Summary
Heri beskriver vi protokoller for høsting murine alveolære makrofager, som er bosatt medfødte immunceller i lungene, og undersøker deres aktivisering som svar på co-kulturen med polyanhydride nanopartikler.
Abstract
Nedbrytbare nanopartikler har dukket opp som en allsidig plattform for design og implementering av nye intranasal vaksiner mot luftveissykdommer smittsomme sykdommer. Spesielt nanopartikler polyanhydride sammensatt av alifatiske sebacic syre (SA), den aromatiske 1,6-bis (p-carboxyphenoxy) heksan (CPH), eller den amfifile 1,8-bis (p-carboxyphenoxy) -3,6-dioxaoctane (CPTEG) vise unik bulk og overflate erosjon kinetikk 1,2 og kan utnyttes til å sakte frigjøre funksjonelle biomolekyler (f.eks protein antigener, immunglobuliner etc.) in vivo 3,4,5. Disse nanopartiklene også ha egenverdi adjuvant aktivitet, noe som gjør dem til et utmerket valg for en vaksine levering plattform 6,7,8.
For å belyse de mekanismer som styrer aktiveringen av medfødt immunitet etter intranasal mucosal vaksinasjon, må en vurdere de molekylære og cellulære responser av antigen presenting celler (APC) som er ansvarlige for å initiere immunreaksjoner. Dendrittiske celler er de viktigste APC funnet i gjennomføring luftveiene, mens alveolære makrofager (AMɸ) dominerer i lungene parenchyma 9,10,11. AMɸ er svært effektiv i å rydde lungene av mikrobielle patogener og celleavfall 12,13. I tillegg spiller denne celletype en verdifull rolle i transporten av mikrobielle antigener til drenering lymfeknuter, som er et viktig første skritt i initiering av en adaptiv immunrespons 9. AMɸ uttrykker også forhøyede nivåer av medfødt mønstergjenkjenning og scavenger reseptorer, skiller pro-inflammatoriske mediatorer, og prime naive T-celler 12,14. En relativt ren populasjon av AMɸ (f.eks høyere enn 80%) kan enkelt hentes via lunge lavage for studier i laboratoriet. Resident AMɸ høstet fra immun kompetente dyr gir et representativt fenotype av makrofager som vil encounter den partikkel-baserte vaksinen in vivo. Heri beskriver vi protokollene som brukes til å høste og kultur AMɸ fra mus og undersøke aktivering fenotypen av makrofager etter behandling med polyanhydride nanopartikler in vitro.
Protocol
1. Høsting alveolære makrofager (AMɸ) fra Mus hjelp Lung lavage
- Bruk egnet personlig verneutstyr (PVU) som en labfrakk, engangshansker, og riktig øyebeskyttelse.
- Forbered komplett AMɸ (cAMɸ) medium før oppstart av innhøstingen. Legg 2,5 mL penicillin / streptomycin (penn / strep) løsning, 250 mL av β-mercaptoethanol (2-mercaptoethanol), og 25 ml av varme inaktivert fosteret storfe serum (FBS) til 222,25 ml Dulbelcco modifiserte Eagle Medium (DMEM). Filter-sterilisere cAMɸ medium med en 0,2 mikrometer porestørrelse flaske topp filter under vakuum.
- Avlive en frisk mus med CO 2 kvelning i en euthanization kammer. Selv om en C57BL / 6 mus (6-8 uker gamle) ble brukt i forbindelse med dette prosjektet, kan dette lunge lavage teknikken skal utføres på en stamme av mus. Ved hjelp av en komprimert gass sylinder, la gassen strømme inn i kammeret for 1 min før plassere musen i lmgult for å sikre at kammeret er fulladet med CO 2. Plasser musen i kammeret i minst ett minutt å avlive musen. I tillegg exsanguinate hver mus via hjertestans punktering som en fysisk metode for å bekrefte mus døden som beskrevet i 1.4.
- Lå musen på ryggen (dorsal side), spray med 70% etanol, finner sternum og, i en 30 graders vinkel fra buken, sette inn en 23 gauge nål (festet til en 1 ml sprøyte) om 50 mm inn i brysthula . Med riktig plassering av nålen, bør det være mulig å samle mellom 0,4 til 1 ml blod avhengig av størrelsen på musen. Undersøk dyret for opphør av vitale tegn.
- Plasser musen på lab benk slik at det blir liggende på magen (ventral side). Spray mus med 70% etanol for å sterilisere arbeidsmiljøet. Klem huden omtrent halvveis nedover ryggraden av musen. Bruk av disseksjon saks som har blitt sterilisert med 70% etanol, lage et lite snitt gjennom huden. </ Li>
- Grab huden på begge sider av snittet og dra huden i motsatt retning langs den kraniale-kaudal aksen av musen. Når gjort riktig, vil huden bli fjernet fra den underliggende kadaveret.
- Halsen på musen skal nå vise utsatte muskler og kjertler. Skjær forsiktig ut at vev og dra den mot den fremre av mus ved hjelp av tang, og dermed utsette strupehodet, luftrøret, og spiserøret av musen. Unngå å kutte vena jugularis eller halspulsåren.
- Luftrøret er nå synlig, og er gjenkjennelige som vev med brusk ringer rundt den. Delikat hold trachea med tang og forsiktig løft og skille luftrøret fra spiserøret, som ligger på dorsal side.
- Lag et lite snitt anterior til hvor man holder luftrøret men posterior til strupehodet. Snittet bør gjøres ved ca 45 ° graders vinkel. Heller ikke helt transekt luftrøret, da dette vil hindre den fra å trekke inni kroppens hulrom.
- Fyll en 1 cc sprøyte utstyrt med en Tom Cat kateter med steril PBS i forberedelse for å sette inn kateter i lumen av luftrøret. Hold trachea med pinsett og med hånden holder kateteret nær spissen for å øke kontroll og forsiktig sette den inn i tracheal innsnitt området. Forsiktig inn kateter inn i luftrøret ca 20 mm. Grip luftrøret som er rundt kateteret tube, frigjør den andre hånden.
- Bruk en 1 ml sprøyte utstyrt med kateter, forsiktig sette mot 0,75 ml romtemperatur, sterile PBS ned i lungene og deretter forsiktig aspirer PBS tilbake i sprøyten. Gjenta denne prosessen tre ganger mens eksternt masserer brystet. Fjern sprøyta fra kateteret og dispensere den lavage væske inn i en 15 ml sentrifugerør. Etter å fylle sprøyten med 0,75 ml av frisk PBS og koble sprøyten til kateteret, gjenta trinn 1,9 og 1,10 to ganger for hver mus. Fluid utvinning kan være delvis, få mindre enn VOLume infunderes. Hvis samle celler fra mer enn en mus, plassere 15 ml tube med høstes cellene på is inntil alle lunge lavages har blitt utført.
2. Behandling av Lung lavage AMɸ Harvest-
- Sentrifuger lunge lavage fluid på 250 x g i 10 min ved 4 ° C.
- Bruk steril teknikk, dekanter supernatanten til passende avfallsbeholder inne en biosikkerhet skap. Resuspender cellepelleten ved forsiktig raking sentrifugerøret over toppen av et reagensrør rack. Tilsett 1 mL cAMɸ medium for å resuspendere cellene.
- Oppsummere de cellene ved hjelp av en Coulter partikkelteller Z1 ved å pipettere 20 mL av celler i 10 ml Isoton II Diluent i Coulter telleren hetteglass. Tilsett 3 til 4 dråper Zap-oglobin II lytisk reagens i hetteglass, forsiktig invertsukker 3 til 4 ganger og deretter laste prøven hetteglasset på disken for å få en celle konsentrasjon. Pass på å programmere disken med en fortynning faktor på 2 x 10 4 for å visecellekonsentrasjonen som antall celler per ml.
- Fortynn cellene til 2,5 x 10 5 per ml hjelp cAMɸ medium.
- Tilsett 2 mL 2,5 x 10 5 celler / ml i hver brønn i en 6-brønnen vevskultur parabolen.
- For å berike for AMɸ og Inkuber kultur retter inne i en 37 ° C fuktet inkubator med en 5% CO 2 atmosfæren i 6 timer å tillate celler til å følge bunnen av brønnen. Forsiktig aspirer supernatanten som å ikke forstyrre heftende celler.
- Skyll brønner ved hjelp av steril PBS (kalsium og magnesium gratis) for å fjerne ikke-heftende celler og rusk. Tilsett 2 mL cAMɸ medium til hver brønn.
- Inkuber cellene natten inne i en 37 ° C fuktet inkubator med en 5% CO 2 atmosfæren før tilsetting av sentralstimulerende midler. Etter dette berikelse trinnet, ca 87% av cellene er positive for macrophage markører CD11b og F4/80 (figur 2c).
3. Tilsetting av Polyanhydride Nanopartikler og kontroll behandlinger
- Dikte nanopartikler via polyanhydride anti-løsemiddel nanoencapsulation 15. I denne prosessen er polymer oppløst i metylenklorid (4 ° C ved en konsentrasjon på 25 mg / ml) og utfelles i pentan (-20 ° C i forholdet 1:200 metylenklorid: pentan).
- Vei ut polyanhydride nanopartikler med sterilisert veie papir på en balanse som kan måle mikrogram beløp. Legg partikler til et 1,5 ml mikrosentrifuge tube.
- Resuspender nanopartikler i iskald cAMɸ. Beregningene er gjort slik at ikke mer enn 0,3 mL medium tilsettes hver brønn for å oppnå den ønskede konsentrasjon av nanopartikler. Hold resuspendert partikler på is inntil nanopartikler er lagt til kulturen godt.
- Før tilsetting nanopartikler til AMɸ kulturer, sonicate partikler ved hjelp av en benk topp sonicator med en microtip. Steriliser microtip ved sprøyting med 70% etanol og wiping med en steril Kimwipe før sonikator. Sonicate på 10-20 joule 30 til 45 s mens du holder røret på is. Observer nanopartikkel suspensjon makroskopisk. Hvis partikler ikke er tilstrekkelig spredt, la suspensjonen å sette på is for 1 til 2 min for å sikre at nanopartikler er under glassningstemperatur av polymer før sonicating igjen i 30 til 45 sek. Hensikten med denne sonikator trinnet er å tilstrekkelig spre nanopartikler, som 50:50 CPTEG: CPH nanopartikler har en tendens til å aggregere når de utsettes for en vandig miljø. Imidlertid kan noen små aggregater av nanopartikler fortsatt i suspensjon.
- Nanopartikkel suspensjon (tilstrekkelig spredt) bør holdes på is og brukes umiddelbart for å hindre for tidlig overflaten erosjon eller aggregering.
- Fjern kultur retter som inneholder AMɸ fra inkubatoren og plass i biosikkerhet skapet. Tilt plate på ca 45 graders vinkel og pipette av mengden av Medium som vil bli lagt til nanopartikkel suspensjon (det bør ikke overstige 0,3 ml). Ikke forstyrr de heftende cellene når du fjerner mediet.
- Vortex polyanhydride nanopartikkel suspensjonen kort før du legger det til de aktuelle brønnene. Pipettering mengden av nanopartikler suspensjon (ikke mer enn 0,3 ml) i den spesifikke brønnen (e), men ikke pipetter opp og ned for å blande. Denne handlingen kan koble heftende AMɸ fra brønnen. Partiklene vil bosette til bunnen av brønnen og kontakt cellene. For studiene er skissert i denne rapporten, var det endelig konsentrasjon av nanopartikler samtidig dyrkes med AMɸ 125 mikrogram / ml. Fortsett med påfølgende brønner og ønskede behandlingsgruppene. Inkluder positive og negative kontroll grupper, som medium bare og 200 ng / ml lipopolysakkarid (LPS) til utpekte brønner.
- Returner kultur retter til 37 ° C fuktet inkubator med en 5% CO 2 atmosfæren for 48 timer. Kinetiske studier i laborator våry har vist 48 timer for å være den optimale kulturen periode for å evaluere både celle-overflate markør uttrykk og cytokin sekresjon som det tillater tilstrekkelig tid for transkripsjon og proteinsyntese å skje. Selv om høyere nivåer av cytokiner akkumuleres i løpet av en lengre kultur periode (dvs. 72 timer), kan evaluere celleoverflaten markør uttrykk på dette tidspunkt bli forvirret av at bidraget de forhøyede nivåer av cytokiner. Endringene i overflaten markør uttrykk observert kan ikke være direkte knyttet til stimulering med nanopartikler selv.
4. Vurderer AMɸ aktivering ved hjelp flowcytometrisystemer
- Forbered fluorescens-aktivert celle sortering (FACS) buffer (0,1% natriumazid og 0,1% bovint serum albumin (BSA)) i 0,1 M fosfatbufret saltvann (pH 7,4) før høste av de gullbelagte makrofagene som har blitt sammen dyrket med nanopartikler or sentralstimulerende midler.
- Forbered arbeidet løsninger av blokkering buffer og monoklonale antistoffer. For å forberede blokken buffer, fortynne rotte IgG (Sigma) og anti-CD16/32 (eBioscience) til 1 mg / ml og 10 mikrogram / ml, henholdsvis i FACS buffer. Fortynn overflate markør antistoff panel i FACS buffer til enten produsenten anbefalte konsentrasjon eller brukeren optimalisert konsentrasjon. For de resultatene som presenteres i dette arbeidet, består overflaten markør panel av antistoffer mot MHC II, CD86, CD40 og CIRE (CD209). Anti-mus antistoffer mot macrophage markører F4/80 og CD11b er også inkludert i panelet å positivt identifisere macrophage fenotypen under dataanalysen. Hensyn må tas ved valg av antistoffer mot MHC II molekyler, som innavlede musestammer ofte varierer i sine MHC II haplotyper. Antistoffene utvalgte må reagere med spesifikke MHC alloantigens uttrykt av musen stamme av interesse.
- Etter 48 timers inkubering med nanopartikler og / ellersentralstimulerende midler, sted cellekultur retter på is i 20 min. For å fjerne heftende makrofagene fra platene, forsiktig skrape brønner med en 24 cm celle skrape.
- Bruk en 5 ml serologisk pipette, forsiktig aspirer cellene og medium opp og ned fem ganger til å generere en enkelt celle suspensjon. Pipettering innholdet i enkelte brønner i separate 5 ml polystyren rør for ikke å blande sammen celler fra ulike eksperimentelle behandlinger.
- Tilsett 2 mL FACS buffer i hvert rør.
- Sentrifugerør av celler i 250 x g ved 4 ° C i 10 min.
- Dekanter supernatanten og forsiktig resuspender cellepelleten i resterende væske etter raking rørene på toppen av et reagensrør rack.
- For å hindre ikke-spesifikk binding av monoklonale antistoffer, tilsett 10 mL av blokkering buffer (utarbeidet i 4.2) til hvert rør av celler. Vortex rør og inkuber på is i 30 min.
- Legg passende volum av utvannet monoklonale antistoffer til hvert rør og incubspiste i mørket på is i 15 min. Rør som inneholder prøver som skal analyseres bør få en kombinasjon av antistoffer av polycromatic panelet (forrige optimalisering av kombinasjonen av antistoffer bør utføres av individuelle labs). Ytterligere kontroll grupper bør inkluderes for å riktig sette oppkjøpet parametrene på strømningscytometeret, inkludert en tube av celler som ikke ble merket, og kompensasjon rør som tilsvarer merkede celler ved hjelp av hver enkelt farge separat. Slik korrekt innstilt portene for flowcytometrisk analyse, Fluorescens Minus One (FMO) kontrollene bør inkluderes under oppkjøpet. FMO kontrollene er celler som er merket med alle de fluorokromkonjugerte konjugerte antistoffer som brukes på panelet, bortsett fra en som er erstattet av sin respektive isotype kontroll. Positive og negative populasjoner (dvs. separate alikvoter av celler behandlet med en positiv kontroll stimulerende og medium alene) bør også inngå i FMO og kompensasjon kontrollrørene.
- Dekanter supernatanten og resuspender cellepelleten i resterende væske etter raking rørene på toppen av et reagensrør rack.
- Dersom antistoff panelet består av et antistoff ikke direkte konjugert til et fluorokromkonjugerte men er i stedet konjugert til biotin, er en fluorokromkonjugerte konjugert streptavidin for å visualisere overflaten markør. I dette trinnet, legger en passende volum av fortynnet fluorokromkonjugerte konjugert streptavidin og inkuberes i mørke i 15 minutter på isen. Som i 4.2, vil streptavidin fortynnes til en konsentrasjon anbefalt av produsenten eller til en optimalisert av brukeren. Dette trinnet er kun nødvendig for paneler inneholder biotinylated primære antistoffer.
- Utfør en vasketrinn som beskrevet i 4.10.
- Fortynn en passende mengde BD stabilisere festing 01:03 i avionisert vann. Tilsett 100 mL fortynnet fiksativ i hvert rør mens forsiktig vortexing å forhindre klumper av celler. Merket og fikset celler kan stabilt lagret i mørke ved 4 ° C i ca en uke før oppkjøpet på et strømningscytometer.
5. Representative data
Nanopartikler fabrikkert i trinn 3.1 hadde en gjennomsnittlig diameter på 163 ± 24 nm og en morfologi forenlig med den som oppnås i tidligere studier 5,16. Nanopartikler i løsning før og etter sonikator er vist i Figur 1 for å synliggjøre behovet for sonikator å sikre tilstrekkelig spredning av partikler. Flowcytometrisk analyse av høstes AMɸs innhentet via lunge lavage er vist i figur 2. Merking celler med en kombinasjon av anti-mus CD11b og anti-mus F4/80 antistoffer samt tilsvarende FMO kontrollene gjør for etablering bakgrunn merking, identifisere AMɸs og gating for videre analyse. Behandling av alveolære makrofager med polyanhydridenanopartikler øker aktiveringen som vist ved den økte gjennomsnittlig fluorescensintensitet av MHC II, CD40, CD86, og CIRE (figur 3).
. Figur 1 50:50 CPTEG: CPH nanopartikler før (A) og etter (B) 30 s av sonikator.
Figur 2. Flowcytometrisk analyse av høstes alveolære makrofager merket med (A) Alexa Fluor 700 anti-CD11b og PE-Cy7 FMO Control, (B) Alexa Fluor 700 FMO Kontroll og PE-Cy7 anti-F4/80 og (C ) Alexa Fluor 700 anti-CD11b og PE-Cy7 anti-F4/80. Tallet i øvre høyre hjørne viser prosentandelen av dobbel-positive celler.
Figur 3. Histograms viser en økning i fluorescens hensiktersity for overflate uttrykk for MHC II (A), CD40 (B), CD86 (C) og CIRE (D) etter co-kulturen i alveolære makrofager med 50:50 CPTEG: CPH polyanhydride nanopartikler for 48 hr. Histogrammer skildre resultater for AMɸ merket som FMO kontroller ( 
), Ubehandlet AMɸ merket med antistoffer mot alle celleoverflaten markører ( 
) Og AMɸ kultiveres med nanopartikler og merket med antistoffer mot alle celleoverflaten markører ( 
).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Polyanhydride nanopartikkel vaksine plattformer har vist effekt når det administreres intranasalt i endose regimer 5. Måling av aktivering av de fastboende phagocytic celle populasjoner i lungene forårsaket av denne vaksinen levering plattform tillater evaluering av sitt potensial evne til slutt fremme adaptive immunresponser.
Nærmere bestemt, høsting alveolære makrofager fra lunge lavage fluid, og behandle dem med ulike formuleringer av nanopartikler gir innsikt i evnene til ulike partikler kjemi for å aktivere makrofager, som fører til antigen presentasjon 6,8. I tillegg disse in vitro-studier er nyttige for å vurdere kapasiteten på disse partikulære adjuvant formuleringene for å aktivere alveolære makrofager før du tar fatt på større og mer komplekse in vivo studier. Eksperimenter bør alltid inneholde en positiv kontroll behandling for surface markør oppregulering, for eksempel LPS, en agonist av Toll-like receptor 4. Forsiktighet bør utvises i planleggingen eksperimenter før høsting alveolære makrofager som denne protokollen ikke kan produsere et tilstrekkelig antall celler som trengs for flere behandlinger i ett eksperiment. Lung lavages kan derfor må utføres på flere mus for å sikre tilstrekkelig antall celler (~ 5,0 x 10 5 celler per mus) for større eksperimenter med flere behandlingsgruppene. Lung lavage teknikker har også blitt rapportert for andre arter, og mengden av væske benyttes er proporsjonal med de artene som blir studert (dvs. mus lungekapasitet er 1 ml, er rotte lungekapasitet 10 ml og menneskelig lungekapasitet er 6 L 17.
Polyanhydride nanopartikler er formulert og lagres på et tørt pulver skjema for å hindre for tidlig overflaten erosjon. På grunn av statiske interaksjoner som fører til klumper av partiklene, er sonikator nødvendig før tillegg til cellekulturer. Dette sTEP gir jevn fordeling og fører til mer reproduserbare resultater. Kvantifisering av celleoverflaten markører på alveolære makrofager med flowcytometri kompliseres av sterke autofluorescens signaler. Denne hindringen kan overvinnes ved å optimalisere FACS antistoffkonsentrasjoner og polykromatisk fluorokromkonjugerte kombinasjoner, og flowcytometri fange parametre (dvs. bruk av kompensasjon kontroller). FMO kontroller tillate endringen av en fluorescerende parameter om gangen, er nyttige for å sette porter for hver antistoff og aktiverer riktig kvantifisering av celle overflate markør uttrykk. Forskjeller i de stammer av mus bør også vurderes i valget av antistoffer, særlig haplotype spesifisitet på MHC II.
Det er viktig å ha standardiserte metoder for å bestemme aktivering av antigenpresenterende celler i lungene, da dette vil i stor grad forenkle sammenligninger av romanen biomaterialer mellom ulike laboratorier og institusjoner. Generating konsistente bestander av alveolære makrofager gjennom metodene som presenteres her, gir optimale forhold for å få nyttige data vedrørende ulike formuleringer av nanopartikler og deres immunforsvar styrke potensielle.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke den amerikanske Army Medical Research og forsyningskommando Command (Grant Numbers W81XWH-09-1-0386 og W81XWH-10-1-0806) for økonomisk støtte og Dr. Shawn Rigby fra Iowa State University flowcytometrisystemer Facility for hans ekspert teknisk assistanse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cAM Media | |||
| DMEM | Cellgro | 15-013-CV | |
| 50 mM 2-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M3148-25ML | |
| Penicillin/Streptomycin 10,000 μg/ mL Solution | Cellgro | 30-002-CI | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| FACS Buffer | |||
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S671-500 | |
| Sodium phosphate | Fisher Scientific | MK7868500 | |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P217500 | |
| Potassium phosphate | Fisher Scientific | P288-200 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma-Aldrich | A7888 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Antibodies | |||
| Rat IgG | Sigma-Aldrich | I4341 | |
| Anti-Ms CD16/32 | eBioscience | 16-0161 | |
| Anti-Ms MHC II haplotype I-A/I-E, clone M5/114.15.2, conjugated to fluorescein isothiocyanate (FITC) | eBioscience | 11-5321 | |
| Anti-mouse CD86, clone GL-1, conjugated to allophycocyanin (APC)-Cy7 | Biolegend | 105030 | |
| Anti-mouse CD40, clone 1C10, conjugated to APC | eBioscience | 17-0401 | |
| Anti-mouse CD209, clone 5H10, conjugated to Biotin | eBioscience | 13-2091 | |
| Anti-mouse CD11b, clone M1/70, conjugated to Alexa Fluor 700 | eBioscience | 56-0112 | |
| Anti-mouse F4/80, clone BM8, conjugated to phyc–rythrin (PE)-Cy7 | eBioscience | 25-4801 | |
| PE-Texas red conjugated Streptavidin | BD Biosciences | 551487 | |
| Other Supplies and Reagents | |||
| Ethanol | Fisher Scientific | A405-20 | Used as 70% (v/v) |
| Compressed CO2 | Linweld | 16000060 | |
| 1 mL Syringe | BD Biosciences | 309659 | |
| Sovereign 3 ½" Fr Tom Catcatheter | Kendall | 703021 | |
| Biosafety Cabinet | NUAIRE | Series 22 | |
| Dissection Scissors | Fisher Scientific | 138082 | |
| Forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-8254 | |
| PBS, 1X without calcium and magnesium | Cellgro | 21-040-CM | |
| 15 mL Centrifuge Tubes with Screw Cap | VWR international | 21008-216 | |
| Six-well Tissue Culture Treated Plates | Costar | 3516 | |
| Plastic Tube Racks | Nalge Nunc international | 5970 | |
| Cell Scraper 24 cm | Techno Plastic Products | 99002 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube | Falcon BD | 352008 | |
| Pipet-aid XL | Drummond Scientific | 4-000-105 | |
| 10, 5, and 2 mL Pipettes | Fisher Scientific | 13-675 | |
| 200 and 10 μL micropipettors | Gilson Pipetman | F123601 | |
| 200 and 10 μL pipette tips | Fisher Scientific | 02-707 | |
| BD Stabilizing Fixative | BD Biosciences | 338036 | |
| Isoton II Diluent | Beckman Coulter Inc. | 8546719 | |
| Zap-oglobin II Lytic Reagent | Beckman Coulter Inc. | 7546138 | |
| Coulter Counter Polystyrene Vials | Beckman Coulter Inc. | 14310-684 | |
| Test Tubes | BD Biosciences | 352008 | |
| Equipment | |||
| Refrigerated Centrifuge | Labnet International | 50075040 | |
| Humidified Incubator CO2 | Nuaire | Model Autoflow 8500 | |
| FACSCanto Flow Cytometer | BD Biosciences | 338960 | |
| Coulter Particle Counter Z1 | Beckman Coulter Inc. | WS-Z1DUALPC | |
| Sonicator Liquid Processing Equipment with Microtip | Misonix | Model No. S-4000 | |
References
- Mallapragada, S. K., Narasimhan, B. Immunomodulatory biomaterials. Int. J. Pharm. 364, 265-271 (2008).
- Torres, M. P., Vogel, B. M., Narasimhan, B., Mallapragada, S. K. Synthesis and characterization of novel polyanhydrides with tailored erosion mechanisms. J. Biomed. Mater. Res. A. 76, 102-110 (2006).
- Lopac, S. K., Torres, M. P., Wilson-Welder, J. H., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. Effect of polymer chemistry and fabrication method on protein release and stability from polyanhydride microspheres. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 91, 938-947 (2009).
- Torres, M. P., Determan, A. S., Anderson, G. L., Mallapragada, S. K., Narasimhan, B. Amphiphilic polyanhydrides for protein stabilization and release. Biomaterials. 28, 108-116 (2007).
- Ulery, B. D. Design of a Protective Single-Dose Intranasal Nanoparticle-Based Vaccine Platform for Respiratory Infectious Diseases. PLoS ONE. 6, e17642 (2011).
- Petersen, L. K., Xue, L., Wannemuehler, M. J., Rajan, K., Narasimhan, B. The simultaneous effect of polymer chemistry and device geometry on the in vitro activation of murine dendritic cells. Biomaterials. 30, 5131-5142 (2009).
- Petersen, L. K. Activation of innate immune responses in a pathogen-mimicking manner by amphiphilic polyanhydride nanoparticle adjuvants. Biomaterials. 32, 6815-6822 (2011).
- Torres, M. P. Polyanhydride microparticles enhance dendritic cell antigen presentation and activation. Acta. Biomater. 7, 2857-2864 (2011).
- Kirby, A. C., Coles, M. C., Kaye, P. M. Alveolar macrophages transport pathogens to lung draining lymph nodes. J. Immunol. 183, 1983-1989 (2009).
- Barletta, K. E. Leukocyte compartments in the mouse lung: Distinguishing between marginated, interstitial, and alveolar cells in response to injury. J. Immunol. Methods. , (2011).
- Rubins, J. B. Alveolar macrophages: wielding the double-edged sword of inflammation. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 167, 103-104 (2003).
- Sun, K., Gan, Y., Metzger, D. W. Analysis of Murine Genetic Predisposition to Pneumococcal Infection Reveals a Critical Role of Alveolar Macrophages in Maintaining the Sterility of the Lower Respiratory Tract. Infect. Immun. 79, 1842-1847 (2011).
- Morimoto, K. Alveolar Macrophages that Phagocytose Apoptotic Neutrophils Produce Hepatocyte Growth Factor during Bacterial Pneumonia in Mice. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 24, 608-615 (2001).
- Gordon, S., Taylor, P. R. Monocyte and macrophage heterogeneity. Nat. Rev. Immunol. 5, 953-964 (2005).
- Ulery, B. D. Polymer chemistry influences monocytic uptake of polyanhydride nanospheres. Pharm. Res. 26, 683-690 (2009).
- Petersen, L. K., Sackett, C. K., Narasimhan, B. High-throughput analysis of protein stability in polyanhydride nanoparticles. Acta Biomater. 6, 3873-3881 (2010).
- Irvin, C. G., Bates, J. H. Measuring the lung function in the mouse: the challenge of size. Respir. Res. 4, 4 (2003).
