Summary
마약, 성장 요인 및 / 또는 상처 수리의 동물 모델에서 조작 세포의 효과를 분석하는 유용한 도구가 설명되어 있습니다. 이 기술은 구현 및 포함하고 원하는 치료를하며 excised하고 분석할 수 있도록 플랫폼을 제공하기 위해 폴리비닐 알코올 (PVA) 스폰지의 속성을 활용합니다.
Abstract
상처의 치유는 많은 세포 유형, 성장 요인과 1-3 화합물을 포함하는 복잡한, 다단계 프로세스입니다. 생체내에서 이루어 때이 때문에 복잡성 때문에, 상처 치유 연구는 가장 포괄 있습니다. 생체내 incisional, excisional, 죽은 공간을 포함한 급성 상처 치유를 공부하는 데 사용할 모델 및 화상 많은가 있습니다. 죽은 공간 모델은 상처 조직 형성과 물질의 효과를 연구하는 데 사용되는 인공, 다공성 임플란트입니다. 일반적으로 사용되는 죽은 공간 모델 중 일부는 폴리비닐 알코올 (PVA) 스폰지, 스틸 와이어 메쉬 실린더, 확장 polytetrafluoroethylene (ePTFE) 재료 및 Cellstick 1,2 등이 있습니다.
각 죽은 공간 모델은 재료의 조성과 주입 방법을 기반으로 자체적인 제한 사항이 있습니다. 스틸 와이어 메쉬 실린더 모델은 주입 후 침투 지연 위상을 가지고 있으며, 과립 조직 형성 begi 전에 오랜 금액을 필요로NS 1. 상처 치유의 나중 단계는 최고의 ePTFE 모델 1,4를 사용하여 분석하고 있습니다. Cellstick은 일반적으로 인간의 수술 상처를 연구에 사용되며 유체 2를 입었의 실리콘 튜브 모델 내부의 셀룰로오스 스폰지입니다. 시간과 그것이 짐승 5의 대형 세포 반응을 일으키는 이물 반응을 자극하기 시작하기 때문에 PVA 스펀지는 급성 연구로 제한됩니다. 다른 재료와는 달리, PVA 스폰지는 삽입 및 제거, 불활성 및 비 생분해성 물질로 만들어진 아직 histological 분석 2,5 대한 sectioned 될만큼 부드러워요하기 쉽습니다.
상처에서는 PVA 스폰지를 치료하는 것은 과립 조직 형성을 분석하는 데 매우 유용 콜라겐 증착, 상처 유체 구성, 그리고 치유 과정 1,2,5에 대한 물질의 효과. 상처 치유의 속성의 광범위한 연구에서의 사용뿐만 아니라, PVA 스폰지는 또한 연구의 많은 다른 유형에 사용되었습니다. 그것은 H같은 종양 angiogenesis, 약물 전달 및 줄기 세포 생존과 engraftment 1,2,6,7를 조사하기 위해 활용되었습니다. 가장 큰 alterability 사전 광범위한 사용 및 재현성 결과, PVA 스폰지는 많은 연구 1,2를위한 이상적인 모델입니다.
여기서는 준비, 이식 및 상처 치유의 마우스 모델에서 PVA 스폰지 디스크 (그림 1)의 검색에 대해 설명합니다.
Protocol
1. 스폰지 준비
- 0.9 % (W / V) 수성 나트륨 염화물 용액에 밤새 교반하여 수산화 스폰지.
- 그들을 autoclaving으로 충분 스폰지를 소독. 121 25 분 75 ML, 압력솥 ° C.에 대한
참고 : 아래 설명에 따라 치료와로드 스폰지는 선택 사항입니다.
- 멸균 악기와 멸균 후드에 핀셋을 사용하여 솔루션에서 한 스펀지를 데리러. 족집게로 스펀지를 짜내와 스펀지에서 가능한 한 많은 솔루션을 제거하는 진공 팁을 사용합니다. 스폰지 사이의 공간을 남길 신중하다고, 조직 배양 접시에 스폰지 아웃 wrung를 놓습니다. 다중 잘 플레이트는 다른 치료를 구분하는 데 사용할 수 있습니다.
- 직접 스폰지의 중심쪽으로 치료 솔루션을 피펫. 솔루션 스펀지에 저장 후 피펫 팁에 스펀지에서 부드럽게 아래로 누르면,이 스폰지가 솔루션을 흡수하는 데 도움이됩니다. 참고 : 6mm우리가 고용되는 2.75 mm 두께의 스폰지에 의해 직경이 25 μL의 최대를 개최하실 수 있습니다.
- 모두 스폰지가로드되면 그들이 마우스에 이식되기 전까지는, 그들에 플레이트가 얼음에 저장할 수 있습니다.
2. 수술
- 적절하게 동물을 마취하고 사전 emptive 진통을 관리할 수 있습니다. 전체 절차는 동물 당 약 20 분 정도 지속됩니다. 와 산소 분당 30g 마우스 1.5 리터 들어 Isoflurane 1.5 %가 마취를 유도하고 유지하는 데 사용됩니다. 동물은 더 이상 핀치 반사 검사, 부정사 위치 코 콘의 장소에 응답하지 않습니다 때. 흉곽 아래에 더 낮은 복부 측면에 공간 1 인치 1 인치 면도 전기 면도기를 사용합니다. 컷 머리카락 청소를 닦아주십시오.
- 70 % 알콜 뒤에 betadine으로 청소하여 면도 영역을 소독. 이 betadine 알콜 클렌징 세 번 반복합니다.
- 피부를 개최하는 것은 가르 쳤지만, 수직 절개에게 1.5-2 배 디아를 만들기 위해 메스를 사용하여스폰지의 미터 뱃속을 건드리지 않게 조심하는, 삽입되어야합니다.
- 피부의 가장자리를 잡고 핀셋을 사용하여 천천히 Metzembaum 가위를 사용하여 절개 부위의 양쪽에 근육으로부터 피부를 분리 시작합니다. 주머니가 뒷다리에 마우스의 너비에 걸쳐 및 흉곽에서 이동해야합니다.
- 측면에서 곤란하여 동물에 배치하는 최초의 스펀지를 데리러 핀셋을 사용합니다. 그것은 상단과 하단에서 개최 있도록 직선 핀셋으로 스펀지를 전송합니다.
- 피부의 가장자리를 잡고 스펀지가 삽입 수 있도록 그것을 해제하기 위해 핀셋을 사용합니다. 천천히 스펀지 그것이 조직을 만진 후에는 이동 어려울 것이다로서 아래 피부 또는 근육을 만지는 피하려고 스폰지를 삽입합니다. 모든 스폰지에 대해 반복합니다.
- 일단 모든 스폰지는 장소는 절개를 닫습니다, 두 세 봉합 삽입되었습니다. 함께 절개의 양쪽을 잡고 수투어를 스레드로 족집게 한 켤레를 사용피부의 두 레이어를 통해 다시. 피부 가장자리를 닫습 충분 최초로 크랭크를 조이십시오. 한 번 더가 다른 방향으로, 꽉 매듭을 당기는이 시간부터 던져 가진 사각형 매듭를 마칩니다. 그런 다음 봉합합니다 (그림 2)를 끝내고 두 개 더 스퀘어 매듭 묶는. 전체 절개를 닫습 추가 봉합를 놓습니다. 기타 상처 본딩 방법 등 dermabond, 상처 클립이나 스테이플로 사용할 수 있습니다.
- 마취 시스템에서 동물을 제거하고 의식이 재개되는 동안 모니터링합니다. 동물 신속 ambulating 시작하고 수술 모바일로 돌아합니다. 그들이 충분한 음식과 물을 도달할 수 있다고 확신합니다. 일부 moistened 음식은 회복에 도움을 새장 바닥에 게재될 수 있습니다. 고통 또는 불편의 흔적을 매일 동물을 지속적으로 모니터하고, 감염, 염증, 그리고 dehiscence의 절개 사이트를 확인하십시오. 회복에 어떤 합병증이 발견되면 적절한 조치를 취할 것입니다.
3. 옵션 분사
- 원하는 솔루션 스폰지를 삽입하려면 먼저 마우스에 투여하는 물질의 양을 결정한다. 물질은 주사 부피가 덜 절반 이상 총 볼륨 스펀지를 저장할 수 있습니다 있도록 집중해야합니다.
- 주사 (우리가 28 G 바늘을 사용하는 마우스의 경우)에 대한 주사기를 준비합니다.
- 마취하에 주사를받을 수있는 동물을 놓습니다.
- 동물이 더 이상 핀치 테스트에 응답 없을 때 주사가 주어질 수 있습니다.
- 주사는 스펀지의 중심에서 45 ° 각도로 철저한 피부에 바늘을 밀어주고합니다. 다음은 절반 정도의 길을 갈 스펀지로 바늘을 밀어의 두께를 통해. 목표는 스펀지의 정확한 중심으로 주입하는 것입니다.
- 바늘은 스펀지에 있는지 확인하려면 천천히 수직으로 바늘을 올린다. 바늘은 스펀지에 있으면 스펀지는 바늘로 이동합니다.
- 천천히 스펀지로 주입하고 바늘을 제거합니다. 주사가 필요한 여러 스폰지가있는 경우는 주입된 유체의 일부가 주사의 이전 사이트에서 밀쳐됩니다 가능성이 있습니다.
4. 스폰지 제거
참고 : 스폰지 제거하는 동안 추가주의 스펀지를 처리할 수 있습니다. 수술 도구와 스펀지를 관통하지 않도록하고 주변 조직 주위에 주요 동맥을 피하는하여 스펀지로 과도한 출혈을 방지.
- 동물 euthanized되면 족집게를 사용하고 절개가 스펀지를 닫으 만드는 피부를 개최하여 스펀지를 제거합니다.
- 주변 캡슐에서 스폰지를 조심스럽게 분리 ND는 스폰지를 둘러싼 여분의 조직을 수확하지 마십시오. 이러한 약물 전달이나 morphometry 등 assays 들어, 적은 정확성은 절단이 필요합니다.
5. 대표 결과
제거 스폰지가 수행됩니다 분석의 종류에 따라 서로 다른 조건 하에서 저장할 수 있습니다. sectioning 내용 검색 스폰지 같은 최적 절삭 온도 (-10 월) 화합물로 오해해서 중간에 내장할 수 또는 파라핀 블록 (그림 3A와 B)에 삽입하고 sectioning위한 포르말린 10 % 배치. 스펀지는 직경이 절반을 가로질러로 잘라 (그림 4A와 B) 표면을 줄일 임베디드 때 sectioning을위한 최상의 결과를 얻을 수 있습니다. 스펀지의 전체 너비가 존재할 수 있도록 스폰지의 섹션 촬영하여야한다. 그림 3A 두 개의 스폰지를 보여주고, 왼쪽 스폰지는 내장형 / sectioned 잘못하고 오른쪽 스폰지가 제대로 처리되었습니다되었다.
엔트 "> 처리를위한 준비까지 분석을 위해, 스폰지는 Eppendorf 튜브에 넣어 수 있으며, -20 ° C에 저장된 RNA와 정량적 실시간 PCR 분석 스폰지가 Eppendorf 튜브, 플래시 냉동으로 배치하고에 저장해야합니다 때문이다. - 또한 80 ° C.는 그러한 QIAGEN에서 RNAlater와 같은 RNA의 방부제는, 높은 온도에서 안전한 보관을위한 RNA를 안정화하는 데 사용할 수 있습니다. 상처 유체는 관 위에 스폰지를 쥐어하여 수집하고,로부터 유체를 함께 풀링 수 대표 샘플을 얻기 위해 여러 스폰지. 같은 fibroblast, macrophages와 lymphocytes와 같은 라이브 세포는 역시 스폰지에서 추출 할 수 있습니다. 동물의 탈퇴 후, 스폰지는 세포의 원하는 유형에 대한 적절한 매체에서 개최 될 수 있습니다. 스폰지가 있습니다 물리적 (점잔 빼는 즉) 또는 효소 (예 : collagenase) 방법으로 세포를 공개 처리됩니다.
그림 1. Dehydra세 가지 크기의 테드 PVA 스폰지 디스크.
그림 2. 수평 상처 넷 PVA 스폰지의 위치를 보여주는 마우스 상처 - 치유 모델의 이미지.
그림 3. 4X에 (A) H & E 염색법과 sectioned 파라핀 임베디드 스폰지의 10X시 (B) Trichrome의 염색법.
4 그림. () 직경을 따라 반으로 스폰지 컷의 이미지. (B) PVA 스폰지의 절반, 10 년에 측면을 줄일 임베디드.
Discussion
Disclosures
우리는 공개 할게 없다.
Acknowledgments
PPY로 재향 군인의 업무 장점 보너스, 건강의 국립 연구소 (NIH) 부여 R01-HL088424가 제공하는 자금.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PVA Sponge | Medtronic Inc. | CF120 | The size and porosity of the sponge depends on the experiment |
| Scalpel blade size 15 | BD Biosciences | 371115 | |
| Metzembaum scissors | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 79-211 | |
| Hemostat Forceps | Fine Science Tools | 13004-14 | |
| Needle holder | Fine Science Tools | 12004-16 | |
| 5-0 nylon suture | Ethicon Inc. | 698 | |
| O.C.T. compound | Tissue-Tek | 4583 |
References
- Efron, D. T., Barbul, A. Subcutaneous sponge models. Methods Mol. Med. 78, 83-93 (2003).
- Gottrup, F., Agren, M. S., Karlsmark, T. Models for use in wound healing research: a survey focusing on in vitro and in vivo adult soft tissue. Wound Repair. 8, 83-96 (2000).
- Sprugel, K. H., McPherson, J. M., Clowes, A. W., Ross, R. Effects of growth factors in vivo. I. Cell ingrowth into porous subcutaneous chambers. Am. J. Pathol. 129, 601-613 (1987).
- Alaish, S. M. Comparison of the polyvinyl alcohol sponge and expanded polytetrafluoroethylene subcutaneous implants as models to evaluate wound healing potential in human beings. Wound Repair. 3, 292-298 (1995).
- Davidson, J. M. Animal models for wound repair. Arch. Dermatol. Res. 290, 1-11 (1998).
- Alfaro, M. P. sFRP2 suppression of bone morphogenic protein (BMP) and Wnt signaling mediates mesenchymal stem cell (MSC) self-renewal promoting engraftment and myocardial repair. J. Biol. Chem. 285, 35645-35653 (2010).
- Andrade, S. P., Ferreira, M. A. The sponge implant model of angiogenesis. Methods Mol. Biol. 467, 295-304 (2009).
- Diegelmann, R. F., Lindblad, W. J., Cohen, I. K. A subcutaneous implant for wound healing studies in humans. J. Surg. Res. 40, 229-237 (1986).
- Efron, D. T., Most, D., Shi, H. P., Tantry, U. S., Barbul, A. A novel method of studying wound healing. J. Surg. Res. 98, 16-20 (2001).
- Lindblad, W. J. Considerations for selecting the correct animal model for dermal wound-healing studies. J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 19, 1087-1096 (2008).
