Summary
यहाँ हम सेल कठोरता को मापने के लिए एक त्वरित और आसान करने के लिए विधि का वर्णन है. इस दृष्टिकोण का सामान्य सिद्धांत के लिए अच्छी तरह से परिभाषित नकारात्मक दबाव कोशिका की सतह से एक micropipette के माध्यम से लागू करने के लिए जवाब में झिल्ली विरूपण उपाय है. इस विधि सब्सट्रेट संलग्न कोशिकाओं के biomechanical गुणों का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है.
Protocol
1. ग्लास micropipettes पुलिंग
उपकरण: micropipette डांड़ी, Microforge.
गिलास: Boroscillicate कांच capillaries (~ 1.5 मिमी बाहरी व्यास, ~ मिमी 1.4 आंतरिक व्यास).
- Micropipettes ही बुनियादी दृष्टिकोण है कि इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी रिकॉर्डिंग के लिए कांच microelectrodes को तैयार करने के लिए प्रयोग किया जाता है का उपयोग कर खींच रहे हैं. संक्षेप में, एक गिलास केशिका बीच में गरम किया जाता है और जब गिलास पिघल शुरू होता है केशिका के दो हिस्सों के अलावा दो micropipettes पैदा खींच रहे हैं. एकाधिक वाणिज्यिक खींचने के लिए इस प्रक्रिया अपेक्षाकृत सरल ऊर्ध्वाधर खींचने कि गुरुत्वाकर्षण का उपयोग करने के लिए दो pipettes अत्यधिक परिष्कृत क्षैतिज खींचने कि कई प्रोग्राम पुल के वेग और अन्य मानकों भिन्न विकल्पों की पेशकश के अलावा खींच से लेकर प्रदर्शन करने के लिए उपलब्ध हैं. खींचने के दोनों प्रकार हमारे प्रयोगों में इस्तेमाल किया गया.
- आवश्यकताविंदुक टिप की ज्यामिति के लिए: इन प्रयोगों में इस्तेमाल किया pipettes के सुझावों आमतौर पर के बीच में 2 से 6 बाहरी व्यास सुक्ष्ममापी सेल के आकार पर निर्भर करता है की सीमा होती है. एक अन्य महत्वपूर्ण पैरामीटर टिप के आकार है, जो लगभग एक बेलनाकार ट्यूब (चित्रा 1 देखें) चाहिए. इस पुल के मानकों के अनुकूलन और खुर्दबीन के नीचे टिप के आकार की पुष्टि जब तक इच्छित आकार प्राप्त है के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है. विंदुक पिंडली की अधिकतम लंबाई उम्मीद विरूपण की राशि पर निर्भर करता है: अगर विरूपणों छोटे <10 सुक्ष्ममापी कर रहे हैं, यह पर्याप्त है कि विंदुक के सिलेंडर की तरह हिस्सा भी कम (परिमाण का एक ही आदेश) बड़ा करने के लिए, रिश्तेदार विरूपणों तदनुसार समायोजित करें. सामान्य में, "खींच" में गर्मी और / या वृद्धि बढ़ाने टिप के व्यास कम हो जाती है. "खींच" में वृद्धि भी एक लंबी शंकु के साथ एक टिप उत्पन्न करता है. हमारे प्रयोगों में, एक Sutter P-97 क्षैतिज विंदुक डांड़ी का उपयोग कर, कार्यक्रम था22 खींचो; 22 वेग, समय 200, 500 दबाव 473 के हीट: निम्न मापदंडों को अनुकूलित. यह भी संभव है के लिए एक बहुत लंबे जूते के तल्ले का मध्य भाग खींच और फिर टूट गया और इसे चमकाने बेलनाकार सुझावों बनाने. कैसे pipettes के विभिन्न प्रकार के तैयार करने के लिए विस्तृत निर्देश Sutter पुस्तिका में दिए गए हैं.
- Microforge: यह भी एक चिकनी सतह गिलास है कि प्लाज्मा झिल्ली एक अच्छा मुहर बनाता उत्पन्न विंदुक की नोक आग पॉलिश करने के लिए सिफारिश की है. विंदुक टिप एक गर्म काँच की गेंद के आसपास के क्षेत्र के लिए एक बहुत ही एक microforge का उपयोग कर 2 के एक अंश के लिए लाने के द्वारा किया जाता है. इसी तरह की तकनीक को नियमित electrophysiological रिकॉर्डिंग के लिए microelectrodes को तैयार करने के लिए प्रयोग किया जाता है.
- Micropipette भरने: micropipettes PBS या गैर फ्लोरोसेंट विकास मीडिया के रूप में एक शारीरिक खारा समाधान के साथ भरा जाना चाहिए. महत्वपूर्ण बात समाधान 30% सीरम के साथ पूरक होना चाहिए है कि सेल मेम की अनुमति देगाविंदुक में सुचारू रूप से चलते brane. दो दृष्टिकोण विंदुक टिप में हवाई बुलबुले से छुटकारा पाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है: (i) समाधान में डूब विंदुक के एक टिप किया जा सकता है 1 तरल केशिका विंदुक backfilling के बाद बलों द्वारा टिप को भरने के लिए अनुमति दूसरे छोर से या (ii) पूरे विंदुक धीरे विंदुक के जूते के तल्ले का मध्य भाग पर दोहन सिरे से बुलबुले को हटाने के पीछे के अंत से भरा जा सकता है.
- नोट: Pipettes प्रयोग के दिन पर तैयार रहना होगा.
2. कक्षों की तैयारी
- कोशिकाओं सीडिंग: Microaspiration एकल कक्षों है कि या तो निलंबन में रखा जाता है या सब्सट्रेट संलग्न करने के लिए कर रहे हैं पर किया जाता है. Aspirate निलंबन में कोशिकाओं, कोशिकाओं को उनके substrates से उठा लिया गया है और एक उथले अनुदैर्ध्य कक्ष प्रयोग से पहले सही है कि उलटा माइक्रोस्कोप पर मुहिम शुरू की है में pipetted है. सब्सट्रेट संलग्न कोशिकाओं aspirateछोटे कवर फिसल वरीयता प्राप्त (व्यास ~ 10 मिमी) भी है कि प्रयोग पहले microaspiration चेंबर में रखा जा सकता है. एक उथले अनुदैर्ध्य कक्ष का उपयोग करने के लिए औचित्य के लिए एक बहुत उथले कोण है, के रूप में संभव के रूप में क्षैतिज करीब एक micropipette कोशिकाओं दृष्टिकोण करने के लिए अनुमति देने के लिए है. यह ध्यान देने का एक विमान पर देखे जा (चित्रा 2 देखें) micropipette में खींच लिया झिल्ली की अनुमति देने के लिए किया जाता है.
- कोशिका झिल्ली Visualizing: विंदुक में झिल्ली प्रक्षेपण का पालन, सेलुलर झिल्लियाँ diI के रूप में एक lipophilic फ्लोरोसेंट रंजक, एक मानक धुंधला हो प्रोटोकॉल का उपयोग के साथ दाग रहे हैं.
- गर्म पीबीएस समाधान.
- एक काम एकाग्रता (5 सुक्ष्ममापी) गर्म पीबीएस समाधान के साथ शेयर diI पतला.
- 5 मिनट के लिए Sonicate डाई समुच्चय को तोड़ने के लिए.
- 5 मिनट के लिए नीचे स्पिन और तैरनेवाला ले.
- पीबीएस 3 बार, 5 मिनट में कोशिकाओं को धो लें.
- डाई के साथ कोशिकाओं को इतना सेतेएक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 30 मिनट के लिए lution.
- 5 मिनट के लिए 3 बार पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें.
- नोट: यह संभव है cytoskeleton उप झिल्ली कि झिल्ली के साथ भी किया जा रहा है साथ विंदुक में खींच लिया visualizing के साथ झिल्ली के diI धुंधला हो स्थानापन्न. यह ध्यान में रखा जाना चाहिए, तथापि, कि cytoskeleton perturbing सेल के biomechanical गुणों को बदल सकता है. इसके अलावा, जब सब्सट्रेट संलग्न कोशिकाओं के साथ microaspiration प्रयोगों प्रदर्शन, यह 3 डी इमेजिंग का उपयोग करने के लिए कि कोशिकाओं के फोकल हवाई जहाज़ के एक कोण पर तैनात है विंदुक में झिल्ली प्रक्षेपण की लंबाई का अनुमान है की सिफारिश की है.
3. Microaspiration और छवि अधिग्रहण
3D deconvolution क्षमताओं (कंप्यूटर नियंत्रित आंदोलन objectiv z-अक्ष के साथ Zeiss Axiovert 200M के साथ अधिमानतः उल्टे फ्लोरोसेंट खुर्दबीन: उपकरणतों या एक बराबर), manipulators, एक कंप्यूटर (AxioCam MRM या एक बराबर), दबाव transducer (बायोटेक या एक बराबर), कंपन से मुक्त स्टेशन (TMD या एक बराबर), micromanipulator (Narishige, Sutter, Burleigh या समकक्ष से जुड़ा वीडियो कैमरा यांत्रिक, हाइड्रोलिक या piezoelectric) हो सकता है. यह भी महत्वपूर्ण है करने के लिए जोर है कि microaspiration 3D क्षमताओं के बिना एक माइक्रोस्कोप का उपयोग करने के लिए निलंबन में कोशिकाओं की लाल रक्त कोशिकाओं 1,2 या 3 neutrophils, 4 नाभिक या कृत्रिम 5 liposomes के रूप में अलग organelles, के रूप में, जकड़न का अनुमान किया जा सकता है.
छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर: Zeiss AxioVision या एक बराबर.
- एक microaspiration कक्ष में कोशिकाओं माउंट के रूप में ऊपर वर्णित है, एक औंधा फ्लोरोसेंट खुर्दबीन पर. एक प्रयोग के लिए एक सेल चुनने कोशिकाओं की स्थिति और दृश्य क्षेत्र के केंद्र में जगह. यह perfo के लिए महत्वपूर्ण हैएक कंपन से मुक्त वातावरण में rm इन प्रयोगों सब्सट्रेट संलग्न कोशिकाओं के साथ प्रयोगों के लिए विशेष रूप से, क्योंकि मिनट कंपन है कि आम तौर पर सत्ता पक्ष और नियमित तालिकाएँ पर होने के लिए पूरी तरह से सील के निर्माण के साथ समझौता करने के लिए, या micropipette में परिणाम की नोक को तोड़ने की संभावना है टिप है कि परिणामों के विश्लेषण के तिरछा जाएगा की स्थिति में महत्वपूर्ण बदलाव.
- एक लचीला टयूबिंग से एक तंग फिट करने के लिए विंदुक धारक की connecter को समायोजित व्यास के साथ एक शक्ति transducer से जुड़ा एक विंदुक धारक में पीबीएस / मीडिया w / सीरम समाधान के साथ भरा micropipette रखें. विंदुक में एक प्रयोग की शुरुआत में दबाव वायुमंडलीय दबाव equilibrated है. विंदुक एक micromanipulator है कि एक माइक्रोन रेंज में विंदुक आंदोलनों के ठीक नियंत्रण की अनुमति देता है पर मुहिम शुरू की है. चैम्बर के नीचे करने के लिए एक उथले कोण पर एक विंदुक स्थिति और विंदुक दृश्य क्षेत्र के केंद्र के लिए टिप लाने के. गुविंदुक के ई टांग विंदुक टिप जो में झिल्ली aspirated है के एक बेलनाकार हिस्सा, क्षैतिज shallowest संभव कोण (10-15 °) में स्थिति (1) विंदुक और (2) द्वारा फोकल हवाई जहाज़ के लिए गठबंधन किया है चैम्बर के नीचे के खिलाफ विंदुक के जूते के तल्ले का मध्य भाग ठोके. क्योंकि फूल के डंठल का निचला भाग बहुत पतली है यह कक्ष के तल पर स्लाइड जबकि एक सेल आ काफी लचीला है, चित्रा 1 में schematically दिखाया. धीरे धीरे नीचे एक एकल कक्ष की ओर सेल के लिए ध्यान के विमान के पास जब तक पाठ्यक्रम मैनिप्युलेटर का उपयोग करने के लिए micropipette लाने. फिर, एक ठीक मैनिप्युलेटर का उपयोग करने के लिए सेल के किनारे करने के लिए micropipette कदम जब तक विंदुक टिप धीरे झिल्ली छू लेती है. विंदुक की स्थिति का निरीक्षण करने के लिए एक छवि ले लो. अच्छा जवानों जब विंदुक के पूरे टिप कोशिका की सतह के साथ पूर्ण संपर्क में है और संपर्क स्थिर है बनाया जाता है. कोई मजबूत उद्देश्य कसौटी है, लेकिन कितना अच्छा मुहर exc है के बारे में,दृश्य परीक्षा के लिए EPT कर.
- नकारात्मक दबाव transducer का उपयोग कर के एक कदम लागू करते हैं और इसे बनाए रखने के लिए जब तक झिल्ली प्रक्षेपण स्थिर है. दबाव की राशि विंदुक में झिल्ली aspirate की जरूरत सेल प्रकार और विशिष्ट प्रयोगात्मक शर्तों पर निर्भर करता है. हमारे प्रयोगों में, प्रारंभिक विरूपण आम तौर पर जब -2 Hg-15mm के बीच सीमा में लागू करने का दबाव मनाया जाता है. जब दबाव लागू किया जाता है, धीरे - धीरे झिल्ली विंदुक में विकृत है जब तक यह निश्चित लंबाई, एक प्रक्रिया है कि आम तौर पर 2-3 मिनट लगते हैं पर स्थिर है. इस समय के दौरान, विरूपण की झिल्ली छवियों हर 30 सेकंड का अधिग्रहण कर रहे हैं विंदुक में खींच लिया है झिल्ली की प्रगति को ट्रैक करने के लिए.
- इस 2-5 मिमी Hg कदम में अगले स्तर के लिए दबाव बढ़ाने के लिए और पूरी प्रक्रिया को दोहराएँ जब तक झिल्ली प्रक्षेपण सेल और विंदुक में चलता रहता है, जो बिंदु पर प्रयोग बंद कर दिया है से detaches.
झिल्ली के विरूपण की डिग्री यों, aspirated लंबाई (एल) विंदुक टिप झिल्ली प्रक्षेपण की परिधि से शिखर तक मापा जाता है. यह नोट करना महत्वपूर्ण है, तथापि, कि एक बड़ा विंदुक कोशिका झिल्ली पर दबाव का एक ही स्तर पर अधिक बल लागू होगी. Pipettes के व्यास के बीच परिवर्तनशीलता के लिए खाते में करने के लिए, इसलिए, aspirated लंबाई विंदुक (डी) व्यास एक प्रयोग के लिए मापा के लिए सामान्यीकृत है.
डेटा आगे endothelial सेल के एक मानक रैखिक viscoelastic आधा अंतरिक्ष मॉडल के रूप में पहले 6,7 अध्ययन में वर्णित का विश्लेषण का उपयोग कर सकते हैं. विशेष रूप से, कक्षों की लोचदार मापांक समीकरण का उपयोग कर अनुमान लगाया गया था:
जहां ई यंग है मापांक है, एक आंतरिक हैविंदुक की त्रिज्या, Δp दबाव में अंतर है, एल इसी aspirated लंबाई है, और φ (η) एक दीवार समारोह बल मॉडल, के रूप में Theret एट अल 7 के द्वारा वर्णित का उपयोग कर की गणना की है. यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि कई मॉडल एक परिमित तत्व मॉडल है कि मान लिया गया है कि एक सेल isotropic और समरूप सामग्री गुण और तरल ड्रॉप मॉडल है, जो मानते हैं कि कोशिकाओं को एक गोलाकार आकृति के रूप के साथ एक deformable क्षेत्र सहित microaspiration डेटा का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, लगातार ख़राब कर सकते हैं, और रिलीज, के रूप में कई उत्कृष्ट समीक्षा में वर्णित पर ठीक: 8-10. Microaspiration भी कोशिकाओं और सेलुलर viscoelastic गुण cortical तनाव और विभिन्न संरचनात्मक तत्वों के सेल और ऊतक biomechanics (अधिक जानकारी के लिए ऊपर सूचीबद्ध समीक्षा देखें) के लिए योगदान के रूप में इस तरह के ऊतकों के अन्य biomechanical मापदंडों की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
5. प्रतिनिधिपरिणाम
पहले के अध्ययनों में, micropipette आकांक्षा या तो 5 liposomes या कोशिकाओं है कि 2,11-13 सब्सट्रेट करने के लिए नहीं जुड़े थे पर प्रदर्शन किया था. हमारे अध्ययन में, तथापि, कोशिकाओं को आमतौर पर सब्सट्रेट करने के लिए कर रहे हैं संलग्न रखा cytoskeletal संरचना में परिवर्तन से बचने के लिए है कि होती है जब कोशिकाओं 14-16 अलग होने की संभावना है. सब्सट्रेट संलग्न कोशिकाओं लिए microaspiration तकनीक के उपयोग को मान्य करने के लिए, हम परीक्षण गोजातीय महाधमनी endothelial कोशिकाओं (BAECs), के रूप में इस दृष्टिकोण से अनुमान के सेल कठोरता में कमी में F-actin परिणामों के विघटन चित्रा 3 से पता चलता है कि क्या है कि, के रूप में की उम्मीद , यह वास्तव में मामला है. विशेष रूप से, चित्रा 3A एक endothelial नकारात्मक दबाव एक micropipette के माध्यम से लागू करने के लिए जवाब में प्रगतिशील विरूपण के दौर से गुजर झिल्ली के फ्लोरोसेंट छवियों के एक ठेठ श्रृंखला से पता चलता है. जैसी कि उम्मीद थी, धीरे - धीरे झिल्ली विंदुक और aspirat में aspirated हैएड लंबाई लागू दबाव के एक समारोह के रूप में बढ़ जाती है. विरूपण शो कि F-actin के व्यवधान काफी सभी दबाव (3B चित्रा) शर्तों के तहत 14 के अनुमानों के aspirated लंबाई बढ़ जाती है के समय पाठ्यक्रम.
इस दृष्टिकोण का उपयोग करना है, हमें पता चला है कि सेल कठोरता बढ़ जाती है जब सेलुलर झिल्ली कोलेस्ट्रॉल के समाप्त हो रहे हैं है कोलेस्ट्रॉल संवर्धन जबकि 14 में कोई प्रभाव नहीं पड़ा है चित्रा 4 में अधिक से अधिक आकांक्षा लंबाई तक पहुँचने के बाद कोलेस्ट्रॉल समृद्ध एक सेल, एक नियंत्रण कक्ष, और एक कोलेस्ट्रॉल समाप्त सेल से पता चलता है. -15 मिमी Hg (4A). अनुमानों आम तौर पर 10mmHg में विकसित करना शुरू कर दिया और झिल्ली विरूपण के समय पाठ्यक्रम -10 -15, और -20 मिमी Hg (4B) के नकारात्मक दबाव के लिए मापा जा सकता है. ऊपर दबाव के - 25mmHg आवेदन एक अलग पुटिका बनाने aspirated प्रक्षेपण की टुकड़ी में हुई. दबाव स्तर कि झिल्ली टुकड़ी के परिणामस्वरूप simila थाविभिन्न कोलेस्ट्रॉल की शर्तों के तहत आर. इस अवलोकन बेहद अप्रत्याशित था क्योंकि पिछले अध्ययनों से पता चला है कि झिल्ली लिपिड bilayers में झिल्ली कोलेस्ट्रॉल में वृद्धि हुई 5,17 झिल्ली की कठोरता बढ़ जाती है. हमारे आगे के अध्ययन के इन परमाणु बल माइक्रोस्कोपी 18,19 और सेना ट्रैक्शन 20 माइक्रोस्कोपी सहित कई स्वतंत्र दृष्टिकोण, का उपयोग टिप्पणियों की पुष्टि की.
चित्रा 1. योजनाबद्ध एक रिकॉर्डिंग विंदुक की ओर देखें. विंदुक टिप (तरफ देखने) में एक बेलनाकार जूते के तल्ले का मध्य भाग उत्पन्न खींच लिया है. Micropipette पैरामीटर: डी = 2a = आंतरिक व्यास और प्रवर्तन निदेशालय = 2b = बाहरी व्यास.
चित्रा 2. Micropipette सब्सट्रेट संलग्न एक सेल (ए) योजनाबद्ध तरफ देखने आ, (बी) एक micropipette तेज विपरीत छविहैंक एक आम तौर पर आकार आकांक्षा प्रयोगों में इस्तेमाल सेल को छू, (सी) वही 18 DiIC के साथ लेबल सेल की प्रतिदीप्त छवि. micropipette अभी भी मौजूद है, लेकिन अदृश्य है (14 से).
चित्रा 3. सब्सट्रेट संलग्न microaspiration की कोशिकाओं का उपयोग में सेल कठोरता को मापने के मान्यकरण. एक: नियंत्रण की शर्तों के तहत और latrunculin के लिए जोखिम के बाद BAECs के प्रगतिशील झिल्ली विरूपण की छवियाँ विंदुक छवियों पर अदृश्य है, क्योंकि यह नहीं प्रतिदीप्ति करता है. कोशिकाओं को 10 मिनट है, जो नाटकीय रूप से F-actin की राशि को कम के रूप में rhodamine-phalloidin प्रतिदीप्ति द्वारा मापा (नहीं दिखाया गया है) के लिए 2 सुक्ष्ममापी एक latrunculin से अवगत कराया गया है लेकिन सेल के आकार पर कोई महत्वपूर्ण प्रभाव था. Latrunculin का इलाज एक सेल में, वहाँ एक aspirated प्रक्षेपण के बीच में झिल्ली के thinning है लेकिन प्रक्षेपण अभी भी ग के लिए जुड़ा हुआ है हैElls बी. एक latrunculin झिल्ली विरूपण के समय पाठ्यक्रम जहां एल झिल्ली प्रक्षेपण और डी की लंबाई aspirated है पर प्रभाव विंदुक के नियंत्रण कक्ष के लिए व्यास (एन 14 =) और 2 सुक्ष्ममापी latrunculin उजागर कोशिकाओं है एक 10 मिनट के लिए (n = ) 5. कोशिकाओं -10 मिमी Hg (हीरे), -15 मिमी Hg (वर्ग) और -20 मिमी Hg (त्रिकोण) के साथ aspirated थे. (14.)
चित्रा 4. BAECs की झिल्ली विरूपण पर सेलुलर कोलेस्ट्रॉल के स्तर का प्रभाव. कोलेस्ट्रॉल को समृद्ध, कोलेस्ट्रॉल समाप्त और नियंत्रण (कोशिकाओं नियंत्रण कोशिकाओं की झिल्ली विरूपण एक ठेठ छवियों MβCD से अवगत कराया गया: 1:1 अनुपात कि कोशिकाओं में मुक्त कोलेस्ट्रॉल के स्तर पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा मिश्रण MβCD कोलेस्ट्रॉल (देखें ) इनसेट दिखाया छवियों -15 मिमी Hg में अधिक से अधिक विरूपण को दर्शाती है. तीर aspirated प्रक्षेपण की स्थिति को इंगित करता है. बार 30 सुक्ष्ममापी बी. तीन प्रयोगात्मक सेल आबादी के लिए aspirated लंबाई के औसत समय पाठ्यक्रम सी. अधिकतम aspirated लंबाई लागू दबाव के एक समारोह के रूप में साजिश रची है. समाप्त हो कोशिकाओं में अधिक से अधिक सामान्यीकृत लम्बाई दबाव -15 मिमी Hg और -20 मिमी Hg (पी <0.05) के लिए नियंत्रण कक्ष की तुलना में काफी कम था. (14.)
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Discussion
यह Microaspiration एक सरल और अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य एक कोशिका झिल्ली को नकारात्मक दबाव लागू करने और अच्छी तरह से परिभाषित दबाव के जवाब में झिल्ली विरूपता को मापने के द्वारा विधि सेल कठोरता / विरूपता अनुमान प्रदान करता है. यह पहली बार Mitchison और स्वान (1954) में परी अंडे की लोचदार संपत्तियों विशेषताएँ सेल 21 विभाजन और फिर लाल रक्त कोशिकाओं में 1 यांत्रिक गुणों को देखने के तंत्र में अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए विकसित किया गया था. यह विधि कई अध्ययनों में इस्तेमाल किया गया है करने के लिए विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं (2,3,12,13 जैसे) के biomechanical गुणों का आकलन. हमारे हाल ही के अध्ययन के लिए इस विधि का विस्तार करने के लिए 3 डी इमेजिंग 14,15,22 के साथ microaspiration संयोजन के द्वारा सब्सट्रेट संलग्न कोशिकाओं की कठोरता का अनुमान. झिल्ली कठोरता और लोच सेल phenotype के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान करने और कोशिकाओं को एक गतिशील वातावरण के लिए विशेष रूप से यांत्रिक सुराग की एक किस्म जवाबहै कि रक्त के प्रवाह के hemodynamic बलों द्वारा या बाह्य मैट्रिक्स के viscoelastic गुण बदलने से उत्पन्न कर रहे हैं. सेल द्रव कतरनी तनाव 13,23 और 16,24 सब्सट्रेट की कठोरता के एक समारोह के रूप में जकड़न बढ़ जाती है कि दरअसल, पहले के अध्ययनों से पता चला है. सेल कठोरता में परिवर्तन के लिए सेल mechanosensitivity और mechanotransduction पर एक बड़ा असर होता है की उम्मीद कर रहे हैं. विशेष रूप से, हम हाल ही में पता चला है कि endothelial कठोरता में वृद्धि हुई अपनी संवेदनशीलता की सुविधा के लिए 25 प्रवाह. हम यह भी पता चला है कि endothelial stiffening उनके angiogenic संभावित 22 में वृद्धि के साथ जुड़ा हुआ है. इसके अलावा, झिल्ली और कठोरता चिपचिपापन में एक कमी proliferative देर चरण डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिकाओं का संकेत है कि इन गुणों की मदद कर सकते हैं और एक आक्रामक घातक phenotype 26 बनाम प्रारंभिक चरण अंतर विशेषताएँ.
मापने सेल कठोरता भी provid कर सकते हैंई cytoskeleton की संरचना और संगठन में प्रमुख अंतर्दृष्टि. सेल कठोरता का निर्धारण करने में एक महत्वपूर्ण कारक उप झिल्ली cytoskeleton, विशेष रूप से 6,14 F-actin है. सेल कठोरता में परिवर्तन भी रो - 27 GTPases, झिल्ली और cytoskeleton 28 के बीच एक प्रमुख तंत्र जोड़ी है कि सक्रियता के रूप में विभिन्न संकेत घटनाओं, जवाब में फिर से व्यवस्था cytoskeletal को प्रतिबिंबित कर सकते हैं. इसके अलावा, सेल कठोरता में परिवर्तन भी पता लगाया जा सकता है जब cytoskeleton नेटवर्क की संरचना में कोई स्पष्ट परिवर्तन 14 मनाया जाता है सुझाव है कि इस दृष्टिकोण अधिक नेटवर्क के दृश्य से cytoskeleton संरचना में सूक्ष्म परिवर्तन के प्रति संवेदनशील है.
वैकल्पिक तरीकों के संदर्भ में, microaspiration परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (AFM) है कि आम तौर पर सेल 29,30 कठोरता को मापने के लिए प्रयोग किया जाता है के लिए एक उपयोगी और सस्ता विकल्प प्रदान करता है. AFM कि स्थानीय MEMBRA उपायों के विपरीतपूर्वोत्तर कठोरता, microaspiration एक सेल की विरूपता के एक वैश्विक उपाय प्रदान करता है. अन्य सेलुलर biomechanical गुणों का अनुमान लगाने के तरीके चुंबकीय घुमा cytometry 31-33, कण ट्रैकिंग 34,35, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से कई अन्य दृष्टिकोण के रूप में विभिन्न मनका / कण दृष्टिकोण, ऐसे cytoindenter, एक तरीका है कि कुछ हद तक 36 AFM समान है के रूप में शामिल और ऑप्टिकल चिमटी 37. जबकि इन तकनीकों का विस्तृत तुलनात्मक विश्लेषण इस पांडुलिपि के दायरे से परे है, उन्हें और microaspiration के बीच मुख्य मतभेद निम्नलिखित हैं: (i) चुंबकीय घुमा cytometry कोशिकाओं की सतह को संलग्न करने के लिए स्थानीय झिल्ली विरूपण कारण मनका के लिए एक बाहरी बल लगाने शामिल साइट जहां मनका संलग्न है जो सबसे अधिक बल प्रेरित stiffening 31 प्रतिक्रिया निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है, (ii) कण ट्रैकिंग कई अलग अलग उद्देश्यों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ऐसी ताकत है कि कोशिकाओं subst पर लागू आकलन के रूप में,(ट्रैक्शन फोर्स माइक्रोस्कोपी) की दर 34 या 35 सेल के अंदर या मोतियों organelles की गति का विश्लेषण करके आंतरिक "गहरा" सेल की परतों की कठोरता का अनुमान. इसके विपरीत, ऑप्टिकल tweezesrs के लिए झिल्ली नैनोट्यूब (tethers) खींचने के लिए cortical तनाव और झिल्ली cytoskeleton 37 आसंजन का अनुमान किया जाता है. झिल्ली tethers खींचने के लिए एक वैकल्पिक विधि AFM, एक तरीका है कि दोनों महत्वपूर्ण समानताएं और मतभेद के रूप में ऑप्टिकल 18,38 चिमटी की तुलना का उपयोग करने के लिए है. इन तरीकों में से अधिकांश का लाभ यह है कि वे व्यक्ति की कोशिकाओं के biomechanical गुणों के बारे में विस्तृत स्थानिक जानकारी प्रदान कर सकता है. हालांकि, इन तकनीकों के सभी या तो बहुत महंगे उपकरण या परिष्कृत और आसानी से उपलब्ध नहीं सॉफ्टवेयर संकुल की आवश्यकता होती है. दूसरे हाथ पर microaspiration की ताकत है, कि यह मात्रात्मक परिणाम प्रदान करने और विशिष्ट यांत्रिक मॉडल के बीच फर्क में एक अन्य तरीके के रूप में अच्छा हैअति विशिष्ट उपकरण या सॉफ्टवेयर की आवश्यकता के बिना सेल के एस. सारांश में, जबकि वहाँ कोशिकाओं और ऊतकों के biomechanical गुणों का आकलन करने के लिए कई दृष्टिकोण हैं, microaspiration सेलुलर biomechanics की जांच के लिए एक उपयोगी और शक्तिशाली दृष्टिकोण रहता है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sutter pipette puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| Microforge | Narishige | MF-830 | |
| Inverted Fluorescent Microscope | Zeiss | Axiovert 200M | The microscope should be preferably equipped with 3D/deconvolution capabilities. |
| Videocamera | Zeiss | AxioCam MRm | |
| Image Acquisition sotware | Zeiss | AxioVision | |
| Pneumatic Pressure Transducer | BioTek | DPM-1B | DPM1B Pneumatic Transducer Tester can now be found by FLUKE. |
| Pipette glass | Richland | Customized glass | Pipettes were customized with a 1.2 inner diameter and 1.6 outer diameter. |
| DiI Dye | Invitrogen | D282 | Dissolves well in DMSO |
References
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