Summary
Heri, beskriver vi protokoller til høstning murine alveolære makrofager, som er beliggende medfødte immunsystem-celler i lungen, og undersøge deres aktivering som reaktion på samdyrkning med polyanhydrid nanopartikler.
Abstract
Bionedbrydelige nanopartikler er opstået som en alsidig platform for design og implementering af nye intranasale vacciner mod respiratoriske smitsomme sygdomme. Specifikt polyanhydrid nanopartikler bestående af alifatiske sebacinsyre (SA), den aromatiske 1,6-bis (p-carboxyphenoxy) hexan (CPH) eller amfifile 1,8-bis (p-carboxyphenoxy) -3,6-dioxaoctan (CPTEG) udviser enestående bulk overflade nedbrydningskinetik 1,2 og kan udnyttes til langsomt at frigive funktionelle biomolekyler (f.eks proteinantigener, immunoglobuliner, etc.) in vivo 3,4,5. Disse nanopartikler har også iboende adjuvansaktivitet, hvilket gør dem til et glimrende valg for en vaccine leveringsplatform 6,7,8.
For at belyse de mekanismer, der styrer aktiveringen af medfødte immunitet efter intranasal slimhinde vaccination, skal man vurdere de molekylære og cellulære reaktioner antigenet presenting celler (APC'er) er ansvarlige for initiering immunresponser. Dendritiske celler er de vigtigste APC'erne findes i ledende luftveje, mens alveolære makrofager (AMɸ) dominerer i lungeparenkymet 9,10,11. AMɸ er meget effektive til at rense lungerne af mikrobielle patogener og celledebris 12,13. Hertil kommer, spiller denne celletype en værdifuld rolle i forbindelse med transport af mikrobielle antigener til de drænende lymfeknuder, hvilket er et vigtigt første skridt i iværksættelsen af et adaptivt immunrespons 9. AMɸ udtrykker også forhøjede niveauer af medfødte mønstergenkendelse og scavenger-receptorer, udskiller pro-inflammatoriske mediatorer, og prime naive T-celler 12,14. En relativt ren population af AMɸ (fx større end 80%) kan let opnås via lungeudskylning til undersøgelse i laboratoriet. Hjemmehørende AMɸ høstet fra immunkompetente dyr giver en repræsentativ fænotype af de makrofager, der encounter partikel-baseret vaccine in vivo. Heri, beskriver vi de protokoller, der anvendes til høst og kulturen AMɸ fra mus og undersøge aktivering fænotypen af makrofager efter behandling med polyanhydrid nanopartikler in vitro.
Protocol
1. Høst alveolære makrofager (AMɸ) fra mus ved hjælp af lungeudskylning
- Bær passende personlige værnemidler (PPE), såsom en laboratoriekittel, engangshandsker og passende øjenbeskyttelse.
- Forbered komplet AMɸ (cAMɸ) medium inden påbegyndelse af høst. Tilsættes 2,5 ml penicillin / streptomycin (pen / strep) opløsning, 250 pi β-mercaptoethanol (2-mercaptoethanol), og 25 ml varmeinaktiveret føtalt bovint serum (FBS) til 222,25 ml Dulbelcco s Modified Eagle Medium (DMEM). Filter-sterilisere cAMɸ medium ved anvendelse af en 0,2 um porestørrelse flasketoppen filter under vakuum.
- Afliv en sund musen ved CO 2 kvælning i en euthanization kammer. Selv om en C57BL / 6 mus (6-8 uger gamle) blev anvendt i forbindelse med dette projekt, kan denne lungeudskylning teknik udføres på en stamme af mus. Ved anvendelse af en komprimeret gas cylinder, så gasstrømmen ind i kammeret i 1 minut forud for anbringelse af mus i CHravgul at sikre, at kammeret er fuldt opladet med CO2. Den placeres i kammeret i mindst et minut til aflive musen. Derudover exsanguinate hver mus via hjertepunktur som en fysisk metode for at bekræfte muse død som beskrevet i 1.4.
- Læg musen på ryggen (dorsale side), spray med 70% ethanol, find brystbenet, og i en 30 graders vinkel fra maven, en 23 gauge nål (knyttet til en 1 ml sprøjte) indsætte omkring 50 mm ind i brysthulen . Med korrekt placering af nålen, bør det være muligt at indsamle mellem 0,4 til 1 ml blod afhængigt af størrelsen af musen. Undersøg dyret for ophør af vitale tegn.
- Sted mus på laboratoriebordet således at den ligger på sin abdomen (ventrale side). Spray mus med 70% ethanol for at sterilisere arbejdsmiljøet. Klem huden omkring halvvejs ned ad ryggen af musen. Ved hjælp af dissektion saks, der er blevet steriliseret med 70% ethanol, lave et lille snit gennem huden. </ Li>
- Fat på huden på begge sider af snittet og trække huden i modsatte retninger langs den kraniale-caudale akse mus. Når det gøres korrekt, vil huden blive fjernet fra den underliggende slagtekroppen.
- Halsen af muse bør nu vise udsættes muskler og kirtler. Forsigtigt skåret at vævs-og trække det mod det forreste af mus med pincet og derved udsætte strubehoved, trachea, og spiserøret af musen. Undgå at skære den jugulare vene eller carotidarterie.
- Luftrøret er nu synlig og kan identificeres som væv med bruskagtige ringe omkring den. Fint holde luftrøret med pincet og forsigtigt løfte og adskille trachea fra spiserøret, som er placeret på den dorsale side.
- Lav et lille snit anterior, hvor man holder luftrøret, men posteriort for strubehovedet. Snittet skal foretages ved ca 45 ° graders vinkel. Heller ikke helt transekt luftrøret, da dette vil forhindre den i at trække indkropskaviteten.
- Fyld en 1 ml sprøjte forsynet med en Tom Cat kateter med sterilt PBS i præparatet for at indsætte kateteret ind i lumen af trachea. Hold luftrøret med pincet og med din hånd holder kateteret tæt på spidsen for at øge kontrol og forsigtigt indsætte det i tracheal incisionssted. Forsigtigt indsætte kateteret i trachea omkring 20 mm. Gribe luftrøret, der er omkring kateterrøret, hvilket frigør den anden side.
- Anvendelse af en 1 ml sprøjte forsynet med kateteret, forsigtigt tilføre 0,75 ml stuetemperatur sterilt PBS i lungerne og derefter forsigtigt aspirér PBS tilbage i sprøjten. Gentag denne proces tre gange, mens eksternt masserer brystet. Afbryde sprøjten fra kateteret og dispensere udskylningsvæske til en 15 ml centrifugerør. Efter fyldning af sprøjten med 0,75 ml frisk PBS og gentilkobling sprøjten til kateteret, gentages trinene 1,9 og 1,10 gange for hver mus. Væske helbredelse kan være delvis, at opnå mindre end VoLume infunderet. Hvis opsamling af celler fra mere end en mus, anbringes 15 ml rør med de høstede celler på is, indtil alle lunge udskylninger er blevet udført.
2. Behandling af lungeudskylning AMɸ Harvest
- Centrifuger lungeudskylning fluidum ved 250 x g i 10 minutter ved 4 ° C.
- Med steril teknik, dekanter supernatanten i passende affaldsbeholder i et biosikkerhed kabinet. Resuspender cellepelleten ved forsigtigt at rive centrifugeglasset over toppen af en reagensglasstativ. Tilsæt 1 ml cAMɸ medium for at resuspendere cellerne.
- Optælle cellerne under anvendelse af en Coulter partikeltæller Z1 ved pipettering 20 pi celler i 10 ml Isoton II fortyndingsmiddel Coulter-tæller hætteglas. Tilføj 3 til 4 dråber Zap-oglobin II lytisk reagens i hætteglasset, Vend forsigtigt 3 til 4 gange og derefter indlæse prøvehætteglas på tælleren for at opnå en celle koncentration. Vær sikker på at programmere tælleren med en fortyndingsfaktor på 2 x 10 4 for at visecellekoncentration som antallet af celler pr ml.
- Fortyndes cellerne til 2,5 x 10 5 per ml med cAMɸ medium.
- Dispensere 2 ml 2,5 x 10 5 celler / ml i hver brønd af en 6-brønds vævskulturskål.
- For at berige for AMɸ, inkuberes dyrkningsskåle inde i et 37 ° C befugtet inkubator med en 5% CO2-atmosfære i 6 timer for at tillade cellerne at adhærere til bunden af brønden. Forsigtigt aspireres supernatanten til ikke forstyrre adhærente celler.
- Skylle brøndene med sterilt PBS (calcium-og magnesium-fri) for at fjerne ikke-adhærerende celler og debris. Tilsæt 2 ml cAMɸ medium til hver brønd.
- Cellerne inkuberes natten over i en 37 ° C befugtet inkubator med 5% CO2-atmosfære forud for tilsætning af stimulanser. Efter denne tilsætning trin er omkring 87% af cellerne positive for makrofagen markører CD11b og F4/80 (figur 2c).
3. Tilsætning af Polyanhydride Nanopartikler og kontrol Behandlinger
- Fabrikere nanopartikler via polyanhydrid anti-opløsningsmiddel nanoencapsulation 15. I denne proces opløses polymeren i methylenchlorid (4 ° C ved en koncentration på 25 mg / ml) og udfældes i pentan (-20 ° C i et forhold 1:200 methylenchlorid: pentan).
- Afvej polyanhydrid nanopartikler ved hjælp af steriliseret vejer papir på en balance, der nøjagtigt kan måle mikrogram beløb. Tilsættes partikler til et 1,5 ml mikrocentrifugerør.
- Resuspender nanopartikler i iskold cAMɸ. Beregningerne foretages således, at ikke mere end 0,3 ml medium sættes til hver brønd for at opnå den ønskede koncentration af nanopartikler. Holde de resuspenderede partikler på is indtil nanopartikler tilsættes til kulturen brønd.
- Før tilsætning af nanopartikler til AMɸ kulturer, sonikeres partikler ved anvendelse af en bænktop sonikator med en mikrospids. Steriliseres mikrospids ved sprøjtning med 70% ethanol og wiping med en steril Kimwipe før sonikering. Sonikeres ved 10-20 joule i 30 til 45 s, samtidig med at røret på is. Overhold nanopartikel suspension makroskopisk. Hvis partiklerne ikke er tilstrækkeligt dispergeret, kan suspensionen indstilles på is i 1 til 2 minutter for at sikre, at nanopartikler er under glasovergangstemperaturen af polymeren før sonikering igen i 30 til 45 sek. Hensigten med denne lydbehandlingstrin er tilstrækkeligt dispergere nanopartiklerne, som 50:50 CPTEG: CPH nanopartikler har tendens til at aggregere, når det udsættes for et vandigt miljø. Imidlertid kan nogle små aggregater af nanopartikler stadig i suspensionen.
- Nanopartikel suspension (tilstrækkeligt spredt) bør holdes på is og anvendes umiddelbart til at forhindre for tidlig overfladeerosion eller sammenlægning.
- Fjern dyrkningsskålene indeholder AMɸ fra inkubatoren og plads i biosikkerhed kabinettet. Presenning plade ved omtrent en 45 graders vinkel og pipetten fra mængden af medium, der tilføjes til nanopartikel suspensionen (det bør ikke overstige 0,3 ml). Må ikke forstyrre de adhærerende celler, når du fjerner mediet.
- Vortex polyanhydridet nanopartikel suspension kort før tilføje det til de relevante brønde. Pipettere mængden af nanopartikel suspension (ikke mere end 0,3 ml) til de særlige brønd (s), men ikke pipetteres op og ned for at blande. Denne handling kan frigøre klæbende AMɸ fra brønden. Partiklerne vil sedimentere til bunden af brønden og i kontakt med cellerne. For de forsøg, der er skitseret i denne rapport, blev den endelige koncentration af nanopartikler co-dyrket med AMɸ 125 ug / ml. Fortsæt med efterfølgende brønde og ønskede behandling grupper. Indbefatter positive og negative kontrolgrupper, såsom medium alene og 200 ng / ml lipopolysaccharid (LPS) til udpegede brønde.
- Returnere dyrkningsskålene til 37 ° C befugtet inkubator med en 5% CO2-atmosfære i 48 timer. Kinetiske undersøgelser i vores laboratory har vist 48 timer for at være den optimale dyrkningsperioden til evaluering både celle-overflademarkør ekspression og cytokinsekretion den tillader tilstrækkelig tid til transkription og proteinsyntese at forekomme. Skønt højere niveauer af cytokiner akkumulerer i en forlænget dyrkning periode (dvs. 72 timer) kan evaluere celleoverflademarkør ekspression på dette tidspunkt være forstyrret af bidraget fra de forhøjede niveauer af cytokiner. De ændringer i overfladen markør udtryk konstateret, kan ikke være direkte kan henføres til stimulation med nanopartikler selv.
4. Evaluering AMɸ Aktivering anvendelse af flowcytometri
- Fremstille fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS)-buffer (0,1% natriumazid og 0,1% bovint serumalbumin (BSA)) i 0,1 M phosphatbufret saltvand (pH 7,4) forud for høst af udpladede makrofager, der er blevet co-dyrket med nanopartikler or stimulanser.
- Forbered opløsninger af blokerende puffer og de monoklonale antistoffer. Til fremstilling af blokken buffer, fortyndes rotte IgG (Sigma) og anti-CD16/32 (eBioscience) til 1 mg / ml og 10 ug / mL i FACS buffer. Fortynd overflademarkør antistof panel i FACS-buffer til enten af fabrikanten anbefalede koncentration eller brugeren optimerede koncentration. For resultaterne i dette arbejde, består overflademarkør panel af antistoffer mod MHC II, CD86, CD40 og Cire (CD209). Anti-muse-antistoffer mod de makrofag markører F4/80 og CD11b er også inkluderet i panelet til positivt at identificere makrofag fænotype under dataanalyse. Der skal udvises forsigtighed ved selektion af antistoffer mod MHC II-molekyler, som indavlede musestammer ofte afviger i deres MHC II-haplotyper. De udvalgte antistoffer skal reagere med de specifikke MHC-alloantigener udtrykt af musen stamme af interesse.
- Efter 48 timers inkubation med nanopartikler og / ellerstimulanser, sted cellekultur retter på is i 20 min. For at fjerne omliggende makrofager fra pladerne, forsigtigt skrabe brønde med en 24 cm celleskraber.
- Ved anvendelse af en 5 ml serologisk pipette forsigtigt aspireres cellerne og medium op og ned fem gange for at frembringe en enkelt cellesuspension. Pipettere indholdet af individuelle brønde i separate 5 ml polystyrenrør ikke at sammenblande celler fra forskellige eksperimentelle behandlinger.
- Tilsæt 2 ml FACS-buffer til hvert rør.
- Centrifugeglas på celler ved 250 x g ved 4 ° C i 10 minutter.
- Dekanter supernatanten og resuspender forsigtigt cellepelleten i tilbageværende væske ved at rive rørene over toppen af en reagensglasstativ.
- For at forhindre ikke-specifik binding af de monoklonale antistoffer, der tilsættes 10 pi blokerende buffer (fremstillet i 4,2) til hvert rør af celler. Vortexrør og inkuberes på is i 30 min.
- Tilsættes passende volumen af fortyndet monoklonale antistoffer til hvert rør og incubspiste i mørke på is i 15 min. Rør, der indeholder prøver, der skal analyseres, bør modtage kombinationen af antistoffer polycromatic panelet (tidligere optimering af kombinationen af antistoffer skal udføres af individuelle labs). Yderligere kontrolgrupper skal indgå i korrekt indstille erhvervelse parametre på flowcytometer, herunder et rør af celler, der ikke er mærket, og kompensation rør, der svarer til mærkede celler ved hjælp af hver enkelt farve separat. Til korrekt indstillet portene til flowcytometrisk analyse, fluorescens Minus One (FMO) kontrol bør medtages i købet. FMO kontroller celler mærket med alle de fluorochrom-konjugerede antistoffer, der anvendes på panelet undtagen en, der er erstattet med dens respektive isotypekontrol. Positive og negative populationer (dvs. særskilte portioner af celler behandlet med en positiv kontrol stimulerende og mellemstore alene) bør også indgå i FMO og kompensationskontrol rør.
- Dekanter supernatanten og resuspender cellepelleten i tilbageværende væske ved at rive rørene over toppen af en reagensglasstativ.
- Hvis antistoffet Panelet består af et antistof der ikke er direkte konjugeret til et fluorochrom, men er i stedet konjugeret til biotin, en fluorochrom-konjugeret streptavidin for at visualisere overflademarkør. I dette trin tilsættes et passende volumen af fortyndet fluorochrom-konjugeret streptavidin og inkuberes i mørke i 15 minutter på is. Som i 4,2 vil streptavidin fortyndes til en koncentration, der anbefales af producenten, eller til en optimeret af brugeren. Dette trin er kun nødvendigt for paneler, der indeholder biotinylerede primære antistoffer.
- Udføre en vasketrin, som beskrevet i 4,10.
- Fortynd en passende mængde af BD stabiliserende fastgørelse af 1:3 i deioniseret vand. Tilsæt 100 pi fortyndet fiksativ til hvert rør, medens forsigtigt vortexing at forhindre klumpning af celler. Mærkede og fikserede celler kan lagres stabilt i mørke ved 4 ° C i cirka en uge før købet på et flowcytometer.
5. Repræsentative data
Nanopartikler fremstillet i trin 3,1 havde en gennemsnitlig diameter på 163 ± 24 nm og en morfologi konsistent med det opnået i tidligere undersøgelser 5,16. Nanopartikler i opløsning før og efter sonikering er vist i figur 1 for at vise nødvendigheden af sonikering for at sikre tilstrækkelig spredning af partiklerne. Flowcytometrisk analyse af høstede AMɸs opnået via lungeudskylning er vist i figur 2. Mærkning af celler med en kombination af anti-muse-CD11b og anti-muse F4/80 antistoffer såvel som de tilsvarende FMO kontroller muliggør fastlæggelse baggrund mærkning, identifikation AMɸs og gating til yderligere analyse. Behandling af alveolære makrofager med polyanhydridnanopartikler forøger aktivering som vist ved den forøgede gennemsnitlige fluorescensintensitet af MHC II, CD40, CD86 og Cire (figur 3).
. Figur 1 50:50 CPTEG: CPH nanopartikler før (A) og efter (B) 30 s i sonikering.
Figur 2. Flowcytometrisk analyse af høstede alveolære makrofager mærket med (A) Alexa Fluor 700 anti-CD11b og PE-Cy7 FMO Control (B) Alexa Fluor 700 FMO Control og PE-Cy7 anti-F4/80 og (C ) Alexa Fluor 700 anti-CD11b og PE-Cy7 anti-F4/80. Nummeret i øverste højre hjørne viser procentdelen af dobbelt-positive celler.
Figur 3. Histogrammer viser en stigning i fluorescens hensigtfoldighed af overfladeekspression af MHC II (A), CD40 (B), CD86 (C) og Cire (D) efter co-kultur af alveolære makrofager med 50:50 CPTEG: CPH polyanhydrid nanopartikler i 48 timer. Histogrammer viser resultater for AMɸ mærket som FMO kontroller ( 
), Ubehandlet AMɸ mærket med antistoffer mod alle celleoverflademarkører ( 
) Og AMɸ dyrket med nanopartikler og mærket med antistoffer mod alle celleoverflademarkører ( 
).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Polyanhydridet nanopartikel vaccine platforme har vist effekt, når det gives intranasalt i enkeltdoser regimer 5. Måling af aktivering af de residente fagocytiske cellepopulationer i lungerne som følge af denne vaccine leveringsplatform tillader evaluering af potentielle evne til sidst fremme adaptive immunrespons.
Specifikt høst alveolære makrofager fra lungeudskylning fluid og behandle dem med forskellige formuleringer af nanopartiklerne giver indsigt i de evner forskellige partikelstørrelser kemier til at aktivere makrofager, der fører til antigenpræsentation 6,8. Desuden er disse in vitro-undersøgelser anvendes til vurdering af kapaciteten af disse partikelformede adjuvansformuleringer at aktivere makrofager, inden der iværksættes større og mere komplekse in vivo-undersøgelser. Eksperimenter skal altid indeholde en positiv kontrol behandling for overfladeaktivte markør opregulering, såsom LPS, en agonist af Toll-like receptor 4. Der bør udvises forsigtighed i planlægningen af forsøg forud for høst alveolære makrofager da denne protokol ikke kan producere tilstrækkeligt antal celler, der er nødvendige for flere behandlinger i et eksperiment. Lunge udskylninger kan derfor skal udføres på flere mus for at sikre passende celleantal (~ 5,0 x 10 5 celler pr mus) for større forsøg med flere behandlingsgrupper. Lungeudskylning teknikker er også blevet rapporteret for andre arter, og mængden af anvendte fluid er proportional med de arter, der undersøges (dvs. muselunge kapacitet 1 ml, rottelunge kapacitet er 10 ml, og human lunge kapacitet 6 L 17.
Polyanhydrid nanopartikler formuleres og opbevares i en tør pulverform at forhindre for tidlig overfladeerosion. På grund af statiske vekselvirkninger, der resulterer i klumpning af partiklerne, sonikering er nødvendigt før tilsætning til cellekulturer. Dette sTEP tillader ensartet fordeling og fører til mere reproducerbare resultater. Kvantificering af celleoverflademarkører på alveolære makrofager ved hjælp af flowcytometri kompliceres af stærke autofluorescens signaler. Denne forhindring kan overvindes ved at optimere FACS antistof koncentrationer, polykromatiske fluorokromkombinationer og flowcytometri capture parametre (dvs. brug af kompensation kontroller). FMO kontroller tillade ændringen af et fluorescerende parameter ad gangen, er nyttige til indstilling porte for hvert antistof og muliggøre korrekt kvantificering af celleoverflademarkør ekspression. Forskelle i de musestammer bør også overvejes i udvælgelsen af antistoffer, især haplotype specificitet af MHC II.
Det er vigtigt at have standardiserede metoder til at bestemme aktivering af antigen-præsenterende celler i lungen, da dette i høj grad vil lette sammenligninger af hidtil ukendte biomaterialer mellem forskellige laboratorier og institutioner. Gensamarbejdsvillige ensartede populationer af alveolære makrofager gennem de metoder, der præsenteres her, optimale betingelser sørge for at få brugbare data vedrørende forskellige formuleringer af nanopartikler og deres immunsystem at øge den potentielle.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke den amerikanske hær Medical Research og Materiel Kommando (Grant tal W81XWH-09-1-0386 og W81XWH-10-1-0806) for finansiel støtte og Dr. Shawn Rigby fra Iowa State University Flowcytometri facilitet for hans ekspert teknisk bistand.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cAM Media | |||
| DMEM | Cellgro | 15-013-CV | |
| 50 mM 2-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M3148-25ML | |
| Penicillin/Streptomycin 10,000 μg/ mL Solution | Cellgro | 30-002-CI | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| FACS Buffer | |||
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S671-500 | |
| Sodium phosphate | Fisher Scientific | MK7868500 | |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P217500 | |
| Potassium phosphate | Fisher Scientific | P288-200 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma-Aldrich | A7888 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Antibodies | |||
| Rat IgG | Sigma-Aldrich | I4341 | |
| Anti-Ms CD16/32 | eBioscience | 16-0161 | |
| Anti-Ms MHC II haplotype I-A/I-E, clone M5/114.15.2, conjugated to fluorescein isothiocyanate (FITC) | eBioscience | 11-5321 | |
| Anti-mouse CD86, clone GL-1, conjugated to allophycocyanin (APC)-Cy7 | Biolegend | 105030 | |
| Anti-mouse CD40, clone 1C10, conjugated to APC | eBioscience | 17-0401 | |
| Anti-mouse CD209, clone 5H10, conjugated to Biotin | eBioscience | 13-2091 | |
| Anti-mouse CD11b, clone M1/70, conjugated to Alexa Fluor 700 | eBioscience | 56-0112 | |
| Anti-mouse F4/80, clone BM8, conjugated to phyc–rythrin (PE)-Cy7 | eBioscience | 25-4801 | |
| PE-Texas red conjugated Streptavidin | BD Biosciences | 551487 | |
| Other Supplies and Reagents | |||
| Ethanol | Fisher Scientific | A405-20 | Used as 70% (v/v) |
| Compressed CO2 | Linweld | 16000060 | |
| 1 mL Syringe | BD Biosciences | 309659 | |
| Sovereign 3 ½" Fr Tom Catcatheter | Kendall | 703021 | |
| Biosafety Cabinet | NUAIRE | Series 22 | |
| Dissection Scissors | Fisher Scientific | 138082 | |
| Forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-8254 | |
| PBS, 1X without calcium and magnesium | Cellgro | 21-040-CM | |
| 15 mL Centrifuge Tubes with Screw Cap | VWR international | 21008-216 | |
| Six-well Tissue Culture Treated Plates | Costar | 3516 | |
| Plastic Tube Racks | Nalge Nunc international | 5970 | |
| Cell Scraper 24 cm | Techno Plastic Products | 99002 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube | Falcon BD | 352008 | |
| Pipet-aid XL | Drummond Scientific | 4-000-105 | |
| 10, 5, and 2 mL Pipettes | Fisher Scientific | 13-675 | |
| 200 and 10 μL micropipettors | Gilson Pipetman | F123601 | |
| 200 and 10 μL pipette tips | Fisher Scientific | 02-707 | |
| BD Stabilizing Fixative | BD Biosciences | 338036 | |
| Isoton II Diluent | Beckman Coulter Inc. | 8546719 | |
| Zap-oglobin II Lytic Reagent | Beckman Coulter Inc. | 7546138 | |
| Coulter Counter Polystyrene Vials | Beckman Coulter Inc. | 14310-684 | |
| Test Tubes | BD Biosciences | 352008 | |
| Equipment | |||
| Refrigerated Centrifuge | Labnet International | 50075040 | |
| Humidified Incubator CO2 | Nuaire | Model Autoflow 8500 | |
| FACSCanto Flow Cytometer | BD Biosciences | 338960 | |
| Coulter Particle Counter Z1 | Beckman Coulter Inc. | WS-Z1DUALPC | |
| Sonicator Liquid Processing Equipment with Microtip | Misonix | Model No. S-4000 | |
References
- Mallapragada, S. K., Narasimhan, B. Immunomodulatory biomaterials. Int. J. Pharm. 364, 265-271 (2008).
- Torres, M. P., Vogel, B. M., Narasimhan, B., Mallapragada, S. K. Synthesis and characterization of novel polyanhydrides with tailored erosion mechanisms. J. Biomed. Mater. Res. A. 76, 102-110 (2006).
- Lopac, S. K., Torres, M. P., Wilson-Welder, J. H., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. Effect of polymer chemistry and fabrication method on protein release and stability from polyanhydride microspheres. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 91, 938-947 (2009).
- Torres, M. P., Determan, A. S., Anderson, G. L., Mallapragada, S. K., Narasimhan, B. Amphiphilic polyanhydrides for protein stabilization and release. Biomaterials. 28, 108-116 (2007).
- Ulery, B. D. Design of a Protective Single-Dose Intranasal Nanoparticle-Based Vaccine Platform for Respiratory Infectious Diseases. PLoS ONE. 6, e17642 (2011).
- Petersen, L. K., Xue, L., Wannemuehler, M. J., Rajan, K., Narasimhan, B. The simultaneous effect of polymer chemistry and device geometry on the in vitro activation of murine dendritic cells. Biomaterials. 30, 5131-5142 (2009).
- Petersen, L. K. Activation of innate immune responses in a pathogen-mimicking manner by amphiphilic polyanhydride nanoparticle adjuvants. Biomaterials. 32, 6815-6822 (2011).
- Torres, M. P. Polyanhydride microparticles enhance dendritic cell antigen presentation and activation. Acta. Biomater. 7, 2857-2864 (2011).
- Kirby, A. C., Coles, M. C., Kaye, P. M. Alveolar macrophages transport pathogens to lung draining lymph nodes. J. Immunol. 183, 1983-1989 (2009).
- Barletta, K. E. Leukocyte compartments in the mouse lung: Distinguishing between marginated, interstitial, and alveolar cells in response to injury. J. Immunol. Methods. , (2011).
- Rubins, J. B. Alveolar macrophages: wielding the double-edged sword of inflammation. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 167, 103-104 (2003).
- Sun, K., Gan, Y., Metzger, D. W. Analysis of Murine Genetic Predisposition to Pneumococcal Infection Reveals a Critical Role of Alveolar Macrophages in Maintaining the Sterility of the Lower Respiratory Tract. Infect. Immun. 79, 1842-1847 (2011).
- Morimoto, K. Alveolar Macrophages that Phagocytose Apoptotic Neutrophils Produce Hepatocyte Growth Factor during Bacterial Pneumonia in Mice. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 24, 608-615 (2001).
- Gordon, S., Taylor, P. R. Monocyte and macrophage heterogeneity. Nat. Rev. Immunol. 5, 953-964 (2005).
- Ulery, B. D. Polymer chemistry influences monocytic uptake of polyanhydride nanospheres. Pharm. Res. 26, 683-690 (2009).
- Petersen, L. K., Sackett, C. K., Narasimhan, B. High-throughput analysis of protein stability in polyanhydride nanoparticles. Acta Biomater. 6, 3873-3881 (2010).
- Irvin, C. G., Bates, J. H. Measuring the lung function in the mouse: the challenge of size. Respir. Res. 4, 4 (2003).
