Summary
Здесь мы опишем протоколов для уборки мышиные альвеолярные макрофаги, которые проживают врожденные иммунные клетки в легких, а также изучение их активации в ответ на совместное культуры polyanhydride наночастиц.
Abstract
Биоразлагаемые наночастицы появились как универсальная платформа для разработки и внедрения новых интраназальной вакцины против дыхательных инфекционных заболеваний. В частности, polyanhydride наночастиц состоит из алифатических себациновой кислота (SA), ароматических 1,6-бис (р-carboxyphenoxy) гексана (CPH), или амфифильных 1,8-бис (р-carboxyphenoxy) -3,6-dioxaoctane (CPTEG) представлены уникальные оптом и кинетики эрозии поверхности 1,2 и может быть использована для медленно отпустить функциональной биомолекулы (например, белковых антигенов, иммуноглобулинов и др.) в естественных условиях 3,4,5. Эти наночастицы обладают также внутренней активности адъювантной, что делает их отличным выбором для платформы вакцинации 6,7,8.
Для выяснения механизмов, регулирующих активации врожденного иммунитета после вакцинации интраназально слизистой оболочки, необходимо оценить молекулярные и клеточные реакции антиген робижаясь клеток (БТР) отвечает за разработку иммунных реакций. Дендритные клетки являются основными БТР обнаружены при проведении дыхательных путей, а альвеолярные макрофаги (AMɸ) преобладают в легочной паренхимы 9,10,11. AMɸ очень эффективны в очистке легких патогенных микроорганизмов и клеточных обломков 12,13. Кроме того, этот тип клеток играет важную роль в транспортной микробных антигенов дренаж лимфатических узлов, что является важным первым шагом в начале адаптивного иммунного ответа 9. AMɸ также выражают повышенный уровень врожденных распознавания образов и мусорщик рецепторов, выделяют провоспалительных медиаторов, и премьер-наивные Т-клетки 12,14. Относительно чистой населения AMɸ (например, более 80%) могут быть легко получены с помощью легких промывание для изучения в лабораторных условиях. Резидент AMɸ собраны из иммунокомпетентных животные обеспечивают представитель фенотип макрофагов, которые будут encounteг частиц основе вакцины в естественных условиях. Здесь мы опишем протоколов, используемых для сбора и культуры AMɸ от мышей и исследовать фенотип активации макрофагов после лечения polyanhydride наночастиц в пробирке.
Protocol
1. Сбор альвеолярных макрофагов (AMɸ) с использованием мыши легких Промывание
- Использовать соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ), например, халат, одноразовые перчатки и надлежащей защиты глаз.
- Подготовить всю AMɸ (cAMɸ) среды до начала сбора урожая. Добавить 2,5 мл пенициллина / стрептомицина (ручка / стрептококк) раствор, 250 мкл β-меркаптоэтанол (2-меркаптоэтанол) и 25 мл тепла инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) к 222,25 мл изменения Eagle Dulbelcco в средней (DMEM). Фильтр-стерилизовать cAMɸ среде с использованием 0,2 мкм размер пор бутылка верхний фильтр под вакуумом.
- Усыпить здоровых мышей СО 2 удушья в euthanization камеры. Хотя C57BL / 6 мышей (6-8 недель) был использован для целей данного проекта, этот метод промывания легких могут быть выполнены на любом мышах. Использование цилиндров сжатым газом, дайте газа в камере в течение 1 мин до размещения мыши в глянтарь чтобы убедиться, что камера полностью заряжена с CO 2. Наведите в камере по крайней мере, одну минуту, чтобы усыпить мыши. Кроме того, обескровить каждой мыши с помощью пункции сердца как физический метод, чтобы подтвердить смерть мыши, как описано в 1.4.
- Положите мышь на спине (спинной стороне), спрей с 70% этанола, найдите грудины и на 30 градусов от живота, вставьте 23 иглы (прилагается к 1 мл шприц) около 50 мм в грудной полости . При правильном размещении иглы, должна быть возможность собрать от 0,4 до 1 мл крови в зависимости от размера мыши. Изучить животных для прекращения жизненных функций.
- Место мыши на лабораторном столе так, чтобы он лежал на животе (брюшная сторона). Спрей мышь с 70% этанола для стерилизации рабочей среды. Зажмите кожу примерно на полпути вниз по позвоночнику мыши. Использование рассечение ножницами, которые были стерилизованы 70% этанолом, делают небольшой разрез через кожу. </ LI>
- Захватите кожу с обеих сторон разреза и потяните кожу в противоположном направлении по черепно-хвостовые оси мыши. Если все сделано правильно, кожа будет удалена из основного каркаса.
- Шее мыши теперь должна показывать, подвергаются мышцы и желез. Аккуратно вырежьте, что ткань и вытяните ее на передней части мыши с помощью щипцов, тем самым подвергая гортани, трахеи, пищевода и мыши. Избегайте резки яремную вену или сонную артерию.
- Трахею теперь видны и опознать их как ткань с хрящевыми кольцами вокруг него. Деликатно провести трахеи пинцетом и аккуратно поднять и отделить трахеи с пищеводом, который находится на спинной стороне.
- Сделайте небольшой надрез на передней, где проводит в трахею, а позади гортани. Разрез должен быть примерно на 45 ° градусов. Кроме того, не полностью секут трахеи, так как это помешает ему втягивания вполости тела.
- Заполнить 1 мл шприца снабжены катетер Tom Cat стерильной PBS в рамках подготовки вставить катетер в просвет трахеи. Держите трахеи с помощью щипцов и с вашей стороны провести катетер близко к кончику, чтобы усилить контроль и аккуратно вставьте его в трахеи сайт разрез. Аккуратно вставить катетер в трахею около 20 мм. Возьмитесь за трахею, что составляет около катетера трубки, освобождая другой стороны.
- С помощью 1 мл шприц оснащен катетер, осторожно влить 0,75 мл комнатной температуры, стерильные PBS в легкие, а затем аккуратно аспирации назад PBS в шприц. Повторите эту процедуру три раза, внешний массаж грудной клетки. Отсоедините шприц от катетера и отказаться от промывной жидкости на 15 мл центрифужные пробирки. После заполнения шприца с 0,75 мл свежего PBS и снова шприц с катетера, повторите шаги 1.9 и 1.10 раза для каждой мыши. Жидкость восстановление может быть частичным, получая меньше В.О.Lume переплетаются. Если сбор клеток с более чем одним кликом, поместите 15 мл трубки с собранных клеток на льду, пока все легкие смывах были выполнены.
2. Обработка легких Промывание AMɸ урожая
- Центрифуга легких промывной жидкости при 250 х г в течение 10 мин при 4 ° C.
- Использование стерильных, сливают надосадочную в соответствующий контейнер для отходов внутри шкафа биобезопасности. Ресуспендируют клеточный осадок, аккуратно собрав центрифуге трубки в верхней части стойки пробирку. Добавить 1 мл средней cAMɸ для ресуспендирования клеток.
- Перечислять клеток с использованием частиц Coulter Counter Z1 с помощью пипетки 20 мкл клеток в 10 мл ISOTON II разведения в Coulter счетчик флаконе. Добавить 3 до 4 капель Зап-Оглобин II литических реагентов в флаконе, мягко инвертный от 3 до 4 раз, а затем загрузить пузырек на прилавок, чтобы получить концентрацию клеток. Будьте уверены, чтобы запрограммировать счетчик с фактором разбавления 2 х 10 4 просмотровконцентрации клеток, как число клеток на мл.
- Развести клеток до 2,5 х 10 5 мл в использовании cAMɸ среды.
- Внесите 2 мл 2,5 х 10 5 клеток / мл в каждую лунку 6-а блюдо культуры тканей.
- Для обогащения для AMɸ, инкубировать блюда культуры в 37 ° C увлажненном инкубаторе с 5% CO 2 атмосферы в течение 6 часов, чтобы позволить клеткам придерживаться нижней части скважины. Осторожно аспирации супернатант, чтобы не нарушить прилипшие клетки.
- Промыть лунки стерильные PBS (кальция и магния, бесплатно), чтобы удалить не соблюдают клеток и мусора. Добавить 2 мл средней cAMɸ в каждую лунку.
- Инкубируйте клетки в ночь на 37 ° C увлажненном инкубаторе с 5% CO 2 атмосферы перед добавлением стимуляторов. После этого обогащения шаг, около 87% клеток являются положительными для маркеров макрофагов CD11b и F4/80 (рис. 2).
3. Добавление PolyanhydridНаночастицы и электронного управления лечения
- Изготовление наночастиц через polyanhydride анти-растворителя nanoencapsulation 15. В ходе этого процесса, полимер растворяется в метиленхлориде (4 ° С в концентрации 25 мг / мл) и осаждаются в пентане (-20 ° С в соотношении 1:200 метиленхлорида пентан).
- Взвесить polyanhydride наночастиц использованием стерилизованного вес бумаги на балансе, которые могут точно измерить количество микрограмм. Добавить частиц 1,5 мл микроцентрифужных трубку.
- Ресуспендируют наночастиц в ледяной cAMɸ. Расчеты сделаны так, что не более 0,3 мл среды в каждую лунку добавляют для получения желаемой концентрации наночастиц. Держите ресуспендированного частиц на льду, пока наночастицы добавлены в культуру.
- Перед добавлением наночастиц AMɸ культуры, разрушать ультразвуком частиц с помощью sonicator настольный с микроострийных. Стерилизовать микроострийных путем распыления с 70% этанола и wipinг стерильной Kimwipe до ультразвука. Разрушать ультразвуком на 10-20 Дж от 30 до 45 с, держа трубку на льду. Соблюдайте суспензии наночастиц макроскопически. Если частицы не достаточно разошлись, позволяют подвески для установки на льду в течение от 1 до 2 минут, чтобы убедиться, что наночастицы находятся ниже температуры стеклования полимера до sonicating раз от 30 до 45 сек. Цель этого шага ультразвука адекватно разогнать наночастиц, 50:50 CPTEG: CPH наночастиц, как правило, совокупный при воздействии на водную среду. Тем не менее, небольшие агрегаты наночастиц могут оставаться в суспензии.
- Суспензии наночастиц (адекватно разгон) должны быть на льду и использовать немедленно, чтобы предотвратить преждевременное эрозии поверхности или агрегации.
- Удалить культуры блюд, содержащих AMɸ из инкубатора и место в шкафу биобезопасности. Наклона пластины примерно под углом 45 градусов и пипетки от количества медицинскиемкм, которая будет добавлена к суспензии наночастиц (она не должна превышать 0,3 мл). Не беспокоить прилипшие клетки при удалении среды.
- Vortex подвески polyanhydride наночастиц кратко перед добавлением его в соответствующие лунки. Пипетировать количество суспензии наночастиц (не более 0,3 мл) в конкретных и (ы), однако, не пипетировать вверх и вниз, чтобы смешаться. Это действие может отделить сторонник AMɸ из колодца. Частицы осядут на дно колодца и связаться с клетками. Для исследования, изложенные в этом докладе, конечная концентрация наночастиц совместно культивировали с AMɸ составила 125 мкг / мл. Перейдите с последующей скважины и желаемый группах. Включите положительные и отрицательные контрольные группы, такие как средний и только 200 нг / мл липополисахарида (ЛПС) в назначенный скважин.
- Вернуться культуры блюда 37 ° C увлажненном инкубаторе с 5% CO 2 атмосферы в течение 48 часов. Кинетические исследования в нашей laboratorу показали 48 часов, что оптимальный период для оценки культуры как на поверхности клеток экспрессия маркеров и цитокинов, так как позволяет достаточно времени для транскрипции и синтеза белка происходит. Несмотря на более высокие уровни цитокинов накапливаются в течение длительного периода культуры (например, 72 часов), оценка клеточной поверхности маркер выражение в этот момент времени могут быть озадачены вклад повышенные уровни цитокинов. Изменения в поверхностной экспрессии маркера наблюдается не может быть непосредственно связано с стимуляции наночастиц себя.
4. Оценка AMɸ активация с использованием проточной цитометрии
- Подготовить флуоресценции активированного сортировки клеток (FACS) буфера (0,1% азида натрия и 0,1% бычьего сывороточного альбумина (БСА)) в 0,1 М фосфатном буферном растворе (рН 7,4) до уборки покрытием макрофаги, которые были совместно культивировали с наночастицами оГ стимуляторов.
- Подготовка рабочих растворов блокирующим буфером и моноклональных антител. Чтобы подготовить блок буфера, развести крысы IgG (Sigma) и anti-CD16/32 (eBioscience) до 1 мг / мл и 10 мкг / мл, соответственно, в буфер FACS. Развести поверхности маркер антител панели буфера FACS либо производитель рекомендует концентрацию или пользователь оптимизированный концентрации. Для результатов, представленных в этой работе, поверхность панели маркеров состоит из антител против MHC II, CD86, CD40 и CIRE (CD209). Anti-мышиных антител против макрофагов маркеров F4/80 и CD11b также включены в панель точно определить фенотип макрофагов в процессе анализа данных. Необходимо соблюдать осторожность при выборе антитела против молекул MHC II, как инбредных линий мышей часто отличаются по своим МНС гаплотипа II. Антитела выбран должны реагировать со специфическими MHC alloantigens выраженное мыши штамма интерес.
- Через 48 ч инкубации с наночастицами и / илистимуляторы, место культуры клеток блюда на льду в течение 20 мин. Чтобы удалить сторонник макрофаги из плит, осторожно очистите скважин с 24 см клетки скребком.
- С помощью 5 мл пипетки серологические, мягко аспирации клеток и средних вверх и вниз в пять раз для получения суспензии отдельных клеток. Пипетировать содержание отдельных скважин на отдельные трубы 5 мл полистирола, чтобы не смешивать клетки от различных экспериментальных методов лечения.
- Добавить 2 мл буфера FACS в каждую пробирку.
- Пробирок клеток при 250 х г при 4 ° С в течение 10 мин.
- Переливать супернатант и осторожно ресуспендируют осадок клеток в остаточной жидкости загребать трубки в верхней части стойки пробирку.
- В целях предотвращения неспецифического связывания моноклональных антител, добавить 10 мкл блокирующего буфера (подготовлен в 4.2), в каждую пробирку клеток. Вихревые трубки и инкубировать на льду в течение 30 мин.
- Добавить соответствующий объем разбавленного моноклональных антител в каждую пробирку и incubели в темноте на льду в течение 15 мин. Трубы, которые содержат образцы для анализа должны получать комбинацию антитела polycromatic панели (предыдущие оптимизации сочетание антител должны быть выполнены отдельными лабораториями). Дополнительные контрольные группы должны быть включены, чтобы правильно установить параметры измерения на проточной цитометрии, в том числе трубы клеток, которые не были помечены, и компенсацию труб, которые соответствуют меченых клеток использования каждого отдельного цвета в отдельности. Чтобы правильно установить ворота для проточной цитометрии анализа флуоресценции минус один (FMO) управления должны быть включены во время приобретения. FMO контроля клетки помечены все флуорохромом конъюгированных антител, которые используются на панели, кроме одного, что заменить его соответствующим контролем изотипа. Положительные и отрицательные населения (например, отдельные порции клеток, обработанных с положительным стимулятором контроль и средних один), также должны быть включены в FMO и труб компенсации управления.
- Переливать супернатант и ресуспендируют осадок клеток в остаточной жидкости загребать трубки в верхней части стойки пробирку.
- Если антитела панель состоит из антител не непосредственно сопряженных с флуорохромом, но вместо того, сопряженных с биотином, флуорохромом сопряженных стрептавидин необходимы для визуализации поверхности маркер. В этом шаге, добавьте соответствующий объем разбавленного флуорохромом сопряженных стрептавидином и инкубировать в темноте в течение 15 минут на льду. Как и в 4.2, стрептавидин будет разбавлен до концентрации, рекомендованные производителем или на одну оптимизированную пользователем. Этот шаг необходим только для панелей содержащих биотинилированного первичных антител.
- Выполните мыть шаг, как описано в 4.10.
- Развести соответствующий объем BD стабилизации фиксирующий 1:3 в дистиллированной воде. Добавить 100 мкл разбавленного фиксатор в каждую пробирку, осторожно В.О.rtexing для предотвращения слипания клеток. Маркированный и фиксируется клетки могут быть стабильно хранить в темном месте при температуре 4 ° С в течение примерно одной недели до приобретения в проточной цитометрии.
5. Представитель данных
Наночастицы изготовлен в шаге 3,1 в среднем диаметр 163 ± 24 нм и морфологии в соответствии с полученным в предыдущих исследованиях 5,16. Наночастицы в растворе до и после обработки ультразвуком показано на рисунке 1, свидетельствуют о необходимости ультразвука для обеспечения адекватного разгона частиц. Проточной цитометрии анализа собранных AMɸs получены с помощью легких промывание показано на рисунке 2. Маркировка клетки с сочетанием антимышиным CD11b и анти-мышиных антител F4/80 а также соответствующие управления FMO позволяет создание фона маркировки, идентификации и AMɸs стробирования для последующего анализа. Лечение альвеолярных макрофагов с polyanhydrideнаночастиц увеличивает активацию как показали увеличение средней интенсивности флуоресценции MHC II, CD40, CD86, и CIRE (рис. 3).
На рис. 1 50:50 CPTEG: CPH наночастиц до (А) и после (б) 30 с ультразвуком.
Рисунок 2. Проточной цитометрии анализа собранных альвеолярных макрофагов помечены () Alexa Fluor 700 анти-CD11b и PE-Cy7 FMO управления, (B) Alexa Fluor 700 FMO управления и PE-Cy7 anti-F4/80 и (C ) Alexa Fluor 700 анти-CD11b и PE-Cy7 anti-F4/80. Число в правом верхнем углу представляет собой процент двойных положительных клеток.
Рисунок 3. Гистограммы демонстрирует увеличение интенсивности флуоресценцииплотность на поверхности выражение MHC II (A), CD40 (B), CD86 (C) и CIRE (D), после совместного культуре альвеолярных макрофагов с 50:50 CPTEG: CPH polyanhydride наночастиц в течение 48 часов. Гистограммы показывают результаты AMɸ помечены как FMO управления ( 
), Необработанные AMɸ меченные антитела против всех маркеров клеточной поверхности ( 
) И AMɸ культивировали с наночастицами и помечены с антителами против всех маркеров клеточной поверхности ( 
).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Polyanhydride платформы наночастиц вакцины показали эффективность при интраназально в одной дозе 5 схем. Измерение активации фагоцитарной житель популяции клеток в легких, индуцированных этой платформы доставки вакцины позволяет оценить его потенциальные возможности, в конечном счете способствовать адаптивного иммунного ответа.
В частности, сбор альвеолярные макрофаги легких жидкости промывания и относиться к ним с разными формулировками наночастиц дает представление о возможностях различных химических частиц для активации макрофагов, что приводит к презентации антигена 6,8. Кроме того, эти лабораторные исследования полезны для оценки потенциала этих составов частиц адъюванта для активации альвеолярных макрофагов, до начала работы на более крупные и сложные исследования в естественных условиях. Эксперименты всегда должна содержать положительные лечение управления surfacэлектронного маркера до регулирования, такие как LPS, агонист Toll-подобный рецептор 4. Следует проявлять осторожность при планировании экспериментов до уборки альвеолярных макрофагов, как этот протокол не может производить достаточное количество клеток, необходимых для многократных обработок в одном эксперименте. Легкие смывах может поэтому должны быть выполнены на нескольких мышей для обеспечения адекватного количества клеток (~ 5,0 х 10 5 клеток на мышь) для больших экспериментов с несколькими группами лечения. Методы легкого промывание Сообщается также для других видов, и количество жидкости, использовать пропорциональный вид изучается (т.е. способность мыши легких составляет 1 мл, емкость легких крыс составляет 10 мл и человеческого потенциала легкого 6 L 17.
Polyanhydride наночастиц сформулированы и храниться в сухом виде порошка для предотвращения преждевременного эрозии поверхности. Из-за статического взаимодействия, в результате слипания частиц, ультразвуком необходимо до того, чтобы клеточных культурах. Это сТЭЦ обеспечивает равномерное распределение и приводит к более воспроизводимые результаты. Количественная клеточных поверхностных маркеров на альвеолярных макрофагов с помощью проточной цитометрии осложняется сильной флуоресценции сигналов. Это препятствие может быть преодолено за счет оптимизации FACS концентрации антител, полихромные флуорохромом комбинаций и параметров потока цитометрии захвата (например, использование компенсации управления). FMO управления позволяют изменение одного параметра флуоресцентные в то время, являются полезными для установки ворот для каждого антитела и позволяет корректно количественное выражение клетки маркером поверхности. Различия в штаммов мышей следует также учитывать при выборе антител, в частности, гаплотип специфику MHC II.
Важно иметь стандартные методы для определения активации антиген представляющих клеток в легких, так как это значительно облегчит сравнение новых биоматериалов между различными лабораториями и институтами. Generating соответствует популяции альвеолярных макрофагов с помощью методов, представленных здесь, обеспечивают оптимальные условия для получения полезной информации о различных формулировок наночастиц и их иммунная укрепление потенциала.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить армии США медицинских исследований и материального Command (Грант номера W81XWH-09-1-0386 и W81XWH-10-1-0806) за финансовую поддержку и д-р Шон Ригби из Университета штата Айова фонда для проточной цитометрии его экспертной технической помощи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cAM Media | |||
| DMEM | Cellgro | 15-013-CV | |
| 50 mM 2-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M3148-25ML | |
| Penicillin/Streptomycin 10,000 μg/ mL Solution | Cellgro | 30-002-CI | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| FACS Buffer | |||
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S671-500 | |
| Sodium phosphate | Fisher Scientific | MK7868500 | |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P217500 | |
| Potassium phosphate | Fisher Scientific | P288-200 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma-Aldrich | A7888 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Antibodies | |||
| Rat IgG | Sigma-Aldrich | I4341 | |
| Anti-Ms CD16/32 | eBioscience | 16-0161 | |
| Anti-Ms MHC II haplotype I-A/I-E, clone M5/114.15.2, conjugated to fluorescein isothiocyanate (FITC) | eBioscience | 11-5321 | |
| Anti-mouse CD86, clone GL-1, conjugated to allophycocyanin (APC)-Cy7 | Biolegend | 105030 | |
| Anti-mouse CD40, clone 1C10, conjugated to APC | eBioscience | 17-0401 | |
| Anti-mouse CD209, clone 5H10, conjugated to Biotin | eBioscience | 13-2091 | |
| Anti-mouse CD11b, clone M1/70, conjugated to Alexa Fluor 700 | eBioscience | 56-0112 | |
| Anti-mouse F4/80, clone BM8, conjugated to phyc–rythrin (PE)-Cy7 | eBioscience | 25-4801 | |
| PE-Texas red conjugated Streptavidin | BD Biosciences | 551487 | |
| Other Supplies and Reagents | |||
| Ethanol | Fisher Scientific | A405-20 | Used as 70% (v/v) |
| Compressed CO2 | Linweld | 16000060 | |
| 1 mL Syringe | BD Biosciences | 309659 | |
| Sovereign 3 ½" Fr Tom Catcatheter | Kendall | 703021 | |
| Biosafety Cabinet | NUAIRE | Series 22 | |
| Dissection Scissors | Fisher Scientific | 138082 | |
| Forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-8254 | |
| PBS, 1X without calcium and magnesium | Cellgro | 21-040-CM | |
| 15 mL Centrifuge Tubes with Screw Cap | VWR international | 21008-216 | |
| Six-well Tissue Culture Treated Plates | Costar | 3516 | |
| Plastic Tube Racks | Nalge Nunc international | 5970 | |
| Cell Scraper 24 cm | Techno Plastic Products | 99002 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube | Falcon BD | 352008 | |
| Pipet-aid XL | Drummond Scientific | 4-000-105 | |
| 10, 5, and 2 mL Pipettes | Fisher Scientific | 13-675 | |
| 200 and 10 μL micropipettors | Gilson Pipetman | F123601 | |
| 200 and 10 μL pipette tips | Fisher Scientific | 02-707 | |
| BD Stabilizing Fixative | BD Biosciences | 338036 | |
| Isoton II Diluent | Beckman Coulter Inc. | 8546719 | |
| Zap-oglobin II Lytic Reagent | Beckman Coulter Inc. | 7546138 | |
| Coulter Counter Polystyrene Vials | Beckman Coulter Inc. | 14310-684 | |
| Test Tubes | BD Biosciences | 352008 | |
| Equipment | |||
| Refrigerated Centrifuge | Labnet International | 50075040 | |
| Humidified Incubator CO2 | Nuaire | Model Autoflow 8500 | |
| FACSCanto Flow Cytometer | BD Biosciences | 338960 | |
| Coulter Particle Counter Z1 | Beckman Coulter Inc. | WS-Z1DUALPC | |
| Sonicator Liquid Processing Equipment with Microtip | Misonix | Model No. S-4000 | |
References
- Mallapragada, S. K., Narasimhan, B. Immunomodulatory biomaterials. Int. J. Pharm. 364, 265-271 (2008).
- Torres, M. P., Vogel, B. M., Narasimhan, B., Mallapragada, S. K. Synthesis and characterization of novel polyanhydrides with tailored erosion mechanisms. J. Biomed. Mater. Res. A. 76, 102-110 (2006).
- Lopac, S. K., Torres, M. P., Wilson-Welder, J. H., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. Effect of polymer chemistry and fabrication method on protein release and stability from polyanhydride microspheres. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 91, 938-947 (2009).
- Torres, M. P., Determan, A. S., Anderson, G. L., Mallapragada, S. K., Narasimhan, B. Amphiphilic polyanhydrides for protein stabilization and release. Biomaterials. 28, 108-116 (2007).
- Ulery, B. D. Design of a Protective Single-Dose Intranasal Nanoparticle-Based Vaccine Platform for Respiratory Infectious Diseases. PLoS ONE. 6, e17642 (2011).
- Petersen, L. K., Xue, L., Wannemuehler, M. J., Rajan, K., Narasimhan, B. The simultaneous effect of polymer chemistry and device geometry on the in vitro activation of murine dendritic cells. Biomaterials. 30, 5131-5142 (2009).
- Petersen, L. K. Activation of innate immune responses in a pathogen-mimicking manner by amphiphilic polyanhydride nanoparticle adjuvants. Biomaterials. 32, 6815-6822 (2011).
- Torres, M. P. Polyanhydride microparticles enhance dendritic cell antigen presentation and activation. Acta. Biomater. 7, 2857-2864 (2011).
- Kirby, A. C., Coles, M. C., Kaye, P. M. Alveolar macrophages transport pathogens to lung draining lymph nodes. J. Immunol. 183, 1983-1989 (2009).
- Barletta, K. E. Leukocyte compartments in the mouse lung: Distinguishing between marginated, interstitial, and alveolar cells in response to injury. J. Immunol. Methods. , (2011).
- Rubins, J. B. Alveolar macrophages: wielding the double-edged sword of inflammation. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 167, 103-104 (2003).
- Sun, K., Gan, Y., Metzger, D. W. Analysis of Murine Genetic Predisposition to Pneumococcal Infection Reveals a Critical Role of Alveolar Macrophages in Maintaining the Sterility of the Lower Respiratory Tract. Infect. Immun. 79, 1842-1847 (2011).
- Morimoto, K. Alveolar Macrophages that Phagocytose Apoptotic Neutrophils Produce Hepatocyte Growth Factor during Bacterial Pneumonia in Mice. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 24, 608-615 (2001).
- Gordon, S., Taylor, P. R. Monocyte and macrophage heterogeneity. Nat. Rev. Immunol. 5, 953-964 (2005).
- Ulery, B. D. Polymer chemistry influences monocytic uptake of polyanhydride nanospheres. Pharm. Res. 26, 683-690 (2009).
- Petersen, L. K., Sackett, C. K., Narasimhan, B. High-throughput analysis of protein stability in polyanhydride nanoparticles. Acta Biomater. 6, 3873-3881 (2010).
- Irvin, C. G., Bates, J. H. Measuring the lung function in the mouse: the challenge of size. Respir. Res. 4, 4 (2003).
