ポリビニルアルコールスポンジモデル注入

Summary

薬、成長因子、および/または創傷治癒の動物モデルで操作された細胞の効果を分析する上で有用なツールが記載されています。この手法は、提供し、含まれている所望の処置をも切除し、分析するためのプラットフォームを提供するために、ポリビニルアルコール（PVA）スポンジの特性を利用しています。

Abstract

創傷治癒は、多くの種類の細胞、成長因子と^1-3化合物を含む複雑な、多段階のプロセスです。生体内で行われたときにこの複雑さのために、創傷治癒の研究では、最も包括的である。 in vivoで切開、切除、デッドスペースを含む急性創傷治癒を研究に利用できるモデル、および火傷の多くがあります。デッドスペースモデルは、組織形成や創傷上の物質の影響を研究するために使用される人工の多孔質インプラントである。一般的に使用されるデッドスペースモデルのいくつかは、ポリビニルアルコール（PVA）スポンジ、スチールワイヤーメッシュシリンダー、拡大ポリテトラフルオロエチレン（ePTFEの）材料、およびCellstick ^1,2が含まれ^てい^ます 。

各デッドスペースモデルでは、その材料の組成や注入方法に基づいて独自の制限があります。スチールワイヤーメッシュシリンダーモデルは移植後浸潤の誘導期があり、肉芽組織形成begiまでの時間の長い時間を必要とするNS ^1。創傷治癒の後の段階では最高のePTFEモデル^1,4を用い^て分析されています。 Cellstickは、通常、人間の手術の傷を調べるために使用され、流体^2を巻かれているシリコンチューブモデル内のセルローススポンジです。時間の経過とともにそれは動物の⁵の巨細胞反応を引き起こす異物反応を引き起こすために開始されますので、PVAスポンジは、急性試験に限定されています。他の材料とは異なり、PVAスポンジを挿入、削除、不活性、非生分解性材料で作られており、まだ組織学的分析^2,5のために切片であることが十分に柔らかくするのは簡単です。

傷口にPVAスポンジを癒すと、肉芽組織の形成を分析するために非常に有用である、コラーゲン沈着、創傷流体組成、癒しのプロセス^1,2,5上の物質の影響。創傷治癒の属性の広い配列を研究する上での使用に加えて、PVAスポンジは、研究の多くは他のタイプで使用されています。それはHとして腫瘍血管新生、薬物送達や幹細胞の生存および生着^1,2,6,7を調査するために利用されて。その偉大な可変性、事前の広範な使用、および再現性のある結果では、PVAスポンジは、多くの研究^1,2の理想的なモデルです。

ここでは、準備、注入および創傷治癒のマウスモデルにおけるPVAスポンジディスク（ 図1）の検索について説明します。

Protocol

1。スポンジの準備

1. 0.9％（w / v）の塩化ナトリウム水溶液中で一晩撹拌することによって水和物スポンジ。
2. それらをオートクレーブ水和スポンジを殺菌。 75mLの、121℃25分間オートクレーブ℃で

注：後述するように治療を読み込んでいますスポンジはオプションです。

3. 滅菌器と滅菌フードでは、ピンセットを用いた溶液から一スポンジを拾う。ピンセットでスポンジを絞るとスポンジからできるだけ多くのソリューションを削除するには、真空チップを使用しています。スポンジの間にスペースを残すように注意して、組織培養皿の中でスポンジ絞っ配置します。複数のウェルプレートは、さまざまな治療法を区切るために使用することができます。
4. 直接スポンジの中央に処理液をピペットで。溶液がスポンジ上に配置された後、ピペットチップでスポンジを軽く押し、これはスポンジが溶液を吸収するのに役立ちます。注：6ミリメートル我々が採用している2.75ミリメートルの厚さのスポンジで直径は25μLの最大値を保持することができます。
5. すべてのスポンジがロードされたら彼らはマウスに移植されるまで、彼らがしているプレートを氷上に保存することができます。

2。外科的処置

1. 適切に動物を麻酔し、先制鎮痛薬を管理します。全体の手順では、動物ごとに約20分続く。 30グラムのマウスにイソフルラン1.5％の酸素毎分1.5リットルは、麻酔を誘導し、維持するために使用されます。動物は、もはやピンチ反射テスト、仰臥位でのノーズコーン内の場所に応答しないとき。胸郭の下下腹側領域に1インチで1インチ剃る、電気シェーバーを使用しています。カット髪の汚れを拭きとってください。
2. 70％のアルコールが続いbetadine洗浄によって剃らエリアを殺菌。このbetadineアルコール洗浄を3回繰り返します。
3. 教えて肌を保持しながら、1.5〜2倍径の垂直切開を作るためにメスを使用しスポンジのメーターは体腔を切断しないように慎重にされて、挿入される。
4. 皮の端を保持するためにピンセットを使ってゆっくりとMetzembaumはさみを使用して切開の両側にある筋肉から皮膚を分離し始める。ポケットは、マウスの幅を横切って移動して、胸郭から後ろ足にする必要があります。
5. 両側からつまんで動物に置かれる最初のスポンジをピックアップしてピンセットを使用しています。それは上部と下部から開催されるように、ストレートピンセットにスポンジを転送します。
6. 皮の端を保持し、スポンジを挿入することができますので、それを持ち上げるためにピンセットを使用しています。ゆっくりとスポンジは、それが組織に触れた後に移動することは困難であるように下に皮膚や筋肉に触れないようにしようとしているスポンジを挿入します。すべてのスポンジに対して、この手順を繰り返します。
7. すべてのスポンジが挿入された後、切開を閉じて二、三の縫合糸を配置します。一緒に切開の両側を保持し、スツに糸をピンセットのペアを使用する皮膚の両方の層を介して再び。だけで十分な皮膚の端を閉じるには、スローを最初に締めます。他の方向から複数の投、タイトな結び目を引っ張ってこの時間を持つ方形結び目を終了します。その後、縫合します（ 図2）を終了する2つの正方形の結び目を結ぶ。全体の切開を閉じるには、追加の縫合糸を配置します。他の傷ボンディング方法は、そのようなdermabond、創傷クリップやホッチキスの針として使用することができます。
8. 麻酔システムから動物を除去し、意識が再開されている間監視します。動物はすぐにambulating開始し、手術前のモビリティに戻す必要があります。彼らは十分に食物と水に到達することができていることを保証します。いくつかの湿らせた食品は、回復を支援するために、ケージの底に置かれるかもしれません。苦痛や不快感の徴候のために毎日動物を監視し続け、感染症、炎症、裂開のために切開部位を確認してください。回復への合併症が見つかった場合は適切な処置を行ってください。

3。任意のインジェクション

1. 望ましい解決策でスポンジを注入するには、まずマウスに投与する物質の量を決定します。物質は、注入量は半分以下の総量スポンジが保持できるとなるように濃縮する必要があります。
2. （マウスのために我々は28 G針を使用）注射用シリンジを準備します。
3. 麻酔下で注射を受けるために動物を配置します。
4. 動物はもはやピンチテストに応答しないときに注射を与えることができます。
5. 注射をするには、スポンジの中心に45°の角度徹底した皮膚に針を押してください。その後、半分だけの道を進んでスポンジに針を押すその厚さを通して。目標は、スポンジの正確な中心部に注入することです。
6. 針がスポンジであることを確認する確認するには、ゆっくりと垂直に針を持ち上げます。針がスポンジになっている場合は、スポンジには針で上に移動する必要があります。
7. ゆっくりとスポンジに注入し、針を削除します。注射を必要とする複数のスポンジがある場合はそれが注入された流体の一部は、注射の前のサイトから押し出さされる可能性があります。

4。スポンジの取り外し

注意：スポンジの削除中に、余分な注意してスポンジを処理します。手術器具とスポンジを貫通して回避し、周囲の組織の主要な動脈を避けることによって、スポンジに過度の出血を防ぐことができます。

1. 動物は安楽死された後、ピンセットを使って肌を保持していると切開はスポンジを閉じることにより、スポンジを削除します。
2. 周囲のカプセルからスポンジを慎重に分離 ndはスポンジを囲む余分な組織を採取することは避けてください。そのような薬物送達または形態計測などのアッセイについては、以下の精度は切除が必要となります。

5。代表的な結果

削除スポンジが実行されます分析の種類に応じて、異なる条件の下で保存することができます。切片については、取得したスポンジは、そのような最適な切削温度（OCT）の化合物として凍結用培地に埋め込 ​​むことができますまたはパラフィンブロック（ 図3AおよびB）に埋め込 ​​むとセクショニングの10％ホルマリンに配置されます。スポンジ直径に対して半分にカットします（ 図4AおよびB）切断面を下に埋め込 ​​まれている場合セクショニングの最良の結果が得られます。スポンジのその全体の幅が存在しているので、スポンジのセクションを払う必要があります。 図3Aは、2つのスポンジを示し、左側のスポンジは、埋め込 ​​まれた/切片間違って、右側のスポンジが正しく処理されました。

ENT ">分析では、スポンジをエッペンドルフチュー​​ブに配置することができ、処理の準備が整うまで-20℃で保存したRNAおよび定量的リアルタイムPCR解析のスポンジは、エッペンドルフチュー​​ブ、フラッシュ凍結に置かれ、で保存してください。 - さらに、80℃は、このようなQIAGENからRNAlater中のようなRNA防腐剤は、高い温度で安全に保管するためのRNAを安定化させるために使用することができます。創傷流体はチューブ上のスポンジを絞ることによって収集し、から流体をまとめてプールすることができます代表的なサンプルを得るために複数のスポンジなど線維芽細胞、マクロファージ、リンパ球などの生細胞もまた、スポンジから抽出することができます。動物から除去した後、スポンジは、細胞の所望のタイプのために適切なメディアで行われることができます。スポンジができる物理（ミンチIE）または酵素（すなわち、コラゲナーゼ）メソッドによってセルを解放するために処理されます。

図1脱水3つの異なるサイズのテッドPVAスポンジディスク。

図2：横傷や4 PVAスポンジの位置を示すマウス創傷治癒モデルのイメージ。

図3。 4倍速での（A）H＆E染色切片パラフィン埋め込 ​​まれたスポンジの10倍に（B）トリクローム染色。

図4を参照。 （A）の直径に沿って半分にスポンジのカットのイメージ。（B）PVAスポンジの半分、10月にサイドを切り倒し埋め込 ​​まれた。

Discussion

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PVA Sponge	Medtronic Inc.	CF120	The size and porosity of the sponge depends on the experiment
Scalpel blade size 15	BD Biosciences	371115
Metzembaum scissors	Thermo Fisher Scientific, Inc.	79-211
Hemostat Forceps	Fine Science Tools	13004-14
Needle holder	Fine Science Tools	12004-16
5-0 nylon suture	Ethicon Inc.	698
O.C.T. compound	Tissue-Tek	4583