Summary
Ett användbart verktyg för att analysera effekterna av läkemedel, tillväxtfaktorer och / eller manipulerade celler i en djurmodell av sårreparation beskrivs. Denna teknik utnyttjar egenskaperna hos en polyvinylalkohol (PVA) svamp för att leverera och innehålla den önskade behandlingen och även tillhandahålla en plattform för att skäras ut och analyseras.
Abstract
Sårläkning är en komplicerad, flerstegsprocess som involverar många celltyper, tillväxtfaktorer och föreningar 1-3. På grund av denna komplexitet, sårläkning studier mest omfattande när den utförs in vivo. Det finns många in vivo modeller för att studera akuta sårläkning, inklusive incisional, excisional, Dead Space, och brännskador. Dead Space modeller är konstgjorda, porösa implantat som används för att studera vävnadsbildning och effekterna av ämnen på såret. Några av de vanligaste Dead Space modeller inkluderar polyvinylalkohol (PVA) svampar, ståltråd cylindrar nät, expanderad polytetrafluoreten (PTFE) material, och Cellstick 1,2.
Varje Dead Space-modellen har sina egna begränsningar som grundas på dess materialets sammansättning och implantation metoder. Den ståltrådsnät cylindern modell har en lag-fas av infiltration efter implantation och kräver en lång tid innan granulationsvävnad bildas Begins 1. Senare skeden av sårläkning bäst analyseras med hjälp av 1,4 ePTFE modellen. Den Cellstick är en cellulosasvamp inuti en kisel rörmodellen som typiskt används för att studera humana kirurgi sår och sårvätska 2. Den PVA-svampen är begränsad till akuta studier, eftersom det med tiden börjar att framkalla ett svar på främmande kropp, vilket orsakar en jättecellsvar reaktion i djuret 5. Till skillnad från andra material, PVA-svampar är lätt att sätta in och ta bort, tillverkad av inerta och icke-bionedbrytbara material och ändå är tillräckligt mjukt för att vara sektionerad för histologisk analys 2,5.
Vid sårläkning i PVA svampen är mycket användbart för att analysera bildningen av granulationsvävnad, kollagen, sårvätska sammansättning och effekterna av ämnen på läkningsprocessen 1,2,5. Förutom dess användning i att studera ett brett spektrum av attribut sårläkning, har PVA svampen också använts i många andra typer av studier. Det timsom använts för att undersöka tumörangiogenes, drug delivery och stamceller överlevnad och engraftment 1,2,6,7. Med sin stora alterability före omfattande användning, och reproducerbara resultat är PVA svampen en idealisk modell för många studier 1,2.
Här kommer vi att beskriva förberedelserna, implantation och hämtning av PVA svamp skivor (figur 1) i en musmodell av sårläkning.
Protocol
1. Sponge Preparation
- Hydrat svampar av omröring över natten i 0,9% (vikt / volym) vattenlösning av natriumklorid.
- Sterilisera hydratiserade svampar genom autoklavering dem. För 75 ml, autoklav under 25 minuter vid 121 ° C.
Notera: Laddning svampar med en behandling såsom beskrivs nedan är valfri.
- I en steril huva med sterila instrument, plocka upp en svamp från lösningen med hjälp av en pincett. Kläm svampen med pincetten och använd ett vakuum tips att ta bort så mycket vätska som möjligt från svampen. Placera urvriden svamp i en vävnad odlingsskål, är noga med att lämna utrymme mellan svampar. Plattor med multipla hål kan användas för att separera olika behandlingar.
- Pipettera behandlingslösningen direkt på centrumet av en svamp. Tryck ner försiktigt på svampen med pipettspetsen efter att lösningen har lagts på svampen, vilket hjälper svampen absorberar lösningen. Obs: 6mmdiameter 2,75 mm tjocka svampar som vi använder kan hålla maximalt 25 pl.
- När väl alla svampar är laddade, kan plattan de är i förvaras på is tills de är implanterade i möss.
2. Kirurgisk procedur
- Lämpligt bedöva djur och administrera förebyggande smärtstillande. Hela proceduren kommer att pågå cirka 20 minuter per djur. För en 30 g mus 1,5 liter per minut av syre med 1,5% isofluran används för att inducera och upprätthålla anestesi. När djuret är inte längre reagerar på nypa reflex test plats i noskon i liggande läge. Använd en elektrisk rakapparat raka en 1 tum med 1 tum område på nedre ventrala sida under bröstkorgen. Torka av styckning hår.
- Sterilisera det rakade området genom rengöring med betadin följt av 70% alkohol. Upprepa detta Betadine alkohol-rengöring tre gånger.
- Håll huden lärde använder skalpell för att göra en vertikalt snitt 1,5-2 gånger diameter svamparna som skall införas, att vara försiktig att inte skära genom kroppen hålighet.
- Använda en pincett för att hålla kanten av huden och långsamt börjar separera huden från muskeln på båda sidor om snittet med användning av Metzembaum sax. Fickan bör gå tvärs över bredden av den mus och från bröstkorgen till bakbenen.
- Använda en pincett för att plocka upp den första svampen som skall placeras i djuret genom att klämma den från sidorna. Överför svampen till en rak pincett så att den hålls från toppen och botten.
- Använd pincett för att hålla kanten av huden och lyft den så att svampen kan införas. Långsamt in svampen försöka undvika att röra vid huden eller muskeln under eftersom svampen kommer att bli svårt att flytta när det har rört vävnad. Upprepa för alla svampar.
- När alla svampar har satts in, två eller tre suturer för att stänga snittet. Använd en pincett för att hålla båda sidor av snittet tillsammans och trä suture genom båda lagren av huden. Dra den första kastet precis tillräckligt för att stänga huden kanterna. Avsluta torget knuten med en mer stenkast från andra hållet, den här gången drar knuten tät. Sedan knyter ytterligare två kvadratiska knutar att avsluta suturen (Figur 2). Placera ytterligare suturer att stänga hela snittet. Andra lindade bindningsmetoder kan användas såsom dermabond, klämmor lindade eller klamrar.
- Ta bort djur från anestesi-systemet och övervaka när medvetandet återupptas. Djur bör snabbt börja ambulerande och återgå till pre-op rörlighet. Säkerställa att de kan tillräckligt nå mat och vatten. Vissa fuktad livsmedel får placeras i botten av buren för att underlätta återhämtningen. Fortsätta att övervaka djur dagligen för tecken på ångest eller obehag, och kontrollera snittet platsen för infektion, inflammation och sårruptur. Vidta lämpliga åtgärder om några komplikationer till återvinning finns.
3. Valfritt Injektion
- Att injicera svampen med en önskad lösning, först bestämma den mängd av substansen som administreras till möss. Ämnet måste koncentreras så att injektionsvolymen är mindre än hälften av den totala volymen svampen kan hålla.
- Förbered en spruta för injektion (för möss använder vi en 28 G nål).
- Placera djuret för att få injektionerna under narkos.
- När djuret inte längre reagerar för nypa testet injektionen kan ges.
- För att ge injektionen tryck in nålen i 45 ° vinkel noggrann huden i mitten av svampen. Tryck sedan på nålen i svampen bara kommer halvvägsgenom dess tjocklek. Målet är att spruta in den exakta mitten av svampen.
- För kontrollera att nålen är i svampen långsamt lyfter nålen vertikalt. Om nålen är i svampen, bör svampen röra sig med nålen.
- Injicera långsamt in i svampen och ta bort nålen. Om det finns flera svampar som kräver injektioner är det möjligt att en del av den injicerade fluiden att tryckas ut av de föregående platser för injektion.
4. Svamp Avlägsnande
Notera: Under svampen bort, hantera svampen med extra försiktighet. Undvika att tränga in i svampen med de kirurgiska instrumenten och för att förhindra överdriven blödning in i svampen genom att undvika de stora artärerna runt den omgivande vävnaden.
- När djuret är avlivas, ta bort svampen genom att hålla huden med en pincett och göra ett snitt stänga svampen.
- Försiktigt skilja svamparna från den omgivande kapseln en nd att undvika att skörda extra vävnad som omger svampen. För analyser som drug delivery eller morfometri, mindre noggrannhet som krävs för excision.
5. Representativa resultat
Avlägsnade svampar kan lagras under olika tillstånd beroende på typen av analys som skall utföras. För sektionering kan de hämtade svamparna vara inbäddade i ett medium för frysning såsom Optimal Cutting Temperature (OCT)-förening eller placeras i 10% formalin för inbäddning och snittning i paraffinblock (figur 3A och B). Bästa resultat för sektionering erhålles när svampen har halverats över diametern och inbäddades skära ytan nedåt (fig. 4A och B). Delar av svampen bör vidtas så att hela bredden av svampen är närvarande. Figur 3A visar två svampar, den vänstra svampen inbäddade / sektioneras felaktigt och den högra svampen behandlades korrekt.
ENT "> För analys kan svamparna placeras i ett Eppendorf-rör och förvaras vid -20 ° C tills för bearbetning RNA och kvantitativa realtids-PCR svamparna analys bör placeras i ett Eppendorf-rör, snabbfrystes och lagras på. - 80 ° C. Dessutom kan en RNA-konserveringsmedel, såsom RNAlater från QIAGEN, användas för att stabilisera RNA för säker lagring vid högre temperaturer. kan uppsamlas genom att klämma svamparna under en tub, och att föra samman den fluid från sårvätska flera svampar för att erhålla ett representativt prov. Levande celler, såsom fibroblaster, makrofager och lymfocyter, kan också extraheras från svamparna. Efter avlägsnande från djuret, kan svamparna vara rum i ett lämpligt medium för den önskade typen av celler. kan Svampar bearbetas för att frigöra cellerna genom fysikaliska (t.ex. mals) eller enzymatisk (dvs. kollagenas) metoder.
Figur 1. Dehydrated PVA svamp skivor i tre olika storlekar.
Figur 2. Bild av mus sårläkning modell som visar läget för lateral sår och fyra PVA svampar.
Figur 3. (A) H & E-färgning vid 4x och (B) Trichrome-färgning vid 10x i tvärsektion paraffinförvarad svampar.
Figur 4. (A) Bild av svamp halveras längs diametern. (B) PVA svamp halv, inbäddad minska nedåt i oktober
Discussion
Disclosures
Vi har inget att lämna ut.
Acknowledgments
Finansiering av National Institutes of Health (NIH) bidrag R01-HL088424, Veterans Affairs meriter utmärkelsen till PPY.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PVA Sponge | Medtronic Inc. | CF120 | The size and porosity of the sponge depends on the experiment |
| Scalpel blade size 15 | BD Biosciences | 371115 | |
| Metzembaum scissors | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 79-211 | |
| Hemostat Forceps | Fine Science Tools | 13004-14 | |
| Needle holder | Fine Science Tools | 12004-16 | |
| 5-0 nylon suture | Ethicon Inc. | 698 | |
| O.C.T. compound | Tissue-Tek | 4583 |
References
- Efron, D. T., Barbul, A. Subcutaneous sponge models. Methods Mol. Med. 78, 83-93 (2003).
- Gottrup, F., Agren, M. S., Karlsmark, T. Models for use in wound healing research: a survey focusing on in vitro and in vivo adult soft tissue. Wound Repair. 8, 83-96 (2000).
- Sprugel, K. H., McPherson, J. M., Clowes, A. W., Ross, R. Effects of growth factors in vivo. I. Cell ingrowth into porous subcutaneous chambers. Am. J. Pathol. 129, 601-613 (1987).
- Alaish, S. M. Comparison of the polyvinyl alcohol sponge and expanded polytetrafluoroethylene subcutaneous implants as models to evaluate wound healing potential in human beings. Wound Repair. 3, 292-298 (1995).
- Davidson, J. M. Animal models for wound repair. Arch. Dermatol. Res. 290, 1-11 (1998).
- Alfaro, M. P. sFRP2 suppression of bone morphogenic protein (BMP) and Wnt signaling mediates mesenchymal stem cell (MSC) self-renewal promoting engraftment and myocardial repair. J. Biol. Chem. 285, 35645-35653 (2010).
- Andrade, S. P., Ferreira, M. A. The sponge implant model of angiogenesis. Methods Mol. Biol. 467, 295-304 (2009).
- Diegelmann, R. F., Lindblad, W. J., Cohen, I. K. A subcutaneous implant for wound healing studies in humans. J. Surg. Res. 40, 229-237 (1986).
- Efron, D. T., Most, D., Shi, H. P., Tantry, U. S., Barbul, A. A novel method of studying wound healing. J. Surg. Res. 98, 16-20 (2001).
- Lindblad, W. J. Considerations for selecting the correct animal model for dermal wound-healing studies. J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 19, 1087-1096 (2008).
