Summary
Aquí se describen los protocolos para la recogida de los macrófagos alveolares murinos, que residan las células inmunes en el pulmón, y el examen de su activación en respuesta a la co-cultivo con nanopartículas polianhídrido.
Abstract
Nanopartículas biodegradables se han convertido en una plataforma versátil para el diseño e implementación de nuevas vacunas intranasales contra enfermedades infecciosas respiratorias. Específicamente, polianhídrido nanopartículas compuesto del ácido alifático sebácico (SA), la aromático 1,6-bis (p-carboxifenoxi) hexano (LPA), o la anfifílico 1,8-bis (p-carboxifenoxi) -3,6-dioxaoctano (CPTEG) muestran granel único y cinética de la superficie de erosión 1,2 y puede ser explotado para liberar lentamente biomoléculas funcionales (por ejemplo, antígenos proteicos, inmunoglobulinas, etc) in vivo 3,4,5. Estas nanopartículas tienen también actividad adyuvante intrínseca, por lo que una excelente elección para una plataforma de administración de la vacuna 6,7,8.
Con el fin de dilucidar los mecanismos que regulan la activación de la inmunidad innata la mucosa nasal después de la vacunación, se debe evaluar las respuestas moleculares y celulares del antígeno pcélulas resentidos (APC), responsables de iniciar la respuesta inmune. Las células dendríticas son las CPA principales que se encuentran en la realización de las vías respiratorias, mientras que los macrófagos alveolares (AMɸ) predominan en el parénquima pulmonar 9,10,11. AMɸ son altamente eficientes en la limpieza de los pulmones de los microbios patógenos y los residuos celulares 12,13. Además, este tipo de células juega un papel importante en el transporte de antígenos microbianos a los ganglios linfáticos de drenaje, que es un primer paso importante en la iniciación de una respuesta inmune adaptativa 9. AMɸ también expresan niveles elevados de reconocimiento de patrones innatos y los receptores scavenger, los mediadores pro-inflamatorios secretan, y las células T vírgenes 12,14. Una población relativamente pura de AMɸ (por ejemplo, superior al 80%) se puede obtener fácilmente a través de lavado pulmonar para su estudio en el laboratorio. Residente AMɸ recogerá a partir de animales inmunes competentes faciliten un fenotipo representante de los macrófagos que encounter la vacuna basada en partículas in vivo. Aquí se describen los protocolos utilizados para la cosecha y la cultura AMɸ de ratones y examinar el fenotipo de la activación de los macrófagos después del tratamiento con nanopartículas polianhídrido in vitro.
Protocol
1. La recolección macrófagos alveolares (AMɸ) del ratón usando lavado pulmonar
- Use equipos de protección personal (EPP), como una bata de laboratorio, guantes desechables y protección ocular adecuada.
- Preparar completa AMɸ (cAMɸ) medio antes del inicio de la cosecha. Añadir 2,5 ml de penicilina / estreptomicina (penicilina / estreptomicina) solución, 250 l de β-mercaptoetanol (2-mercaptoetanol), y 25 ml de inactivado por calor suero fetal bovino (SFB) a 222,25 ml de medio modificado Dulbelcco de Eagle (DMEM). Filtro de esterilizar a medio cAMɸ con un 0,2 micras de tamaño de poro botella de filtro superior al vacío.
- La eutanasia de un ratón sano por asfixia de CO 2 en una cámara de la eutanasia. Aunque un ratón C57BL / 6 (6-8 semanas de edad) se utilizó para los fines de este proyecto, esta técnica lavado pulmonar se puede realizar en cualquier cepa de ratón. El uso de un cilindro de gas comprimido, permitir el flujo de gas en la cámara durante 1 min antes de colocar el ratón en el CHámbar para asegurar que la cámara está completamente cargada con CO 2. Coloque el ratón en la cámara por lo menos durante un minuto para eutanasia el ratón. Además, exsanguinate cada ratón a través de punción cardíaca como un método físico para confirmar la muerte del ratón como se describe en 1,4.
- Coloque el cursor sobre la espalda (dorso), rocíe con etanol al 70%, localizar el esternón y, en un ángulo de 30 grados desde el abdomen, inserta una aguja de calibre 23 (unida a una jeringa de 1 ml) de unos 50 mm en la cavidad torácica . Con la colocación correcta de la aguja, debería ser posible recoger entre 0,4 a 1 ml de sangre en función del tamaño del ratón. Examinar el animal para el cese de los signos vitales.
- Coloque el ratón sobre el banco de laboratorio por lo que está acostado sobre su abdomen (parte ventral). Aerosol ratón con etanol al 70% para esterilizar el medio ambiente de trabajo. Pellizque la piel a mitad de la columna vertebral del ratón. Con una tijera de disección que han sido esterilizadas con etanol al 70%, hará una pequeña incisión a través de la piel. </ Li>
- Agarra la piel en ambos lados de la incisión y tirar de la piel en direcciones opuestas a lo largo del eje cráneo-caudal del ratón. Cuando se hace correctamente, la piel se separan del cuerpo subyacente.
- El cuello del ratón ahora debe mostrar los músculos expuestos y las glándulas. Corte con cuidado de que el tejido y tire de ella hacia la parte anterior del mouse el uso de fórceps, con lo que la exposición de la laringe, la tráquea y el esófago del ratón. Evite cortar la vena yugular o la arteria carótida.
- La tráquea es ahora visible y se puede identificar como el tejido con anillos cartilaginosos que la rodean. Delicadamente mantenga la tráquea con fórceps y suavemente levantar y separar la tráquea desde el esófago, que está situado en el lado dorsal.
- Haga una pequeña incisión anterior, donde se sostiene la tráquea, pero por detrás de la laringe. La incisión debe hacerse aproximadamente a un ángulo de 45 ° grado. Además, no completamente seccionar la tráquea, ya que esto evitará que se retraiga enla cavidad del cuerpo.
- Llenar una jeringa de 1 cc equipado con un catéter gato Tom con PBS estéril en preparación para insertar el catéter en el lumen de la traquea. Mantenga la tráquea con unas pinzas y con la mano sujetando el catéter cerca de la punta para aumentar el control y suavemente insértelo en el sitio de la incisión traqueal. Suavemente insertar catéter en la tráquea alrededor de 20 mm. Sujetar la tráquea que es alrededor del tubo de catéter, liberando la otra mano.
- Con una jeringa de 1 ml equipado con el catéter, fundan suavemente con 0,75 ml de la temperatura ambiente, PBS estéril en los pulmones y luego suavemente la parte posterior aspiración de PBS en la jeringa. Repita este proceso tres veces, mientras que el exterior de masaje en el pecho. Desconectar la jeringa del catéter y dispensar el líquido de lavado en un tubo de centrífuga de 15 ml. Después de llenar la jeringa con 0,75 ml de PBS fresco y volver a conectar la jeringa al catéter, repetir los pasos 1,9 y 1,10 veces para cada ratón. La recuperación del fluido puede ser parcial, obteniendo menos de la VOlume infundido. Si la recolección de células procedentes de más de un ratón, colocar el tubo de 15 ml con las células recolectadas en hielo hasta que todos los lavados pulmonares se han realizado.
2. El tratamiento de lavado pulmonar AMɸ Cosecha
- Centrifugar el líquido de lavado pulmonar a 250 x g durante 10 min a 4 ° C.
- Utilizando una técnica estéril, el sobrenadante se decanta en un recipiente apropiado para desechos dentro de un gabinete de bioseguridad. Resuspender el botón celular rastrillando suavemente el tubo de centrífuga a través de la parte superior de un bastidor de tubo de ensayo. Añadir 1 ml de medio de cAMɸ para volver a suspender las células.
- Enumerar las células utilizando un Partículas Coulter Counter Z1 pipeteando 20 l de células en 10 ml de Isoton II diluyente en vial contador Coulter. Agregue 3 a 4 gotas de Zap-oglobin reactivo II lítico en el vial, los tiempos de invertir suavemente 3 a 4 y luego cargar la cubeta de análisis sobre el mostrador para obtener una concentración celular. Asegúrese de programar el contador con un factor de dilución de 2 x 10 4 para mostrar lapila de concentración como el número de células por ml.
- Diluir las células de 2,5 x 10 5 por ml usando medio cAMɸ.
- Dispensar 2 ml de 2,5 x 10 5 células / ml en cada pocillo de una placa de tejido 6-pocillos.
- Para enriquecer para AMɸ, las placas de cultivo se incuban dentro de un 37 ° C incubadora humidificada con un 5% de CO 2 ambiente durante 6 horas para permitir que las células se adhieran a la parte inferior del pozo. Aspire con cuidado el sobrenadante y no perturbar las células adherentes.
- Lavar los pocillos con PBS estéril (libre de calcio y magnesio) para eliminar las células no adherentes y escombros. Añadir 2 ml de medio de cAMɸ a cada pocillo.
- Se incuban las células durante la noche dentro de un 37 ° C incubadora humidificada con un 5% de CO 2 ambiente antes de la adición de estimulantes. Después de esta etapa de enriquecimiento, aproximadamente el 87% de las células son positivos para el macrófago marcadores CD11b y F4/80 (figura 2c).
3. La adición de PolyanhydridLas nanopartículas y tratamientos electrónicos de control
- Fabricar las nanopartículas a través de polianhidrido antidisolvente nanoencapsulación 15. En este proceso, el polímero se disuelve en cloruro de metileno (4 ° C a una concentración de 25 mg / ml) y se precipitó en pentano (-20 ° C en un cloruro de metileno relación 1:200: pentano).
- Pesar utilizando nanopartículas polianhídrido esterilizada peso del papel en el equilibrio que se puede medir con precisión las cantidades de microgramos. Añadir partículas a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
- Volver a suspender las nanopartículas en el hielo frío cAMɸ. Los cálculos se realizan de tal manera que no más de 0,3 ml de medio se añade a cada pocillo para obtener la concentración deseada de nanopartículas. Mantener las partículas resuspendidas en hielo hasta que las nanopartículas se añade al cultivo así.
- Antes de la adición de las nanopartículas a los cultivos AMɸ, sonicar partículas usando un sonicador parte superior del banco con una micropunta. Esterilizar micropunta por pulverización con 70% de etanol y wiping con una Kimwipe estéril antes de sonicación. Someter a ultrasonidos a 10-20 julios de 30 a 45 s mientras se mantiene el tubo en hielo. Observar macroscópicamente suspensión de nanopartículas. Si las partículas no están lo suficientemente dispersa, permitir la suspensión para ajustar en hielo durante 1 a 2 minutos para asegurar que las nanopartículas están por debajo de la temperatura de transición vítrea del polímero antes de sonicación de nuevo durante 30 a 45 segundos. La intención de este paso es sonicación para dispersar adecuadamente las nanopartículas, como la CPTEG 50:50: nanopartículas CPH tienden a agregarse cuando se expone a un ambiente acuoso. Sin embargo, algunos pequeños agregados de nanopartículas todavía pueden permanecer en la suspensión.
- Suspensión de nanopartículas (dispersa adecuadamente) debe mantenerse en hielo y se utiliza de inmediato para evitar la erosión superficial prematura o agregación.
- Retire las placas de cultivo que contienen la AMɸ de la incubadora y el lugar en el gabinete de seguridad de la biotecnología. Placa de inclinación en un ángulo de 45 grados y la pipeta de la cantidad de medicinaum que se añade a la suspensión de nanopartículas (no debe exceder de 0,3 ml). No molestar a las células adherentes al quitar del medio.
- Vórtice de la suspensión de nanopartículas polianhidrido brevemente antes de añadir a los pocillos correspondientes. Pipetear la cantidad de suspensión de nanopartículas (no más de 0,3 ml) en el pozo (s) específico, sin embargo, no pipetear arriba y hacia abajo para mezclar. Esta acción podría separar el adherente AMɸ del pozo. Las partículas se depositan en el fondo del pozo y en contacto con las células. Para los estudios indicados en este informe, la concentración final de nanopartículas de co-cultivadas con la AMɸ fue de 125 mg / ml. Proceda con los pozos posteriores y deseadas grupos de tratamiento. Incluir a los grupos de control positivas y negativas, como único medio y 200 ng / ml de lipopolisacárido (LPS) a los pozos designados.
- Volver las placas de cultivo a los 37 ° C incubadora humidificada con un 5% de CO2 la atmósfera durante 48 h. Los estudios cinéticos en nuestro laboratory han demostrado ser de 48 horas para el período de cultivo óptimo para evaluar tanto la superficie celular marcador expresión y secreción de citoquinas, ya que permite un tiempo adecuado para la transcripción y la síntesis de proteínas que se produzca. A pesar de mayores niveles de citocinas se acumulan durante un período de cultivo prolongado (es decir, 72 horas), la evaluación de la superficie celular expresión de los marcadores en este punto en el tiempo puede ser confundida por la contribución de los niveles elevados de citoquinas. Los cambios en la expresión de superficie marcador de observarse no pueden ser directamente atribuibles a la estimulación con las mismas nanopartículas.
4. La evaluación de la activación AMɸ mediante citometría de flujo
- Preparar activado por fluorescencia de células de clasificación (FACS) tampón (0,1% de azida sódica y 0,1% de albúmina sérica bovina (BSA)) en 0,1 M tampón fosfato salino (pH 7,4) antes de la cosecha de los macrófagos chapados que han sido co-cultivadas con nanopartículas or estimulantes.
- Preparar las soluciones de trabajo de la memoria intermedia de bloqueo y los anticuerpos monoclonales. Para preparar el tampón bloque, diluir IgG de rata (Sigma) y anti-CD16/32 (eBioscience) a 1 mg / ml y 10 mg / ml, respectivamente, en tampón FACS. Diluir marcador superficie del panel de anticuerpos en tampón FACS ya sea a la concentración fabricante recomienda o la concentración de usuario optimizada. Por los resultados presentados en este trabajo, el panel de marcadores de superficie se compone de anticuerpos contra MHC II, CD86, CD40 y CIRE (CD209). Anti-ratón anticuerpos contra los marcadores F4/80 macrófagos y CD11b también están incluidos en el panel para identificar positivamente el fenotipo de macrófagos durante el análisis de datos. Se debe tener cuidado al seleccionar anticuerpos contra moléculas MHC II, como puras cepas de ratón a menudo difieren en sus haplotipos MHC II. Los anticuerpos seleccionados deben reaccionar con los aloantígenos específicos MHC expresadas por su cepa de ratón de interés.
- Después de 48 h de incubación con nanopartículas y / oestimulantes, coloque los platos de cultivo de células en hielo durante 20 minutos. Para eliminar los macrófagos adherentes de las placas, raspe suavemente pozos con un rascador de células de 24 cm.
- Utilizando una pipeta serológica de 5 ml, suavemente aspirar las células y el medio arriba y hacia abajo cinco veces para generar una suspensión de células individuales. Pipetear el contenido de los pocillos individuales en diferentes tubos de 5 ml de poliestireno para que no se mezclan las células de diferentes tratamientos experimentales.
- Añadir 2 ml de tampón FACS a cada tubo.
- Centrifugar los tubos de células a 250 x g a 4 ° C durante 10 min.
- Se decanta el sobrenadante y resuspender el pellet de células suavemente en el líquido residual con un rastrillo de los tubos en la parte superior de un bastidor de tubo de ensayo.
- Con el fin de prevenir no específicos de unión de los anticuerpos monoclonales, añadir 10 l de tampón de bloqueo (preparado en el 4,2) a cada tubo de células. Tubos Vortex e incubar en hielo durante 30 minutos.
- Añadir un volumen apropiado de anticuerpos monoclonales diluidos a cada tubo y incubComimos en la oscuridad en hielo durante 15 minutos. Los tubos que contienen las muestras a analizar deben recibir la combinación de anticuerpos del panel polycromatic (optimización anterior de la combinación de anticuerpos debe ser realizado por laboratorios individuales). Otros grupos de control se deben incluir para configurar correctamente los parámetros de adquisición en el citómetro de flujo, incluyendo un tubo de células que no fueron etiquetados, y los tubos de compensación que corresponden a las células marcadas con cada uno de un solo color por separado. Para configurar correctamente las puertas para el análisis de citometría de flujo, la fluorescencia Minus One (FMO) los controles deben ser incluidos durante la adquisición. Controles FMO son células marcadas con todos los anticuerpos conjugados con fluorocromo que se utilizan en el panel excepto uno que se sustituye por su isotipo de control respectivo. Poblaciones positivos y negativos (es decir, partes alícuotas separadas de las células tratadas con un control positivo y estimulante medio solo) también deben ser incluidos en FMO y tubos de compensación de control.
- Se decanta el sobrenadante y resuspender el pellet de células en el líquido residual con un rastrillo de los tubos en la parte superior de un bastidor de tubo de ensayo.
- Si el panel de anticuerpos consta de un anticuerpo no conjugado directamente a un fluorocromo sino que es conjugado con biotina, un fluorocromo estreptavidina conjugada es necesaria para visualizar el marcador de superficie. En este paso, añadir un volumen apropiado de la solución diluida fluorocromo conjugado estreptavidina y se incuba en la oscuridad durante 15 minutos en hielo. Como en 4,2, la estreptavidina se diluye a una concentración recomendada por el fabricante o para una optimizada por el usuario. Este paso sólo es necesario para los paneles que contienen biotina anticuerpos primarios.
- Realizar una etapa de lavado como se describe en 4,10.
- Diluir un volumen apropiado de BD estabilizar 01:03 fijador en agua desionizada. Añadir 100 ml de fijador diluido a cada tubo mientras que suavemente vortexing para evitar la aglutinación de las células. Células marcadas y fijadas pueden ser establemente almacenada en la oscuridad a 4 ° C durante aproximadamente una semana antes de la adquisición en un citómetro de flujo.
5. Los datos representativos
Las nanopartículas fabricadas en el paso 3,1 tenía un diámetro medio de 163 ± 24 nm y una morfología consistente con la obtenida en estudios previos 5,16. Nanopartículas en solución antes y después de la sonicación se muestra en la Figura 1 para demostrar la necesidad de sonicación para asegurar la dispersión adecuada de las partículas. El análisis de citometría de flujo de AMɸs cosechadas obtenidos mediante lavado pulmonar se muestra en la Figura 2. Etiquetado células con una combinación de CD11b anti-ratón y anti-ratón F4/80 anticuerpos, así como los correspondientes controles FMO permite establecer el etiquetado de fondo, identificando AMɸs y gating para su posterior análisis. El tratamiento de los macrófagos alveolares con polianhídridonanopartículas mejora de activación tal como se muestra por la mayor intensidad de fluorescencia media del MHC II, CD40, CD86, y CIRE (Figura 3).
. Figura 1 50:50 CPTEG: CPH nanopartículas antes de (A) y después (B) 30 s de sonicación.
Figura 2. Análisis de citometría de flujo de cosechados los macrófagos alveolares marcados con (A) Alexa Fluor 700 anti-CD11b y el control de PE-Cy7 FMO, (B) Alexa Fluor 700 FMO de control y el anti-F4/80 PE-Cy7 y (C ) Alexa Fluor 700 y anti-CD11b anti-F4/80 PE-Cy7. El número en la esquina superior derecha representa el porcentaje de células doble positivas.
Figura 3. Histogramas demostrando un aumento de la intensidad de la fluorescenciadad para la expresión de superficie de MHC II (A), CD40 (B), CD86 (C) y CIRE (D) después de co-cultivo de macrófagos alveolares con CPTEG 50:50: polianhidrido CPH nanopartículas durante 48 horas. Los histogramas representan los resultados de AMɸ etiquetados como controles (FMO 
), No se trata AMɸ marcadas con anticuerpos contra todos los marcadores de la superficie celular ( 
) Y AMɸ cultivadas con nanopartículas y marcadas con anticuerpos contra todos los marcadores de la superficie celular ( 
).
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Discussion
Polianhidrido plataformas de la vacuna de nanopartículas han demostrado su eficacia cuando se administra por vía intranasal en los regímenes de dosis única 5. Medición de la activación de las poblaciones de células fagocíticas residentes en los pulmones inducidas por esta plataforma de administración de vacunas permite la evaluación de su capacidad potencial para promover en última instancia la respuesta inmune adaptativa.
En concreto, la cosecha macrófagos alveolares a partir del líquido de lavado pulmonar y tratarlos con diferentes formulaciones de las nanopartículas proporciona información detallada sobre las capacidades de las partículas químicas diferentes para activar a los macrófagos, dando lugar a la presentación de antígenos 6,8. Además, estos estudios in vitro son útiles para evaluar la capacidad de estas formulaciones de partículas adyuvantes para activar los macrófagos alveolares antes de embarcarse en mayores y más complejos los estudios in vivo. Los experimentos deben contener siempre un tratamiento de control positivo de surfactantese marcador de la regulación, tales como LPS, un agonista de los receptores Toll-like 4. Se debe tener cuidado en la planificación de experimentos antes de la cosecha los macrófagos alveolares ya que este protocolo no puede producir un número adecuado de células necesarias para los tratamientos múltiples en un solo experimento. Lavados pulmonares por lo tanto, puede ser necesario llevar a cabo en varios ratones para garantizar un número adecuado de células (~ 5,0 × 10 5 células por ratón) para las grandes experimentos con grupos de tratamiento mucho más. Técnicas de lavado pulmonar también se ha informado para otras especies, y la cantidad de fluido utilizado es proporcional a las especies estudiadas (es decir, la capacidad pulmonar ratón es de 1 mL, la capacidad de pulmón de rata es de 10 ml y la capacidad pulmonar humana es 6 L 17.
Nanopartículas polianhídrido se formulan y se almacena en forma de polvo seco para evitar la erosión superficial prematura. Debido a las interacciones estáticas que resultan en la aglutinación de las partículas, sonicación es necesario antes de la adición a los cultivos celulares. Esto step permite una distribución uniforme y conduce a resultados más reproducibles. La cuantificación de marcadores de superficie celular de los macrófagos alveolares utilizando citometría de flujo se ve complicada por fuertes señales de autofluorescencia. Este obstáculo se puede superar mediante la optimización de las concentraciones de anticuerpos, FACS policromáticos combinaciones de fluorocromos y los parámetros de captura de citometría de flujo (es decir, el uso de los controles de compensación). Controles FMO permitir el cambio de un parámetro fluorescente a la vez, son útiles para el establecimiento de las puertas para cada anticuerpo y permitir la cuantificación correcta de expresión del marcador de superficie celular. Las diferencias en las cepas de ratones también se debe considerar en la selección de anticuerpos, en particular la especificidad haplotipo del MHC II.
Es importante contar con métodos estandarizados para determinar la activación de las células presentadoras de antígenos en el pulmón, ya que esto facilitará en gran medida la comparación de nuevos biomateriales entre los diferentes laboratorios e instituciones. Generating poblaciones consistentes de los macrófagos alveolares a través de los métodos que aquí se presentan, proporcionan las condiciones óptimas para la obtención de datos útiles sobre las diferentes formulaciones de nanopartículas y su potencial de mejorar la inmunidad.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a Ejército de los EE.UU. de Investigación Médica y Material de comandos (números de concesión W81XWH-09-1-0386 y W81XWH-10-1-0806) para el apoyo financiero y el Dr. Shawn Rigby del Fondo Estatal de Iowa Citometría de flujo para la Universidad su experto en asistencia técnica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cAM Media | |||
| DMEM | Cellgro | 15-013-CV | |
| 50 mM 2-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M3148-25ML | |
| Penicillin/Streptomycin 10,000 μg/ mL Solution | Cellgro | 30-002-CI | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| FACS Buffer | |||
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S671-500 | |
| Sodium phosphate | Fisher Scientific | MK7868500 | |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P217500 | |
| Potassium phosphate | Fisher Scientific | P288-200 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma-Aldrich | A7888 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Antibodies | |||
| Rat IgG | Sigma-Aldrich | I4341 | |
| Anti-Ms CD16/32 | eBioscience | 16-0161 | |
| Anti-Ms MHC II haplotype I-A/I-E, clone M5/114.15.2, conjugated to fluorescein isothiocyanate (FITC) | eBioscience | 11-5321 | |
| Anti-mouse CD86, clone GL-1, conjugated to allophycocyanin (APC)-Cy7 | Biolegend | 105030 | |
| Anti-mouse CD40, clone 1C10, conjugated to APC | eBioscience | 17-0401 | |
| Anti-mouse CD209, clone 5H10, conjugated to Biotin | eBioscience | 13-2091 | |
| Anti-mouse CD11b, clone M1/70, conjugated to Alexa Fluor 700 | eBioscience | 56-0112 | |
| Anti-mouse F4/80, clone BM8, conjugated to phyc–rythrin (PE)-Cy7 | eBioscience | 25-4801 | |
| PE-Texas red conjugated Streptavidin | BD Biosciences | 551487 | |
| Other Supplies and Reagents | |||
| Ethanol | Fisher Scientific | A405-20 | Used as 70% (v/v) |
| Compressed CO2 | Linweld | 16000060 | |
| 1 mL Syringe | BD Biosciences | 309659 | |
| Sovereign 3 ½" Fr Tom Catcatheter | Kendall | 703021 | |
| Biosafety Cabinet | NUAIRE | Series 22 | |
| Dissection Scissors | Fisher Scientific | 138082 | |
| Forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-8254 | |
| PBS, 1X without calcium and magnesium | Cellgro | 21-040-CM | |
| 15 mL Centrifuge Tubes with Screw Cap | VWR international | 21008-216 | |
| Six-well Tissue Culture Treated Plates | Costar | 3516 | |
| Plastic Tube Racks | Nalge Nunc international | 5970 | |
| Cell Scraper 24 cm | Techno Plastic Products | 99002 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube | Falcon BD | 352008 | |
| Pipet-aid XL | Drummond Scientific | 4-000-105 | |
| 10, 5, and 2 mL Pipettes | Fisher Scientific | 13-675 | |
| 200 and 10 μL micropipettors | Gilson Pipetman | F123601 | |
| 200 and 10 μL pipette tips | Fisher Scientific | 02-707 | |
| BD Stabilizing Fixative | BD Biosciences | 338036 | |
| Isoton II Diluent | Beckman Coulter Inc. | 8546719 | |
| Zap-oglobin II Lytic Reagent | Beckman Coulter Inc. | 7546138 | |
| Coulter Counter Polystyrene Vials | Beckman Coulter Inc. | 14310-684 | |
| Test Tubes | BD Biosciences | 352008 | |
| Equipment | |||
| Refrigerated Centrifuge | Labnet International | 50075040 | |
| Humidified Incubator CO2 | Nuaire | Model Autoflow 8500 | |
| FACSCanto Flow Cytometer | BD Biosciences | 338960 | |
| Coulter Particle Counter Z1 | Beckman Coulter Inc. | WS-Z1DUALPC | |
| Sonicator Liquid Processing Equipment with Microtip | Misonix | Model No. S-4000 | |
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