Summary
במסמך זה אנו מתארים פרוטוקולים קצירת מקרופאגים מכתשיים Murine, אשר תושבי תאים חיסוניים מולדים בריאה, ובדיקת ההפעלה שלהם כתגובה לתרבות בשיתוף עם חלקיקים polyanhydride.
Abstract
חלקיקים מתכלה צמחו כפלטפורמה צדדי על התכנון והיישום של אפי חיסונים חדשים כנגד מחלות זיהומיות בדרכי הנשימה. באופן ספציפי, polyanhydride חלקיקים מורכב חומצה sebacic aliphatic (SA), ארומטי 1,6-bis (p-carboxyphenoxy) הקסאן (CPH), או amphiphilic 1,8-bis (p-carboxyphenoxy) -3,6-dioxaoctane (CPTEG) להציג בתפזורת ייחודי סחף קרקע קינטיקה 1,2 וניתן לנצל לשחרר באיטיות ביומולקולות תפקודית (למשל, אנטיגנים, נוגדנים חלבון וכד ') in vivo 3,4,5. אלו חלקיקים גם בעלי פעילות משלים מהותי, מה שהופך אותם בחירה מצוינת עבור פלטפורמת אספקת החיסון 6,7,8.
על מנת להבהיר את המנגנונים השולטים ההפעלה של חסינות מולדת בעקבות החיסון הרירית אפי, יש להעריך את התגובות מולקולרית תאית של p אנטיגןתאים כועס (נגמ"שים) אחראית ליזום התגובה החיסונית. התאים הדנדריטים הם נגמ"שים העיקריים שנמצאו בניהול דרכי הנשימה, בעוד מקרופאגים מכתשיים (AMɸ) שולטים parenchyma ריאות 9,10,11. AMɸ הם היעילה ביותר בניקוי הריאות של פתוגנים חיידקים ופסולת תא 12,13. בנוסף, זה סוג תא יש תפקיד חשוב בהובלה של אנטיגנים של חיידקים אל קשרי הלימפה וניקוז, וזה צעד ראשון חשוב בייזום של תגובה חיסונית אדפטיבית 9. AMɸ גם מביעים רמות גבוהות של זיהוי תבניות מולדות קולטנים זבל, מפרישים Pro דלקת מתווכים, וראש ותאי T נאיבי 12,14. האוכלוסייה טהורה יחסית של AMɸ (למשל, יותר מ 80%) יכול בקלות להיות מושגת באמצעות שטיפה ריאות למחקר במעבדה. תושב שנקטפו AMɸ מבעלי חיים המוסמכות החיסונית לספק הפנוטיפ מייצג של מקרופאגים אשר encounter חיסון החלקיקים מבוסס in vivo. במסמך זה אנו מתארים את הפרוטוקולים המשמשים הקציר ותרבות AMɸ מעכברים ולבדוק את הפנוטיפ הפעלה של מקרופאגים לאחר הטיפול עם חלקיקים polyanhydride במבחנה.
Protocol
1. קציר המקרופאגים מכתשיים (AMɸ) של העכבר באמצעות שטיפה ריאות
- מתאים ללבוש ציוד מגן אישי (PPE) כגון חלוק מעבדה, כפפות חד פעמיות, והגנה עין נכונה.
- הכן מלאה AMɸ (cAMɸ) בינוני לפני תחילת הבציר. הוסף 2.5 מ"ל של סטרפטומיצין / פניצילין (עט / דלקת) הפתרון, 250 μL של mercaptoethanol-β (2-mercaptoethanol), ו -25 מ"ל של סרום חום מומת שור עוברית (FBS) כדי מ"ל 222.25 של שינוי Dulbelcco הנשרים בינוני (DMEM). מסנן לעקר cAMɸ בינוני באמצעות גודל הנקבוביות 0.2 מיקרומטר הבקבוק מסנן למעלה תחת ואקום.
- להרדים עכבר בריא על ידי מחנק 2 CO בחדר euthanization. למרות העכבר C57BL / 6 (6-8 שבועות) שימש לצורך פרויקט זה, טכניקה זו שטיפה ריאות ניתן לבצע על כל זן של העכבר. באמצעות בלון גז דחוס, שלא זרימת הגז לתוך החדר דקות 1 לפני הצבת העכבר CHענבר להבטיח כי קאמרית טעונה במלואה עם CO 2. מניחים את העכבר בתא לרגע אחד לפחות להרדים את העכבר. בנוסף, ולגרום לדימום מחודש בכל דרך העכבר לנקב לב כשיטה פיזי כדי לאשר את מותו העכבר כמתואר 1.4.
- הנח עכבר על גבו (צד הגב), ריסוס באתנול 70%, אתר את עצם החזה ואת, בזווית של 30 מעלות מהבטן, הכנס מחט מד 23 (מצורף מזרק 1 מ"ל) כ - 50 מ"מ לתוך חלל בית החזה . עם המיקום הנכון של המחט, ניתן יהיה לאסוף בין 0.4-1 מ"ל של דם תלוי בגודל של עכבר. לבחון את בעלי החיים על הפסקת סימנים חיוניים.
- במקום העכבר על ספסל במעבדה כך שהוא שוכב על הבטן שלה (צד הגחון). תרסיס העכבר עם אתנול 70% לעקר את סביבת העבודה. לצבוט את העור בערך באמצע עמוד השדרה של העכבר. באמצעות מספריים הנתיחה כי כבר מעוקרות עם אתנול 70%, לעשות חתך קטן דרך העור. </ Li>
- תפוס את העור משני צידי החתך, ומושכים את העור בכיוונים מנוגדים לאורך ציר הגולגולת, הזנב של העכבר. כאשר נעשה בצורה נכונה, עור יוסר הפגר הבסיסית.
- הצוואר של העכבר אמור להראות שרירים חשופים ובלוטות. בזהירות לחתוך את רקמת ולמשוך אותו לכיוון הקדמי של העכבר באמצעות מלקחיים, ובכך לחשוף את הגרון, קנה הנשימה, והוושט של העכבר. למנוע חיתוך וריד הצוואר או העורק הראשי.
- קנה הנשימה נראה כעת, והוא מזהה כמו רקמת הסחוס עם טבעות סביבו. בעדינות להחזיק את קנה הנשימה עם מלקחיים בעדינות להרים להפריד בין קנה הנשימה לוושט, הנמצא בצד הגב.
- לעשות חתך קטן הקדמי למקום 1 מחזיקה קנה הנשימה אבל האחורי אל הגרון. החתך צריך להיות על כ זווית ° 45 מעלות. כמו כן, לא לגמרי transect קנה הנשימה, זה ימנע ממנו retracting אלחלל הגוף.
- למלא מזרק 1 סמ"ק מצויד עם קטטר חתול טום עם PBS סטרילי לקראת להכניס קטטר לתוך לומן של קנה הנשימה. החזיקו את קנה הנשימה באמצעות מלקחיים ועם היד להחזיק את הקטטר קרוב לקצה כדי להגדיל את השליטה בעדינות להכניס אותו לתוך האתר חתך קנה הנשימה. בעדינות להכניס קטטר לתוך קנה הנשימה על 20 מ"מ. להחזיק את הנשימה כי הוא סביב צינורית קטטר, לשחרר את היד השנייה.
- באמצעות מזרק 1 מ"ל מצויד עם קטטר, בעדינות להחדיר 0.75 מ"ל של בטמפרטורת החדר, סטרילית PBS לריאות ואז בעדינות לשאוב בחזרה לתוך המזרק PBS. חזור על תהליך זה שלוש פעמים תוך חיצונית עיסוי החזה. נתק את המזרק מ קטטר ולחלק נוזל שטיפה לתוך צינור צנטריפוגות 15 מ"ל. לאחר מילוי המזרק עם 0.75 מ"ל של PBS טרי וחיבור מחדש את המזרק קטטר, חזור על שלבים 1.9 ו - 1.10 פעמיים עבור כל עכבר. ההתאוששות נוזלים יכול להיות חלקי, קבלת פחות מ ווlume רווי. אם איסוף תאים של העכבר יותר, הצב את שפופרת 15 מ"ל עם התאים שנקטפו על הקרח עד שכל lavages ריאה בוצעו.
2. עיבוד קציר שטיפה AMɸ ריאות
- סרכזת נוזל שטיפה ריאות ב 250 x ג'10 דקות ב 4 ° C.
- שימוש בטכניקה סטרילית, supernatant לערות לתוך מיכל פסולת המתאים בתוך ארון בטיחות ביולוגית. Resuspend תא גלולה ידי בעדינות וגרף צינור צנטריפוגות לרוחב החלק העליון של המדף מבחנה. הוסף 1 מ"ל של מדיום cAMɸ כדי resuspend התאים.
- למנות את התאים באמצעות Z1 מונה קולטר החלקיקים ידי pipetting 20 μL של תאים לתוך 10 מ"ל של Isoton II diluent בבקבוקון קולטר הדלפק. הוסף 3 עד 4 טיפות של ריאגנט II-זאפ oglobin ממוסס את הבקבוקון בעדינות מרחב זה 3 עד 4 פעמים ולאחר מכן לטעון את הבקבוקון מדגם על הדלפק כדי להשיג ריכוז התא. הקפד לתכנת את המונה עם מקדם דילול של 2 X 10 4 כדי להציגהתא ריכוז ככל שמספר התאים לכל מ"ל.
- לדלל תאים עד 2.5 x 10 -5 מ"ל באמצעות המדיום cAMɸ.
- לוותר על 2 מ"ל של 2.5 x 10 5 תאים למ"ל לבאר כל אחד מנה 6-גם בתרבית רקמה.
- כדי להעשיר את AMɸ, מאכלים תרבות דגירה בתוך 37 ° C חממה humidified עם אווירה 5% CO 2 על 6 שעות, כדי לאפשר לתאים לדבוק בתחתית הבאר. בעדינות לשאוב supernatant לא לשבש תאים חסיד.
- יש לשטוף את הבארות באמצעות סטרילית PBS (סידן ומגנזיום חינם) כדי להסיר את אי - חסיד תאים ופסולת. הוסף 2 מ"ל של מדיום cAMɸ היטב כל אחד מהם.
- דגירה תאים לילה בתוך 37 ° C חממה humidified עם אווירה 5% CO 2 לפני תוספת של חומרים ממריצים. לאחר שלב זה העשרה, כ 87% מכלל התאים חיובית עבור סמנים מקרופאג CD11b ו F4/80 (איור 2 ג).
3. תוספת של Polyanhydridדואר חלקיקים טיפולים בקרה
- לייצר חלקיקים באמצעות nanoencapsulation polyanhydride נגד ממס 15. בתהליך זה, פולימר הוא מומס מתילן כלוריד (4 ° C בריכוז של 25 מ"ג / מ"ל) ו זירז של פנטן (-20 ° C ב כלוריד 1:200 יחס מתילן: פנטן).
- לשקול את חלקיקי polyanhydride באמצעות עיקור לשקול עבודה על שיווי המשקל שניתן למדוד במדויק את כמויות מיקרוגרם. הוסף חלקיקים לצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל.
- Resuspend חלקיקים בקרח קר cAMɸ. החישובים נעשים כך לא יותר מ 0.3 מ"ל של מדיום נוסף גם כל להשיג את הריכוז הרצוי של חלקיקים. שמור את חלקיקי resuspended על הקרח עד חלקיקים נוספים לתרבות היטב.
- לפני הוספת חלקיקים התרבויות AMɸ, sonicate חלקיקים באמצעות sonicator גבי ספסל עם microtip. לעקר microtip ידי ריסוס עם אתנול 70% ו ניגובg עם Kimwipe סטרילי לפני sonication. Sonicate ב 10-20 ג'אול עבור S 30-45, תוך שמירה על צינור על הקרח. שימו לב ההשעיה nanoparticle macroscopically. אם החלקיקים אינם מפוזרים במידה מספקת, לאפשר השעיה להגדיר על קרח דק 1-2 על מנת להבטיח כי חלקיקים הם מתחת לטמפרטורת מעבר הזכוכית של הפולימר לפני sonicating שוב בין 30 ל 45 שניות. מטרת צעד זה היא מספקת sonication לפיזור חלקיקים, כמו CPTEG 50:50: חלקיקים CPH נוטים לצבור כאשר הם נחשפים לסביבה מימית. עם זאת, כמה אגרגטים קטנים של חלקיקים, עדיין עשויים לרחף.
- ההשעיה Nanoparticle (מפוזרים במידה מספקת) יש לשמור על הקרח ומשומשות מיד כדי למנוע שחיקה מוקדמת לפני השטח או צבירה.
- הסר את הכלים תרבות המכילים AMɸ מ חממה ומקום בארון בטיחות ביולוגית. הצלחת להטות בזווית של כ 45 מעלות ו פיפטה את כמות Mediאממ כי יתווספו ההשעיה nanoparticle (זה לא יעלה על 0.3 מ"ל). נא לא להפריע לתאי חסיד בעת הסרת בינוני.
- המערבולת nanoparticle polyanhydride השעיה לזמן קצר לפני הוספתו בארות המתאימים. פיפטה את כמות ההשעיה nanoparticle (לא יותר מ 0.3 מ"ל) לתוך הבאר ספציפי (ים), עם זאת, אל פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב. פעולה זו יכולה לנתק את חסיד AMɸ מהבאר. חלקיקים יישב לתחתית הבאר ולפנות את התאים. על המחקרים המפורטים בדוח זה, הריכוז הסופי של חלקיקים שיתוף תרבותי עם AMɸ היה 125 מיקרוגרם / מ"ל. להמשיך בארות הבאים וקבוצות הטיפול הרצויות. כוללים קבוצות ביקורת חיוביים ושליליים, כגון בינונית בלבד 200 ng / mL lipopolysaccharide (LPS) לבארות ייעודיים.
- להחזיר את הכלים תרבות על 37 מעלות צלזיוס humidified חממה עם אווירה 5% CO 2 של 48 שעות. מחקרים קינטית laborator שלנוY הראו 48 שעות להיות תקופה תרבות אופטימלית להערכת הן על פני קרום התא ביטוי סמן ואת הפרשת ציטוקינים כפי שהוא מאפשר זמן מספיק לצורך שעתוק סינתזת החלבון להתרחש. למרות רמות גבוהות יותר של ציטוקינים לצבור בתקופה תרבות המורחבת (כלומר, 72 שעות), הערכת שטח פני התא ביטוי הסמן בנקודה זו בזמן ניתן מבולבל על ידי תרומה של רמות גבוהות של ציטוקינים. השינויים ביטוי סמן פני העיר לא ניתן לייחס ישירות גירוי עם חלקיקים עצמם.
4. הערכת AMɸ הפעלה באמצעות cytometry זרימה
- הכן הקרינה המופעל מיון תאים (FACS) חוצץ (0.1% אזיד הנתרן ו -0.1% שור סרום אלבומין (BSA)) ב 0.1 פוספט M שנאגרו מלוחים (pH 7.4) לפני קצירת מקרופאגים מצופה כי היה שיתוף תרבותי עם חלקיקים OR-ממריצים.
- להכין עבודה של פתרונות למאגר חסימת ואת נוגדנים חד שבטיים. כדי להכין את החיץ בלוק, לדלל עכברוש IgG (Sigma) ו anti-CD16/32 (eBioscience) עד 1 מ"ג / מ"ל ו - 10 מיקרוגרם / מ"ל, בהתאמה, במאגר FACS. לדלל סמן פני נוגדן לוח במאגר FACS לריכוז או היצרן מומלץ או ריכוז משתמש אופטימלית. לקבלת התוצאות שהוצגו בעבודה זו, את לוח סמן משטח כולל נוגדנים כנגד MHC II, CD86, CD40 ו CIRE (CD209). אנטי עכבר נוגדנים כנגד סמנים מקרופאג F4/80 ו CD11b כלולים גם בלוח באופן חיובי לזהות פנוטיפ מקרופאג במהלך ניתוח הנתונים. יש להקפיד בבחירת נוגדנים נגד מולקולות MHC-חלבון II, כמו זנים טהורים עכבר לעתים קרובות שונים haplotypes MHC-חלבון שלהם II. את הנוגדנים שנבחרו חייבים להגיב עם alloantigens MHC-חלבון ספציפי לידי ביטוי על ידי מתח העכבר של עניין.
- לאחר 48 שעות של דגירה עם חלקיקים ו / אוממריצים, התא במקום תרבות מנות על קרח למשך 20 דקות. כדי להסיר את מקרופאגים חסיד של הצלחות, בעדינות לגרד בארות עם מגרד תא 24 ס"מ.
- בעזרת פיפטה 5 מ"ל סרולוגית, לשאוב בעדינות את התאים ובינוניים מעלה ומטה חמש פעמים כדי ליצור ההשעיה תא בודד. פיפטה את התוכן של בארות בודדים לתוך צינורות נפרדים 5 מ"ל קלקר כדי לא לערבב יחד תאים טיפולים ניסיוניים שונים.
- הוסף 2 מ"ל של חיץ FACS לצינור אחד.
- סרכזת צינורות של תאים ב 250 x גרם ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
- למזוג supernatant בעדינות תא גלולה resuspend בנוזל שיורי על ידי וגרף צינורות לרוחב החלק העליון של המדף מבחנה.
- כדי למנוע שאינם ספציפיים מחייב של נוגדנים חד שבטיים, להוסיף 10 μL מאגר חוסם (שהוכן 4.2) על צינור אחד של תאים. מערבולת צינורות דגירה על קרח למשך 30 דקות.
- להוסיף נפח מתאים של נוגדנים חד שבטיים מדולל כדי צינור כל incubאכלו בחושך על קרח במשך 15 דקות. צינורות המכילים דגימות להיות מנותח צריך לקבל שילוב של נוגדנים של לוח polycromatic (אופטימיזציה הקודם של שילוב של נוגדנים יש לבצע על ידי מעבדות בודדות). קבוצות שליטה נוספת יש לכלול כראוי להגדיר את הפרמטרים על רכישת cytometer את זרימת, כולל צינורית של תאים שלא תויגו, וצינורות הפיצויים המתאימים התאים המסומנים באמצעות כל צבע אחד בנפרד. כדי להגדיר נכונה את השערים עבור ניתוח תזרים cytometric, הקרינה מינוס אחת (FMO) שולטת יש לכלול במהלך הרכישה. בקרות FMO הם תאים שכותרתו עם כל fluorochrome-מצומדות נוגדנים הנמצאים בשימוש בלוח למעט אחד מוחלף על ידי שליטה isotype שלו בהתאמה. אוכלוסיות חיוביות ושליליות (כלומר, aliquots נפרדות של תאים שטופלו מעורר ביקורת בינוני חיובי בלבד) צריך להיכלל FMO ובקרת צינורות פיצויים.
- למזוג supernatant ו resuspend תא גלולה בנוזל שיורי על ידי וגרף צינורות לרוחב החלק העליון של המדף מבחנה.
- אם לוח נוגדן מורכב נוגדן לא מצומד ישירות fluorochrome אבל היא מצומדת במקום ביוטין, streptavidin fluorochrome-מצומדות צורך לדמיין את הסמן על פני השטח. בשלב זה, להוסיף נפח מתאים של streptavidin fluorochrome-מצומדות בדילול מלא ו דגירה בחושך במשך 15 דקות על הקרח. כמו 4.2, streptavidin יהיה מדולל לריכוז המומלץ על ידי היצרן או לאחד מותאם על ידי המשתמש. צעד זה נחוץ רק עבור לוחות המכילים נוגדנים ראשוניים biotinylated.
- לבצע צעד לשטוף כמתואר 4.10.
- לדלל נפח מתאים של BD ייצוב 01:03 מקבע במים deionized. הוספת 100 μL של מקבע מדולל כדי צינור אחד תוך בעדינות ווrtexing למנוע clumping של תאים. תאים שכותרתו קבוע ניתן לאחסן ביציבות ב 4 בחושך מעלות צלזיוס למשך שבוע בערך לפני הרכישה על cytometer הזרימה.
5. נציג נתונים
חלקיקים מפוברק בשלב 3.1 היה בקוטר ממוצע של 163 ± 24 ננומטר מורפולוגיה בקנה אחד עם שהשיגה במחקרים קודמים 5,16. חלקיקים בתמיסה לפני ואחרי sonication מוצגות באיור 1 כדי להדגים את הצורך sonication על מנת להבטיח פיזור נאות של חלקיקים. ניתוח תזרים cytometric של AMɸs שנקטפו לקבל ע"י שטיפה ריאות מוצג באיור 2. סימון תאים עם שילוב של CD11b העכבר נגד ועכבר נגד F4/80 נוגדנים, כמו גם את הפקדים המתאימים FMO מאפשר הקמת תיוג רקע, זיהוי AMɸs ו gating לצורך ניתוח נוסף. טיפול מקרופאגים מכתשיים עם polyanhydrideחלקיקים משפר ההפעלה כפי שמוצג על ידי עוצמת הקרינה מוגברת הממוצע של MHC II, CD40, CD86, ו CIRE (איור 3).
1. איור 50:50 CPTEG: CPH חלקיקים לפני () ואחרי זה 30 (ב) sonication.
2. איור ניתוח תזרים cytometric של מקרופאגים מכתשיים שנקטפו שכותרתו עם () Alexa פלואוריד 700 נגד CD11b ו PE-Cy7 FMO הבקרה, (ב) Alexa פלואוריד 700 FMO בקרה PE-Cy7 anti-F4/80 (ג ) Alexa פלואוריד 700 נגד CD11b ו PE-Cy7 anti-F4/80. המספר בפינה הימנית העליונה מייצג את אחוז פעמיים חיוביות תאים.
איור 3. Histograms הוכחת עלייה כוונות הקרינהצפיפות לביטוי פני MHC II (א '), CD40 (ב'), CD86 (C) CIRE (ד ') לאחר התרבות המשותפת של מקרופאגים מכתשיים עם CPTEG 50:50: polyanhydride CPH חלקיקים עבור שעות 48. היסטוגרמות מתארים תוצאות AMɸ שכותרתו FMO שולטת ( 
), מטופל AMɸ תווית עם נוגדנים כנגד כל סמני שטח פני התא ( 
) ו AMɸ בתרבית עם חלקיקים ומסומן עם נוגדנים כנגד כל סמני שטח פני התא ( 
).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nanoparticle Polyanhydride פלטפורמות החיסונים הראו יעילות כאשר מנוהל intranasally ב משטרי מינון יחיד 5. מדידת ההפעלה של אוכלוסיות תאים מקומיים phagocytic של הריאות הנגרמת על ידי אספקת פלטפורמה זו מאפשרת חיסון הערכת היכולת הפוטנציאלית שלה בסופו של דבר לקדם את המערכת החיסונית אדפטיבית.
באופן ספציפי, קצירת מקרופאגים מכתשיים מנוזל שטיפה ריאות וטיפול אותם ניסוחים שונים של חלקיקים מספק תובנות לגבי היכולות של chemistries חלקיקים שונים כדי להפעיל מקרופאגים, המוביל מצגת אנטיגן 6,8. בנוסף, אלה במבחנה שימושיים להערכת היכולת של אלה ניסוחים אדג 'ובנטי חלקיקים להפעיל מקרופאגים מכתשיים לפני היציאה גדול יותר ומורכב יותר במחקרים vivo. ניסויים תמיד צריך להכיל הטיפול שליטה חיובית surfacסמן את ה-רגולציה, כגון LPS, אגוניסט של הקולטן חיוג כמו 4. יש להקפיד בתכנון ניסויים לקראת קצירת מקרופאגים מכתשיים כפרוטוקול זה לא יכול לייצר מספר מתאים של תאים הדרושים טיפולים מרובים באחד הניסויים. Lavages ריאות ולכן צריך להתבצע על עכברים רבים על מנת להבטיח מספר תאים מתאימים (~ 5.0 x 10 5 תאים לכל עכבר) עבור ניסויים גדולים יותר עם קבוצות הטיפול ועוד. שטיפה טכניקות ריאות דווחו גם על מינים אחרים, את כמות הנוזלים מנוצל הוא יחסי המין הנלמד (כלומר, קיבולת ריאות העכבר הוא 1 מ"ל, קיבולת ריאות חולדה הוא 10 מ"ל ו קיבולת ריאות האנושי הוא 6 ל 17.
חלקיקים Polyanhydride מנוסחות ומאוחסנים בצורה אבקה יבשה כדי למנוע שחיקה מוקדמת לפני השטח. בשל יחסי הגומלין סטטיים כי התוצאה clumping של חלקיקים, sonication הכרחי לפני בנוסף בתרביות תאים. זה שלTEP מאפשר התפלגות אחידה ומוביל לתוצאות יותר לשחזור. כימות של סמנים פני התא על מקרופאגים מכתשיים באמצעות cytometry זרימה מסובך ידי אותות autofluorescence חזקים. מכשול זה ניתן להתגבר על ידי אופטימיזציה של ריכוזי נוגדנים FACS, שילובים fluorochrome הססגוניות, וכן cytometry זרימת פרמטרים ללכוד (כלומר, שימוש בפקדים הפיצויים). בקרות FMO לאפשר שינוי של פרמטר אחד ניאון בכל פעם, הם שימושיים לקביעת השערים נוגדן זה ולאפשר כימות נכון של הביטוי שטח פני התא הסמן. הבדלים בין זנים של עכברים צריך גם לקחת בחשבון בבחירה של נוגדנים, בעיקר הספציפיות haplotype של MHC II.
חשוב לי שיטות סטנדרטיות כדי לקבוע הפעלה של תאים מציגי אנטיגן בריאה, כמו זה יהיה מאוד להקל על השוואות של biomaterials הרומן בין מעבדות ומוסדות שונים. Generating אוכלוסיות עקבית של מקרופאגים מכתשיים באמצעות השיטות שהוצגו כאן, מספקים תנאים אופטימליים לקבלת מידע שימושי לגבי ניסוחים שונים של חלקיקים ופוטנציאל שיפור החיסונית שלהם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגוד עניינים הצהיר.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות צבא ארה"ב למחקר רפואי ואמצעי פיקוד (במדבר גרנט W81XWH-09-1-0386 ו W81XWH-10-1-0806) עבור תמיכה כספית ד"ר שון ריגבי מ מתקן מדינת איווה אוניברסיטת cytometry זרימה עבור מומחה סיוע טכני שלו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cAM Media | |||
| DMEM | Cellgro | 15-013-CV | |
| 50 mM 2-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M3148-25ML | |
| Penicillin/Streptomycin 10,000 μg/ mL Solution | Cellgro | 30-002-CI | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| FACS Buffer | |||
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S671-500 | |
| Sodium phosphate | Fisher Scientific | MK7868500 | |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P217500 | |
| Potassium phosphate | Fisher Scientific | P288-200 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma-Aldrich | A7888 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Antibodies | |||
| Rat IgG | Sigma-Aldrich | I4341 | |
| Anti-Ms CD16/32 | eBioscience | 16-0161 | |
| Anti-Ms MHC II haplotype I-A/I-E, clone M5/114.15.2, conjugated to fluorescein isothiocyanate (FITC) | eBioscience | 11-5321 | |
| Anti-mouse CD86, clone GL-1, conjugated to allophycocyanin (APC)-Cy7 | Biolegend | 105030 | |
| Anti-mouse CD40, clone 1C10, conjugated to APC | eBioscience | 17-0401 | |
| Anti-mouse CD209, clone 5H10, conjugated to Biotin | eBioscience | 13-2091 | |
| Anti-mouse CD11b, clone M1/70, conjugated to Alexa Fluor 700 | eBioscience | 56-0112 | |
| Anti-mouse F4/80, clone BM8, conjugated to phyc–rythrin (PE)-Cy7 | eBioscience | 25-4801 | |
| PE-Texas red conjugated Streptavidin | BD Biosciences | 551487 | |
| Other Supplies and Reagents | |||
| Ethanol | Fisher Scientific | A405-20 | Used as 70% (v/v) |
| Compressed CO2 | Linweld | 16000060 | |
| 1 mL Syringe | BD Biosciences | 309659 | |
| Sovereign 3 ½" Fr Tom Catcatheter | Kendall | 703021 | |
| Biosafety Cabinet | NUAIRE | Series 22 | |
| Dissection Scissors | Fisher Scientific | 138082 | |
| Forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-8254 | |
| PBS, 1X without calcium and magnesium | Cellgro | 21-040-CM | |
| 15 mL Centrifuge Tubes with Screw Cap | VWR international | 21008-216 | |
| Six-well Tissue Culture Treated Plates | Costar | 3516 | |
| Plastic Tube Racks | Nalge Nunc international | 5970 | |
| Cell Scraper 24 cm | Techno Plastic Products | 99002 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube | Falcon BD | 352008 | |
| Pipet-aid XL | Drummond Scientific | 4-000-105 | |
| 10, 5, and 2 mL Pipettes | Fisher Scientific | 13-675 | |
| 200 and 10 μL micropipettors | Gilson Pipetman | F123601 | |
| 200 and 10 μL pipette tips | Fisher Scientific | 02-707 | |
| BD Stabilizing Fixative | BD Biosciences | 338036 | |
| Isoton II Diluent | Beckman Coulter Inc. | 8546719 | |
| Zap-oglobin II Lytic Reagent | Beckman Coulter Inc. | 7546138 | |
| Coulter Counter Polystyrene Vials | Beckman Coulter Inc. | 14310-684 | |
| Test Tubes | BD Biosciences | 352008 | |
| Equipment | |||
| Refrigerated Centrifuge | Labnet International | 50075040 | |
| Humidified Incubator CO2 | Nuaire | Model Autoflow 8500 | |
| FACSCanto Flow Cytometer | BD Biosciences | 338960 | |
| Coulter Particle Counter Z1 | Beckman Coulter Inc. | WS-Z1DUALPC | |
| Sonicator Liquid Processing Equipment with Microtip | Misonix | Model No. S-4000 | |
References
- Mallapragada, S. K., Narasimhan, B. Immunomodulatory biomaterials. Int. J. Pharm. 364, 265-271 (2008).
- Torres, M. P., Vogel, B. M., Narasimhan, B., Mallapragada, S. K. Synthesis and characterization of novel polyanhydrides with tailored erosion mechanisms. J. Biomed. Mater. Res. A. 76, 102-110 (2006).
- Lopac, S. K., Torres, M. P., Wilson-Welder, J. H., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. Effect of polymer chemistry and fabrication method on protein release and stability from polyanhydride microspheres. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 91, 938-947 (2009).
- Torres, M. P., Determan, A. S., Anderson, G. L., Mallapragada, S. K., Narasimhan, B. Amphiphilic polyanhydrides for protein stabilization and release. Biomaterials. 28, 108-116 (2007).
- Ulery, B. D. Design of a Protective Single-Dose Intranasal Nanoparticle-Based Vaccine Platform for Respiratory Infectious Diseases. PLoS ONE. 6, e17642 (2011).
- Petersen, L. K., Xue, L., Wannemuehler, M. J., Rajan, K., Narasimhan, B. The simultaneous effect of polymer chemistry and device geometry on the in vitro activation of murine dendritic cells. Biomaterials. 30, 5131-5142 (2009).
- Petersen, L. K. Activation of innate immune responses in a pathogen-mimicking manner by amphiphilic polyanhydride nanoparticle adjuvants. Biomaterials. 32, 6815-6822 (2011).
- Torres, M. P. Polyanhydride microparticles enhance dendritic cell antigen presentation and activation. Acta. Biomater. 7, 2857-2864 (2011).
- Kirby, A. C., Coles, M. C., Kaye, P. M. Alveolar macrophages transport pathogens to lung draining lymph nodes. J. Immunol. 183, 1983-1989 (2009).
- Barletta, K. E. Leukocyte compartments in the mouse lung: Distinguishing between marginated, interstitial, and alveolar cells in response to injury. J. Immunol. Methods. , (2011).
- Rubins, J. B. Alveolar macrophages: wielding the double-edged sword of inflammation. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 167, 103-104 (2003).
- Sun, K., Gan, Y., Metzger, D. W. Analysis of Murine Genetic Predisposition to Pneumococcal Infection Reveals a Critical Role of Alveolar Macrophages in Maintaining the Sterility of the Lower Respiratory Tract. Infect. Immun. 79, 1842-1847 (2011).
- Morimoto, K. Alveolar Macrophages that Phagocytose Apoptotic Neutrophils Produce Hepatocyte Growth Factor during Bacterial Pneumonia in Mice. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 24, 608-615 (2001).
- Gordon, S., Taylor, P. R. Monocyte and macrophage heterogeneity. Nat. Rev. Immunol. 5, 953-964 (2005).
- Ulery, B. D. Polymer chemistry influences monocytic uptake of polyanhydride nanospheres. Pharm. Res. 26, 683-690 (2009).
- Petersen, L. K., Sackett, C. K., Narasimhan, B. High-throughput analysis of protein stability in polyanhydride nanoparticles. Acta Biomater. 6, 3873-3881 (2010).
- Irvin, C. G., Bates, J. H. Measuring the lung function in the mouse: the challenge of size. Respir. Res. 4, 4 (2003).
