज की अपने माउस तनाव के द्वारा व्यक्त alloantigens साथ प्रतिक्रिया चाहिए.
- नैनोकणों के साथ ऊष्मायन के 48 घंटे और / या के बादउत्तेजक, 20 मिनट के लिए बर्फ पर जगह सेल संस्कृति व्यंजन. प्लेटों से पक्षपाती मैक्रोफेज को दूर करने के लिए, धीरे से एक 24 सेमी सेल खुरचनी के साथ कुओं परिमार्जन.
- 5 एमएल सीरम वैज्ञानिक विंदुक का प्रयोग, धीरे कोशिकाओं और मध्यम महाप्राण (व्यंजन) ऊपर और नीचे पांच बार के लिए एक एकल कोशिका निलंबन उत्पन्न. विंदुक अलग 5 एमएल polystyrene ट्यूबों में अलग - अलग कुओं की सामग्री इतनी के रूप में मिश्रण करने के लिए नहीं एक साथ विभिन्न प्रयोगात्मक उपचार से कोशिकाओं.
- प्रत्येक ट्यूब FACS बफर के 2 एमएल जोड़ें.
- X 250 जी में कक्षों की ट्यूब 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र.
- सतह पर तैरनेवाला छानना और धीरे resuspend सेल गोली एक टेस्ट ट्यूब रैक के शीर्ष भर में ट्यूबों raking के द्वारा अवशिष्ट तरल पदार्थ में.
- आदेश में मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के गैर विशिष्ट बंधन को रोकने के लिए, कक्षों की प्रत्येक ट्यूब अवरुद्ध बफर के 10 μL (4.2 में) तैयार जोड़ें. भंवर ट्यूब और 30 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं.
- प्रत्येक ट्यूब और incub के पतला मोनोक्लोनल एंटीबॉडी की उचित मात्रा जोड़ें15 मिनट के लिए बर्फ पर अंधेरे में खा लिया. ट्यूब है कि नमूनों को रोकने के लिए विश्लेषण किया जा polycromatic पैनल (एंटीबॉडी के संयोजन के पिछले अनुकूलन व्यक्तिगत प्रयोगशालाओं द्वारा किया जाना चाहिए) के एंटीबॉडी के संयोजन को प्राप्त करना चाहिए. अतिरिक्त नियंत्रण समूहों को सही ढंग से अधिग्रहण मापदंडों पर प्रवाह cytometer कोशिकाओं है कि लेबल नहीं किया गया है की एक ट्यूब सहित, और मुआवजा ट्यूबों कि प्रत्येक एकल रंग अलग लेबल का उपयोग कर कक्षों के अनुरूप निर्धारित करने के लिए शामिल किया जाना चाहिए. सही ढंग से प्रवाह cytometric विश्लेषण के लिए द्वार सेट, प्रतिदीप्ति ऋण एक (FMO) नियंत्रण अधिग्रहण के दौरान शामिल किया जाना चाहिए. FMO नियंत्रण सभी fluorochrome संयुग्मित एंटीबॉडी कि पैनल पर एक है कि अपने संबंधित निर्धारण नियंत्रण द्वारा प्रतिस्थापित किया गया है के अलावा उपयोग किया जाता है के साथ लेबल की कोशिकाओं रहे हैं. सकारात्मक और नकारात्मक आबादी (यानी, एक सकारात्मक नियंत्रण उत्तेजक और मध्यम अकेला के साथ इलाज किया कोशिकाओं की अलग aliquots) भी FMO मुआवजा और नियंत्रण ट्यूबों में शामिल किया जाना चाहिए.
- छानना सतह पर तैरनेवाला और resuspend सेल गोली एक टेस्ट ट्यूब रैक के शीर्ष भर में ट्यूबों raking के द्वारा अवशिष्ट तरल पदार्थ में.
- यदि एक सीधे एक fluorochrome के लिए नहीं संयुग्मित एंटीबॉडी के एंटीबॉडी पैनल होते हैं लेकिन बजाय बायोटिन संयुग्मित है, streptavidin fluorochrome संयुग्मित सतह मार्कर कल्पना की जरूरत है. इस चरण में, पतला fluorochrome संयुग्मित streptavidin के एक उचित मात्रा जोड़ने और बर्फ पर 15 मिनट के लिए अंधेरे में सेते हैं. 4.2 में के रूप में, streptavidin एक निर्माता से सिफारिश की एकाग्रता के लिए या उपयोगकर्ता द्वारा अनुकूलित करने के लिए पतला हो जाएगा. यह कदम केवल biotinylated प्राथमिक एंटीबॉडी युक्त पैनल के लिए की जरूरत है.
- एक धोने के रूप में 4.10 में वर्णित कदम प्रदर्शन करना.
- बी.डी. विआयनीकृत पानी में लगानेवाला 01:03 स्थिर का एक उचित मात्रा पतला. प्रत्येक ट्यूब पतला लगानेवाला के 100 μL जोड़ें जबकि धीरे वोकोशिकाओं के रोकने rtexing. लेबल और तय कोशिकाओं stably 4 में किया जा सकता है अंधेरे में संग्रहीत डिग्री सेल्सियस लगभग एक प्रवाह cytometer पर अधिग्रहण से पहले सप्ताह के लिए.
5. प्रतिनिधि डेटा
3.1 कदम में गढ़े नैनोकणों 163 के एक औसत व्यास ± 24 एनएम और आकारिकी कि पिछले 5,16 अध्ययन में प्राप्त के साथ संगत था. Sonication के लिए की जरूरत है प्रदर्शित करने के लिए कणों के पर्याप्त प्रसार सुनिश्चित करने के पहले और बाद sonication समाधान में नैनोकणों चित्र 1 में दिखाया जाता है. प्रवाह तो काटा फेफड़ों के पानी से धोना के माध्यम से प्राप्त AMɸs के की cytometric विश्लेषण चित्रा 2 में दिखाया गया है. विरोधी माउस CD11b और विरोधी माउस F4/80 एंटीबॉडी के रूप में अच्छी तरह के रूप में इसी FMO नियंत्रण का एक संयोजन के साथ कोशिकाओं लेबल पृष्ठभूमि लेबलिंग की स्थापना के लिए अनुमति देता है, आगे के विश्लेषण के लिए और AMɸs gating की पहचान. Polyanhydride साथ वायुकोशीय मैक्रोफेज का उपचारनैनोकणों के सक्रियण को बढ़ाता है के रूप में वृद्धि MHC द्वितीय, CD40, CD86, और cire (चित्रा 3) का मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता से दिखाया गया है.
. चित्रा 1 50:50 CPTEG: CPH से पहले (एक) और (ख) sonication के पास 30 के बाद नैनोकणों.
चित्रा 2. फ्लो काटा वायुकोशीय (ए) एलेक्सा 700 Fluor विरोधी CD11b और पीई Cy7 FMO नियंत्रण, (बी) एलेक्सा Fluor 700 FMO नियंत्रण और पीई Cy7 anti-F4/80 के साथ लेबल मैक्रोफेज cytometric विश्लेषण और (सी एलेक्सा 700) Fluor विरोधी CD11b और anti-F4/80 पीई Cy7. ऊपरी दाएँ कोने में संख्या डबल पॉजिटिव कोशिकाओं के प्रतिशत का प्रतिनिधित्व करता है.
चित्रा 3 Histograms प्रतिदीप्ति इरादे में वृद्धि का प्रदर्शन.MHC-II (क), (बी) CD40, CD86 (सी) और cire (डी) के सह 50:50 CPTEG साथ वायुकोशीय मैक्रोफेज की संस्कृति के बाद सतह अभिव्यक्ति के लिए की sity: CPH polyanhydride 48 घंटा के लिए नैनोकणों. Histograms AMɸ के परिणाम FMO नियंत्रण के रूप में चिह्नित को दर्शाती ( 
), अनुपचारित AMɸ सभी सेल सतह मार्कर के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ लेबल ( 
) और AMɸ नैनोकणों के साथ सुसंस्कृत और सभी सेल सतह मार्कर के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ लेबल ( 
).
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Discussion
Polyanhydride nanoparticle टीका प्लेटफार्मों प्रभावकारिता दिखाया है, जब एकल खुराक 5 regimens में intranasally प्रशासित. इस वैक्सीन वितरण मंच द्वारा प्रेरित फेफड़ों के में निवासी phagocytic सेल आबादी के सक्रियण मापने अपने संभावित क्षमता का मूल्यांकन अंततः अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को बढ़ावा देने के लिए परमिट.
विशेष रूप से, फेफड़ों के पानी से धोना तरल पदार्थ से वायुकोशीय मैक्रोफेज कटाई और उन्हें नैनोकणों के विभिन्न योगों के साथ इलाज अलग कण chemistries की क्षमताओं में अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए मैक्रोफेज सक्रिय, प्रतिजन 6,8 प्रस्तुति के लिए अग्रणी. इसके अलावा, इन विट्रो अध्ययन में इन इन कण सहायक योगों की क्षमता का आकलन करने के वायुकोशीय मैक्रोफेज बड़ा और vivo अध्ययन में और अधिक जटिल पर तैयार करने के लिए पहले सक्रिय करने के लिए उपयोगी होते हैं. प्रयोगों को हमेशा surfac के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण उपचार को शामिल करना चाहिएई ऊपर विनियमन LPS, टोल की तरह 4 रिसेप्टर agonist के रूप में मार्कर,. देखभाल प्रयोगों से पहले की योजना बना में वायुकोशीय मैक्रोफेज कटाई इस प्रोटोकॉल के रूप में एक प्रयोग में एकाधिक उपचार के लिए आवश्यक कोशिकाओं की पर्याप्त संख्या नहीं उत्पादन हो सकता है लिया जाना चाहिए. फेफड़े lavages इसलिए कई चूहों पर प्रदर्शन किया जा अधिक उपचार समूहों के साथ बड़े प्रयोगों के लिए पर्याप्त सेल नंबर (~ 5.0 x 10 5 माउस प्रति कोशिकाओं) को सुनिश्चित करने की आवश्यकता हो सकती है. फेफड़ों के पानी से धोना तकनीक भी अन्य प्रजातियों के लिए सूचित कर दिया गया है, और उपयोग तरल पदार्थ की मात्रा अध्ययन किया जा रहा है (यानी, माउस फेफड़ों की क्षमता 1 एमएल है प्रजातियों के लिए आनुपातिक है, चूहा फेफड़ों की क्षमता 10 एमएल और मानव फेफड़ों की क्षमता 6 17 एल है.
Polyanhydride नैनोकणों तैयार कर रहे हैं और एक सूखे पाउडर के रूप में संग्रहीत करने के लिए समय से पहले सतह कटाव को रोकने के. क्योंकि स्थिर बातचीत है कि कणों के कणों का जैसे जीवाणुओं का पिण्ड के रूप में एकत्रित हो जाना में परिणाम, सेल संस्कृतियों के अलावा sonication से पहले आवश्यक है. यह हैसमान वितरण के लिए चरण की अनुमति देता है और अधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणामों के लिए होता है. वायुकोशीय प्रवाह cytometry का उपयोग मैक्रोफेज पर सेल सतह मार्कर की मात्रा का ठहराव मजबूत autofluorescence संकेतों से जटिल है. FACS प्रतिरक्षी सांद्रता, बहुरंगा fluorochrome संयोजन, और प्रवाह cytometry पर कब्जा पैरामीटर (यानी, मुआवजा नियंत्रण का उपयोग) के अनुकूलन के द्वारा इस बाधा को दूर किया जा सकता है. FMO नियंत्रण एक फ्लोरोसेंट पैरामीटर के परिवर्तन की अनुमति है एक समय में, प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए द्वार स्थापित करने के लिए उपयोगी होते हैं और कोशिका की सतह मार्कर अभिव्यक्ति की सही मात्रा का ठहराव के लिए सक्षम है. चूहों के उपभेदों में मतभेद भी एंटीबॉडी, विशेष रूप से MHC द्वितीय के haplotype विशिष्टता के चयन में माना जाना चाहिए.
यह महत्वपूर्ण है के लिए मानकीकृत तरीके हैं फेफड़ों में प्रतिजन कोशिकाओं की सक्रियता निर्धारित करने के लिए, के रूप में यह बहुत उपन्यास biomaterials के विभिन्न प्रयोगशालाओं और संस्थाओं के बीच तुलना की सुविधा होगी. जनरलयहाँ प्रस्तुत तरीकों के माध्यम से वायुकोशीय मैक्रोफेज के अनुरूप आबादी erating, उपयोगी नैनोकणों के विभिन्न योगों और उनकी प्रतिरक्षा बढ़ाने की क्षमता के बारे में डेटा प्राप्त करने के लिए इष्टतम स्थितियों प्रदान करते हैं.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
लेखकों के लिए वित्तीय समर्थन और डा. शॉन Rigby के लिए आयोवा स्टेट यूनिवर्सिटी फ्लो सुविधा से अमेरिकी सेना चिकित्सा अनुसंधान और materiel कमान (अनुदान नंबर W81XWH-09-1-+०,३८६ और W81XWH-10-1-+०,८०६) धन्यवाद करना चाहते हैं उसके विशेषज्ञ तकनीकी सहायता.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cAM Media | |||
| DMEM | Cellgro | 15-013-CV | |
| 50 mM 2-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M3148-25ML | |
| Penicillin/Streptomycin 10,000 μg/ mL Solution | Cellgro | 30-002-CI | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| FACS Buffer | |||
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S671-500 | |
| Sodium phosphate | Fisher Scientific | MK7868500 | |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P217500 | |
| Potassium phosphate | Fisher Scientific | P288-200 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma-Aldrich | A7888 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Antibodies | |||
| Rat IgG | Sigma-Aldrich | I4341 | |
| Anti-Ms CD16/32 | eBioscience | 16-0161 | |
| Anti-Ms MHC II haplotype I-A/I-E, clone M5/114.15.2, conjugated to fluorescein isothiocyanate (FITC) | eBioscience | 11-5321 | |
| Anti-mouse CD86, clone GL-1, conjugated to allophycocyanin (APC)-Cy7 | Biolegend | 105030 | |
| Anti-mouse CD40, clone 1C10, conjugated to APC | eBioscience | 17-0401 | |
| Anti-mouse CD209, clone 5H10, conjugated to Biotin | eBioscience | 13-2091 | |
| Anti-mouse CD11b, clone M1/70, conjugated to Alexa Fluor 700 | eBioscience | 56-0112 | |
| Anti-mouse F4/80, clone BM8, conjugated to phyc–rythrin (PE)-Cy7 | eBioscience | 25-4801 | |
| PE-Texas red conjugated Streptavidin | BD Biosciences | 551487 | |
| Other Supplies and Reagents | |||
| Ethanol | Fisher Scientific | A405-20 | Used as 70% (v/v) |
| Compressed CO2 | Linweld | 16000060 | |
| 1 mL Syringe | BD Biosciences | 309659 | |
| Sovereign 3 ½" Fr Tom Catcatheter | Kendall | 703021 | |
| Biosafety Cabinet | NUAIRE | Series 22 | |
| Dissection Scissors | Fisher Scientific | 138082 | |
| Forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-8254 | |
| PBS, 1X without calcium and magnesium | Cellgro | 21-040-CM | |
| 15 mL Centrifuge Tubes with Screw Cap | VWR international | 21008-216 | |
| Six-well Tissue Culture Treated Plates | Costar | 3516 | |
| Plastic Tube Racks | Nalge Nunc international | 5970 | |
| Cell Scraper 24 cm | Techno Plastic Products | 99002 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube | Falcon BD | 352008 | |
| Pipet-aid XL | Drummond Scientific | 4-000-105 | |
| 10, 5, and 2 mL Pipettes | Fisher Scientific | 13-675 | |
| 200 and 10 μL micropipettors | Gilson Pipetman | F123601 | |
| 200 and 10 μL pipette tips | Fisher Scientific | 02-707 | |
| BD Stabilizing Fixative | BD Biosciences | 338036 | |
| Isoton II Diluent | Beckman Coulter Inc. | 8546719 | |
| Zap-oglobin II Lytic Reagent | Beckman Coulter Inc. | 7546138 | |
| Coulter Counter Polystyrene Vials | Beckman Coulter Inc. | 14310-684 | |
| Test Tubes | BD Biosciences | 352008 | |
| Equipment | |||
| Refrigerated Centrifuge | Labnet International | 50075040 | |
| Humidified Incubator CO2 | Nuaire | Model Autoflow 8500 | |
| FACSCanto Flow Cytometer | BD Biosciences | 338960 | |
| Coulter Particle Counter Z1 | Beckman Coulter Inc. | WS-Z1DUALPC | |
| Sonicator Liquid Processing Equipment with Microtip | Misonix | Model No. S-4000 | |
References
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