Summary
Hier beschrijven we een snelle en eenvoudige methode om cellen stijfheid te meten. Het algemene principe van deze benadering is membraan vervorming te meten in reactie op welbepaalde negatieve druk aangebracht door een micropipet op het celoppervlak. Deze methode biedt een krachtig hulpmiddel om biomechanische eigenschappen van substraat-aangehechte cellen te bestuderen.
Abstract
Groeiend aantal studies tonen aan dat biomechanische eigenschappen van individuele cellen belangrijke rol spelen in meerdere cellulaire functies, met inbegrip van celproliferatie, differentiatie, migratie en cel-cel interacties. De twee belangrijkste parameters van cellulaire biomechanica cellulair vervormbaarheid of stijfheid en het vermogen van de cellen samentrekken en genereren kracht. Hier beschrijven we een snelle en eenvoudige methode om cellen stijfheid schatten door de mate van vervorming membraan in reactie op negatieve druk van een glazen micropipet aan het celoppervlak, een techniek die genoemd Micropipet Verlangen of Microaspiration.
Microaspiration wordt uitgevoerd door aan een glazen capillair met een micropipet maken met een zeer kleine tip (2-50 urn diameter afhankelijk van de grootte van een cel of een weefselmonster), die vervolgens wordt verbonden met een pneumatische drukopnemer en afgedaan nabijheid van een cel onder een microscoop. Wanneer depunt van de pipet raakt een cel, een stap van negatieve druk wordt uitgeoefend op de pipet door de pneumatische drukopnemer genereren welbepaalde druk op de celmembraan. Onder druk wordt het membraan opgezogen in de pipet en progressieve vervorming membraan of "membraan projection" in de pipet wordt gemeten als functie van de tijd. Het basisprincipe van deze experimentele benadering is dat de mate van vervorming membraan in reactie op een bepaalde mechanische kracht is een functie van membraan stijfheid. Hoe stijver het membraan, hoe langzamer de snelheid van membraanassociatie vervorming en hoe korter de steady-state aspiratie length.The techniek uitgevoerd op geïsoleerde cellen, zowel in suspensie en substraat vastgemaakte grote organellen worden, en liposomen.
Analyse vindt plaats door vergelijking maximale membraan vervormingen bereikt onder een bepaalde druk voor verschillende celpopulaties of experimentele omstandigheden. Een "stijfheid coëfficiënt" is estimated getrokken waarbij de aangezogen lengte van vervorming membraan als functie van de toegepaste druk. Bovendien kunnen de gegevens verder worden geanalyseerd om de Young's modulus van de cellen (E), de meest voorkomende parameter stijfheid van materialen kenmerken schatten. Het is belangrijk op te merken dat plasma membranen van eukaryote cellen kunnen worden beschouwd als een bi-component systeem waar membraan lipide dubbellaag wordt underlied de sub-membraan cytoskelet en dat het het cytoskelet dat de mechanische steiger van het membraan vormt en domineert de vervormbaarheid van de cellulaire envelop. Deze benadering derhalve kan het sonderen van de biomechanische eigenschappen van het sub-membraan cytoskelet.
Protocol
1. Pulling Glas Micropipetten
Uitrusting: Micropipet Puller, Microforge.
Glas: Boroscillicate glazen capillairen (~ 1,5 mm buitendiameter, ~ 1,4 mm interne diameter).
- Micropipetten getrokken met dezelfde basisbenadering waarmee glas micro-elektroden bereiden voor elektrofysiologie opnamen. In het kort wordt een glazen capillair verwarmd in het midden en wanneer het glas begint te smelten de twee helften van de capillaire elkaar getrokken opwekken van twee micropipetten. Meerdere commerciële trekkers zijn beschikbaar om deze taak variërend van relatief eenvoudige verticale trekkers die zwaartekracht gebruikt om de twee pipetten uit elkaar te zeer geavanceerde horizontale trekkers die meerdere programmeerbare opties om de snelheid en andere parameters van de pull variëren bieden voeren. Beide typen trekkers werden in onze experimenten.
- Vereistes voor de geometrie van de pipetpunt: De toppen van de pipetten in deze experimenten typisch variëren van 2 tot 6 urn uitwendige diameter afhankelijk van de grootte van de cel. Een andere belangrijke parameter is de vorm van de tip, die moet ongeveer een cilindrische buis (zie figuur 1). Dit kan worden bereikt door het optimaliseren van de parameters van de trek en verificatie van de vorm van de tip onder de microscoop tot de gewenste vorm is verkregen. De optimale lengte van de schacht pipet afhankelijk van de hoeveelheid van verwachte vervorming: als de vervormingen klein <10 urn, is het voldoende dat het cilindervormige deel van de pipet ook relatief kort is (dezelfde orde van grootte), voor grotere vervormingen dienovereenkomstig aanpassen. In het algemeen verhogen van de warmte en / of toename in "pull" vermindert de diameter van de tip. De toename van de "pull" genereert ook een tip met een langere taper. In onze experimenten met een Sutter P-97 horizontale pipet trekker, het programmageoptimaliseerd om de volgende parameters: Hitte van 473, Pull 22, Velocity 22, Time 200; Pressure 500. Het is ook mogelijk om cilindrische tips door aan een lange schacht en breken en polijsten. Gedetailleerde instructies hoe de verschillende types van de pipetten bereiden gegeven in de handleiding Sutter.
- Microforge: Het is ook aanbevolen om te vuren-polijsten van de punt van de pipet om een glad glazen oppervlak dat een goede afdichting maakt naar de plasmamembraan te genereren. Dit gebeurt doordat de punt van de pipet om de nabijheid van een verwarmde glazen bol een zeer een fractie van een seconde met een microforge. Soortgelijke techniek wordt routinematig gebruikt voor het bereiden van micro-elektroden voor elektrofysiologische opnames.
- Vullen van de Micropipet: Micropipetten worden gevuld met een fysiologische zoutoplossing, zoals PBS of niet-fluorescerende groeimedium. Belangrijk is dat de oplossing dient te worden aangevuld met 30% serum dat zal de cel mem makenBrane om soepel in de pipet. Twee benaderingen kunnen worden gebruikt om zich te ontdoen van luchtbellen in de punt van de pipet: (i) een punt van de pipet kan worden ondergedompeld in de oplossing eerst zodat de vloeistof aan het uiteinde te voorzien door capillaire krachten gevolgd door opvullen van de pipet aan de andere kant of (ii) de gehele pipet kan worden gevuld vanaf de achterkant door voorzichtig tikken op de schacht van de pipet om de bellen uit de tip.
- Opmerking: pipetten moeten worden bereid op de dag van het experiment.
2. Bereiding van Cellen
- Enten van de cellen: Microaspiration wordt uitgevoerd op enkelvoudige cellen die ofwel gesuspendeerd blijven of aan de ondergrond. Om cellen in suspensie te zuigen, worden cellen opgetild hun substraten en gepipetteerd in een ondiepe longitudinale kamer die de omgekeerde microscoop gemonteerd vlak voor het experiment. Om substraat-gebonden cellen, cellen te zuigenworden gezaaid op kleine cover-slips (~ 10 mm diameter) die ook in de microaspiration kamer worden geplaatst voor het experiment. De reden om een ondiepe longitudinale kamer gebruiken is om een micropipet de cellen benadert een zeer kleine hoek, zo horizontaal mogelijk. Dit wordt gedaan om het membraan getrokken in de micropipet te worden gevisualiseerd op een vlak van focus (zie figuur 2) mogelijk.
- Visualiseren celmembraan: Om het membraan uitsteeksel in de pipet voldoen worden celmembranen gekleurd met een lipofiel fluorescerende kleurstof, zoals Dii met een standaard kleuringsprotocol.
- Warm PBS oplossing.
- Verdun de stock DII een werkconcentratie (5 uM) met verwarmde PBS oplossing.
- Sonificeer gedurende 5 minuten om kleurstof aggregaten breken.
- Spin down gedurende 5 minuten en neem supernatant.
- Was de cellen in PBS 3 x 5 min elk.
- Incubeer de cellen met de kleurstof, zodatOplossing voor 30 min in een 37 ° C incubator.
- Spoel de cellen met PBS 3 maal gedurende 5 minuten elk.
- Opmerking: Het is mogelijk om DII kleuring van het membraan te vervangen door het visualiseren van de sub-membraan cytoskelet die ook wordt samengetrokken met het membraan in de pipet. Er moet worden gehouden rekening echter dat verstoren het cytoskelet kan veranderen de biomechanische eigenschappen van de cel. Bovendien, bij het uitvoeren van experimenten met microaspiration substraat bevestigde cellen, wordt aanbevolen om 3D beeldvorming gebruikt om de lengte van membraan projectie schatten in de pipet die onder een hoek met het brandvlak van de cellen.
3. Microaspiration en Image Acquisition
Uitrusting: Omgekeerde fluorescentiemicroscoop, bij voorkeur met 3D deconvolutie-mogelijkheden (Zeiss Axiovert 200M met computer gestuurde Z-as beweging van de objectiviteites of een equivalent daarvan); videocamera is aangesloten op een computer (Axiocam MRM of een equivalent), Pressure Transducer (BioTek of een equivalent), Trillingsvrij station (TMD of een equivalent), micromanipulator (Narishige, Sutter, Burleigh of gelijkwaardig; manipulatoren kan mechanisch, hydraulisch of piëzo). Het is ook belangrijk om te benadrukken dat microaspiration kunnen worden uitgevoerd met een microscoop zonder 3D mogelijkheden om de stijfheid van cellen in suspensie, zoals rode bloedcellen of neutrofielen 1,2 3, geïsoleerd organellen, zoals nuclei 4 of kunstmatige liposomen 5 schatten.
Image Acquisition software: Zeiss AxioVision of een equivalent.
- Monteer de cellen in een kamer microaspiration, zoals hierboven beschreven, op een omgekeerde fluorescentiemicroscoop. Plaats de cellen kiezen van een cel voor een experiment en plaats deze in het midden van het gezichtsveld. Het is belangrijk perform deze experimenten in een trillingsvrije omgeving, in het bijzonder voor de experimenten met substraat-gebonden cellen omdat minuut typische vibraties die ontstaan op banken en gewone tafels zijn waarschijnlijk volledig afbreuk doen aan de creatie van de afdichting, de punt van de micropipet of resulteren in breken verschuivingen in de positie van de tip dat zal verdraaien de analyse van de resultaten.
- Plaats een micropipet gevuld met PBS / media w / serum oplossing in een pipethouder aangesloten op een transducer flexibele slang met de diameter aangepast aan de connector van de pipet houder voor een strakke pasvorm. In het begin van elk experiment de druk in de pipet is geëquilibreerd tot de atmosferische druk. De pipet is gemonteerd op een micromanipulator dat goede controle over de bewegingen in een pipet micron bereik. Plaats een pipet onder een kleine hoek met de bodem van de kamer en breng de punt van de pipet om het midden van het gezichtsveld. The schacht van de pipet, een cilindrisch deel van de pipetpunt waarin het membraan wordt afgezogen, is horizontaal uitgelijnd met het brandvlak door (1) het positioneren van de pipet met een ondiepe hoek mogelijk (10-15 °) en (2) door buigen van de schacht van de pipet tegen de bodem van de kamer. Omdat de steel zeer dun is flexibel genoeg om te glijden op de bodem van de kamer, terwijl het naderen van een cel, zoals schematisch weergegeven in figuur 1. Langzaam omlaag brengen van de micropipet aan de zijkant van een enkele cel met behulp van de cursus manipulator tot nabij het vlak van focus voor de cel. Vervolgens met een fijne manipulator verplaatsen micropipet naar de rand van de cel totdat de punt van de pipet zachtjes raakt het membraan. Neem een beeld aan de positie van de pipet observeren. Goede afdichtingen worden gemaakt wanneer het hele punt van de pipet is volledig in contact met het celoppervlak en het contact is stabiel. Er is geen sterke objectief criterium, maar over hoe goed het zegel is excEPT voor het visueel onderzoek.
- Breng een stap van negatieve druk met behulp van de transducer en handhaven tot op membraan projectie is gestabiliseerd. De hoeveelheid druk die nodig is om het membraan te zuigen in de pipet afhankelijk van celtype en specifieke experimentele omstandigheden. In onze experimenten aanvankelijke vervorming wordt typisch waargenomen bij de toepassing van druk in het bereik van -2 to-15mm Hg. Wanneer de druk wordt toegepast, wordt het membraan geleidelijk vervormd in de pipet tot deze gestabiliseerd op bepaalde lengte, een proces dat typisch ongeveer 2-3 minuten. Gedurende deze tijd worden beelden van membraan vervorming gemeten elke 30 sec om de voortgang van het membraan dat wordt getrokken in de pipet volgen.
- De druk naar het volgende niveau in 2-5 mm Hg stappen en herhaal de hele procedure tot membraan uitsteeksel loskomt uit de cel en gaat in de pipet, waarna het experiment gestopt.
Om de mate van vervorming membraan kwantificeren, wordt de aangezogen lengte (L) gemeten van de punt van de pipet om het hoekpunt van de omtrek van het membraan projectie. Het is belangrijk op te merken dat een grotere pipet zal meer kracht op het celmembraan van toepassing op hetzelfde drukniveau. Het verklaren van de variabiliteit tussen de diameters van de pipetten daarom wordt de aangezogen lengte genormaliseerd voor de pipet diameter (D) gemeten voor elke experiment.
De gegevens kunnen verder worden geanalyseerd met een standaard lineair visco-elastisch halfruimte model van de endotheliale cel, zoals beschreven in de eerdere studies 6,7. Specifiek werd de elasticiteitsmodulus van de cellen geschat met de formule:
waarin E is Young's modulus, een is de binnensteradius van de pipet, Ap het drukverschil, L de lengte overeenkomt aangezogen en φ (η) een wand functioneren berekend met de kracht model, zoals beschreven door Theret et al. 7. Het is belangrijk op te merken dat meerdere modellen zijn gebruikt om de data microaspiration met een eindige elementen model dat veronderstelt dat een cel een vervormbaar gebied met isotrope homogene materiaaleigenschappen en vloeistofdruppel modellen, die ervan uitgaan dat cellen een bolvorm vormen analyseren kan continu vervormen, en te herstellen bij de uitslag, zoals beschreven in een aantal uitstekende reviews: 8-10. Microaspiration kan ook worden gebruikt om andere biomechanische parameters van cellen en weefsels, zoals cellulaire viscoelastische eigenschappen, corticale spanning en bijdrage van de verschillende structurele elementen aan cellen en weefsels biomechanica (zie de foto hierboven voor meer informatie) onderzoeken.
5. VertegenwoordigerResultaten
In eerdere onderzoeken werd micropipet aspiratie uitgevoerd hetzij liposomen 5 of op cellen die niet aan het substraat 2,11-13. In onze studies zijn echter de cellen normaliter gehandhaafd aan het substraat veranderingen in het cytoskelet structuur die kunnen optreden wanneer cellen los 14-16 vermijden. Om het gebruik van microaspiration techniek voor substraat-aangehechte cellen valideren testten we of verstoring van F-actine resulteert in de afname cel stijfheid van de aorta van runderen endotheelcellen (BAECs), zoals geschat door deze benadering. Figuur 3 blijkt dat, zoals verwacht , dit is inderdaad het geval is. Specifiek Figuur 3A toont een typische reeks fluorescerende beelden van endotheliale membraan progressieve vervorming ondergaan in reactie op negatieve druk aangebracht door een micropipet. Zoals verwacht wordt het membraan geleidelijk opgezogen in de pipet en aspirated lengte toeneemt als functie van de toegepaste druk. De tijd-vakken van de vervorming zien dat verstoring van F-actine aanzienlijk aangezogen lengten van de projecties onder alle drukomstandigheden (Figuur 3B) 14 verhoogt.
Met deze benadering hebben we ontdekt dat cellen stijfheid toeneemt wanneer celmembranen uitgeput cholesterol dat cholesterol verrijkt had geen effect 14. Figuur 4 toont een cholesterol verrijkte cel, een controle cel en een cholesterol geledigde cellen na het bereiken van maximale lengte bij aspiratie -15 mm Hg (4A). De uitsteeksels typisch beginnen te ontwikkelen at-10mmHg en de tijd-vakken membraan vervorming kan worden gemeten voor het onderdrukken van -10, -15 en -20 mm Hg (4B). Toepassing van een druk boven-25mmHg resulteerde in onthechting van de aangezogen projectie die een zelfstandige blaasje. Het drukniveau dat resulteerde in membraan detachement was similar onder verschillende omstandigheden cholesterol. Deze waarneming was zeer onverwacht omdat eerdere studies is gebleken dat membraan lipide dubbellagen een toename van de membraan cholesterol de stijfheid van het membraan 5,17 verhoogt. Onze verdere studies bevestigden deze waarnemingen met behulp van verschillende onafhankelijke benaderingen, met inbegrip van Atomic Force Microscopy 18,19 en Force Microscopie Traction 20.
Figuur 1. Schematisch zijaanzicht van een opname pipet. De pipet wordt getrokken om een cilindrische schacht top (zijaanzicht) genereren. Micropipet parameters: D = 2a = inwendige diameter en ED = 2b = buitendiameter.
Figuur 2. Micropipet naderen van een substraat aangesloten cel (A) Schematische zijaanzicht;. (B) Bright contrast beeld van een micropipet shank het aanraken van een typisch gevormde cel gebruikt in aspiratie experimenten; (C) TL-beeld van dezelfde cel gelabeld met DiIC 18. De micropipet is nog steeds aanwezig, maar is onzichtbaar (Van 14).
Figuur 3. Validatie van meetcel stijfheid in substraat-ingeschreven cellen met behulp van microaspiration. A: Beelden van progressieve vervorming van BAECs membraan onder controle omstandigheden na blootstelling aan latrunculin De pipet is onzichtbaar op de afbeeldingen omdat het niet fluoresceren.. De cellen werden blootgesteld aan 2 uM latrunculin A gedurende 10 min met aanmerkelijk verminderde de hoeveelheid F-actine, zoals gemeten door rhodamine-fluorescentie phalloidin (niet getoond) maar had geen significant effect op de celvorm. In een latrunculin behandelde cel, een verdunning van het membraan in het midden van de projectie aangezogen maar het uitsteeksel wordt nog aan de cel. B. Effect van latrunculin A op het tijdsverloop van membraan vervorming wanneer L opgezogen lengte van het membraan projectie en D de diameter van de pipet voor controle cellen (n = 14) en cellen blootgesteld aan 2 uM latrunculin A gedurende 10 min (n = 5). De cellen werden afgezogen met -10 mm Hg (ruiten), -15 mm Hg (vierkanten) en -20 mm Hg (driehoeken). (Van 14.)
Figuur 4. Effect van cellulaire cholesterol op membraan vervorming van BAECs. . Een typische beelden membraan vervorming van cholesterol verrijkte, cholesterol arme en controle cellen (controle cellen werden blootgesteld aan MβCD: MβCD-cholesterol mengsel bij 1:1 ratio die geen effect op het niveau van vrij cholesterol was in de cellen (zie inzet). getoonde afbeeldingen tonen de maximale vervorming bij -15 mm Hg. De pijl geeft de positie van de aangezogen projectie. De bar is 30 pm. B. Gemiddelde tijd-cursussen van aangezogen lengten voor de drie experimentele celpopulaties. C. Maximale opgezogen lengten uitgezet als functie van de toegepaste druk. De maximale genormaliseerde lengte in lege cellen was significant lager dan die van controle cellen voor drukken -15 mm Hg en -20 mm Hg (P <0,05). (Van 14.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Microaspiration een eenvoudige en zeer reproduceerbare methode cel stijfheid / vervormbaarheid schatten door negatieve druk op een celmembraan en het meten membraan vervormbaarheid in reactie op welbepaalde druk. Het werd voor het eerst ontwikkeld door Mitchison en Swann (1954) om de elastische eigenschappen van de zee-egel eitjes te karakteriseren om inzicht te verschaffen in de mechanismen van celdeling 21 en vervolgens te kijken naar de mechanische eigenschappen in de rode bloedcellen 1. Deze methode is gebruikt in meerdere studies de biomechanische eigenschappen van verschillende celtypes (bv. 2,3,12,13) beoordelen. Onze recente studies uitgebreid deze methode om de stijfheid van substraat-aangehechte cellen te schatten door het combineren microaspiration met 3D beeldvorming 14,15,22. Membraan stijfheid en elasticiteit belangrijke informatie over celfenotype en hoe cellen reageren op een dynamische omgeving met name een verscheidenheid aan mechanische aanwijzings die worden gegenereerd door hemodynamische krachten van de bloedstroom of door de visco-elastische eigenschappen van de extracellulaire matrix. Inderdaad hebben eerdere studies aangetoond dat cellen stijfheid toeneemt in reactie op fluïdum 13,23 schuifspanning en als functie van de stijfheid van het substraat 16,24. Veranderingen in cel stijfheid wordt verwacht dat zij een grote invloed op cel mechanosensitivity en mechanotransductie hebben. Specifiek hebben we onlangs aangetoond dat een toename in stijfheid endotheliale gevoeligheid vergemakkelijkt stromen 25. We hebben ook aangetoond dat endotheliale verstijving is geassocieerd met een toename in de angiogene potentieel 22. Een daling in stijfheid en viscositeit membraan karakteriseren proliferatieve laat stadium eierstokkankercellen aangeeft dat deze eigenschappen kunnen helpen onderscheiden vroegtijdig versus agressieve kwaadaardige fenotype 26.
Meetcel stijfheid kan ook provide belangrijke inzichten in de structuur en organisatie van het cytoskelet. Een belangrijke factor bij het bepalen cel stijfheid is de sub-membraan cytoskelet, met name F-actine 6,14. Veranderingen in cel stijfheid kan ook cytoskeletale herschikking tijdens in reactie op verschillende signaleringsgebeurtenissen, zoals activering van Rho GTPases-27 een belangrijk mechanisme dat koppel tussen het membraan en het cytoskelet 28. Verder kunnen veranderingen in cel stijfheid zelfs gevonden wanneer er geen duidelijke veranderingen in de structuur van het cytoskelet netwerken worden waargenomen 14 suggereert dat deze benadering gevoeliger voor subtiele veranderingen in het cytoskelet structuur dan visualisatie van de netwerken.
In termen van alternatieve benaderingen, microaspiration een bruikbaar en goedkoop alternatief voor de Atomic Force Microscopy (AFM) dat doorgaans wordt gebruikt om mobiele stijfheid 29,30 te meten. In tegenstelling tot de AFM dat de lokale membra meetne stijfheid, microaspiration geeft een globaal maat voor de vervormbaarheid van een cel. Andere methoden om cellulaire biomechanische eigenschappen schatten omvatten verschillende kraal / deeltjes benaderingen, zoals magnetische twisting cytometry 31-33, deeltje volgen 34,35, evenals verschillende andere benaderingen, zoals cytoindenter, een methode die enigszins vergelijkbaar met de AFM 36 en optisch pincet 37. De gedetailleerde vergelijkende analyse van deze technieken valt buiten het bestek van dit manuscript, de belangrijkste verschillen tussen hen en microaspiration zijn: (i) Magnetic twisting cytometry omvat het aanbrengen van een externe kracht een kraal bevestigd aan het celoppervlak membraan lokale vervorming te veroorzaken op de plaats waar het bolletje is bevestigd dat het meest belangrijk om de kracht geïnduceerde respons verstijving 31; (ii) Particle volgen kan worden gebruikt voor verschillende doeleinden, zoals schatten de kracht die cellen uitoefenen op de substrate (Traction Force Microscopy) 34 of schatten de stijfheid van de interne "deep" lagen van de cel door het analyseren van de beweging van de korrels of organellen binnen de cel 35. In tegenstelling, zijn optische tweezesrs gebruikt om membraan nanobuisjes (tethers) trekken om corticale spanning en membraan-cytoskelet hechting 37 te schatten. Een alternatieve methode om membraan tethers trekken is met behulp van AFM, een methode die zowel significante overeenkomsten en verschillen ten opzichte van optische pincet 18,38 heeft. Het voordeel van de meeste van deze methoden is dat zij gedetailleerde ruimtelijke informatie over de biomechanische eigenschappen van de individuele cellen. Echter, al deze technieken vereisen ofwel zeer dure apparatuur of ingewikkeld en niet gemakkelijk verkrijgbaar softwarepakketten. De sterkte van de microaspiration, daarentegen, is dat het een goede andere methoden die op kwantitatieve resultaten en differentiëren tot specifieke mechanische models van de cel zonder de vereiste van de zeer gespecialiseerde apparatuur of software. Samengevat, terwijl er meerdere benaderingen van de biomechanische eigenschappen van cellen en weefsels te beoordelen, microaspiration blijft een bruikbare en krachtige aanpak cellulaire biomechanica onderzoeken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sutter pipette puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| Microforge | Narishige | MF-830 | |
| Inverted Fluorescent Microscope | Zeiss | Axiovert 200M | The microscope should be preferably equipped with 3D/deconvolution capabilities. |
| Videocamera | Zeiss | AxioCam MRm | |
| Image Acquisition sotware | Zeiss | AxioVision | |
| Pneumatic Pressure Transducer | BioTek | DPM-1B | DPM1B Pneumatic Transducer Tester can now be found by FLUKE. |
| Pipette glass | Richland | Customized glass | Pipettes were customized with a 1.2 inner diameter and 1.6 outer diameter. |
| DiI Dye | Invitrogen | D282 | Dissolves well in DMSO |
References
- Rand, R. P., Burton, A. C. Mechanical properties of the red cell membrane. I. Membrane stiffness and intracellular pressure. Biophys. J. 4, 115-135 (1964).
- Discher, D. E., Mohandas, N., Evans, E. A. Molecular maps of red cell deformation: hidden elasticity and in situ connectivity. Science. 266, 1032-1035 (1994).
- Schmid-Schönbein, G. W., Sung, K. L., Tözeren, H., Skalak, R., Chien, S. Passive mechanical properties of human leukocytes. Biophys. J. 36, 243-256 (1981).
- Guilak, F., Tedrow, J. R., Burgkart, R. Viscoelastic properties of the cell nucleus. Biochem. Biophys. Re.s Commun. 269, 781-786 (2000).
- Needham, D., Nunn, R. S. Elastic deformation and failure of lipid bilayer membranes containing cholesterol. Biophys. J. 58, 997-1009 (1990).
- Sato, M., Theret, D. P., Wheeler, L. T., Ohshima, N., Nerem, R. M. Application of the micropipette technique to the measurement of cultured porcine aortic endothelial cell viscoelastic properties. Journal of Biomechanical Engineering. 112, 263-268 (1990).
- Theret, D. P., Levesque, M. J., Sato, F., Nerem, R. M., Wheeler, L. T. The application of a homogeneous half-space model in the analysis of endothelial cell micropipette measurements. J. of Biomechanical Engineering. 110, 190-199 (1988).
- Hochmuth, R. M. Micropipette aspiration of living cells. J. Biomech. 33, 15-22 (2000).
- Lim, C. T., Zhou, E. H., Quek, S. T. Mechanical models for living cells--a review. Journal of Biomechanics. 39, 195 (2006).
- Zhao, R., Wyss, K., Simmons, C. A. Comparison of analytical and inverse finite element approaches to estimate cell viscoelastic properties by micropipette aspiration. Journal of Biomechanics. 42, 2768 (2009).
- Chien, S., Sung, K. L., Skalak, R., Usami, S., Tozeren, A. Theoretical and experimental studies on viscoelastic properties of erythrocyte membrane. Biophys. J. 24, 463-487 (1978).
- Evans, E., Kuhan, B. Passive material behavior of granulocytes based on large deformation and recovery after deformation tests. Blood. 64, 1028-1035 (1984).
- Sato, M., Levesque, M. J., Nerem, R. M. Micropipette aspiration of cultured bovine aortic endothelial cells exposed to shear stress. Arteriosclerosis. 7, 276-286 (1987).
- Byfield, F., Aranda-Aspinoza, H., Romanenko, V. G., Rothblat, G. H., Levitan, I. Cholesterol depletion increases membrane stiffness of aortic endothelial cells. Biophys. J. 87, 3336-3343 (2004).
- Byfield, F. J., Hoffman, B. D., Romanenko, V. G., Fang, Y., Crocker, J. C., Levitan, I. Evidence for the role of cell stiffness in modulation of volume-regulated anion channels. Acta. Physiologica. 187, 285-294 (2006).
- Byfield, F. J., Reen, R. K., Shentu, T. -P., Levitan, I., Gooch, K. J. Endothelial actin and cell stiffness is modulated by substrate stiffness in 2D and 3D. Journal of Biomechanics. 42, 1114 (2009).
- Evans, E., Needham, D. Physical properties of surfactant bilayer membranes: thermal transitions, elasticity, rigidity, cohesion and colloidal interactions. Journal of Physical Chemistry. 91, 4219-4228 (1987).
- Sun, M., Northup, N., Marga, F., Huber, T., Byfield, F. J., Levitan, I., Forgacs, G. The effect of cellular cholesterol on membrane-cytoskeleton adhesion. J. Cell. Sci. 120, 2223-2231 (2007).
- Shentu, T. P., Titushkin, I., Singh, D. K., Gooch, K. J., Subbaiah, P. V., Cho, M., Levitan, I. oxLDL-induced decrease in lipid order of membrane domains is inversely correlated with endothelial stiffness and network formation. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 299, 218-229 (2010).
- Norman, L. L., Oetama, R. J., Dembo, M., Byfield, F., Hammer, D. A., Levitan, I., Aranda-Espinoza, H. Modification of Cellular Cholesterol Content Affects Traction Force, Adhesion and Cell Spreading. Cell Mol. Bioeng. 3, 151-162 (2010).
- Mitchinson, J. M., Swann, M. M. The Mechanical Properties of the Cell Surface: I. The Cell Elastimeter. J. of Experimental Biology. 31, 443-460 (1954).
- Byfield, F. J., Tikku, S., Rothblat, G. H., Gooch, K. J., Levitan, I. OxLDL increases endothelial stiffness, force generation, and network formation. J. Lipid Res. 47, 715-723 (2006).
- Ohashi, T., Ishii, Y., Ishikawa, Y., Matsumoto, T., Sato, M. Experimental and numerical analyses of local mechanical properties measured by atomic force microscopy for sheared endothelial cells. Biomed. Mater. Eng. 12, 319-327 (2002).
- Solon, J., Levental, I., Sengupta, K., Georges, P. C., Janmey, P. A. Fibroblast adaptation and stiffness matching to soft elastic substrates. Biophysical Journal. 93, 4453 (2007).
- Kowalsky, G. B., Byfield, F. J., Levitan, I. oxLDL facilitates flow-induced realignment of aortic endothelial cells. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 295, 332-340 (2008).
- Ketene, A. N., Schmelz, E. M., Roberts, P. C., Agah, M. The effects of cancer progression on the viscoelasticity of ovarian cell cytoskeleton structures. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. , Forthcoming (2011).
- Kole, T. P., Tseng, Y., Huang, L., Katz, J. L., Wirtz, D. Rho kinase regulates the intracellular micromechanical response of adherent cells to rho activation. Mol. Biol. Cell. 15, 3475-3484 (2004).
- Hall, A. Rho GTPases and the Actin Cytoskeleton. Science. 279, 509-514 (1998).
- Okajima, T. Atomic Force Microscopy for the Examination of Single Cell Rheology. In. Methods Mol. Biol. 736, 303-329 (2011).
- Wang, N., Butler, J. P., Ingber, D. E. Mechanotransduction across the cell surface and through the cytoskeleton. Science. 260, 1124-1127 (1993).
- Fabry, B., Maksym, G. N., Butler, J. P., Glogauer, M., Navajas, D., Fredberg, J. J. Scaling the microrheology of living cells. Physical Review Letters. 87, 148102 (2001).
- Park, C. Y., Tambe, D., Alencar, A. M., Trepat, X., Zhou, E. H., Millet, E., Butler, J. P., Fredberg, J. J. Mapping the cytoskeletal prestress. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 298, C1245-C1252 (2010).
- Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. Traction force microscopy of migrating normal and H-ras transformed 3T3 fibroblasts. Biophys. J. 80, 1744-1757 (2001).
- Wirtz, D. Particle-tracking microrheology of living cells: principles and applications. Annu. Rev. Biophys. 38, 301-326 (2009).
- Shin, D., Athanasiou, K. Cytoindentation for obtaining cell biomechanical properties. J. Orthop. Res. 17, 880-890 (1999).
- Ou-Yang, H. D., Wei, M. T. Complex fluids: probing mechanical properties of biological systems with optical tweezers. Annu. Rev. Phys. Chem. 61, 421-440 (2010).
- Hosu, B. G., Sun, M., Marga, F., Grandbois, M., Forgacs, G. Eukaryotic membrane tethers revisited using magnetic tweezers. Phys. Biol. 4, 67-78 (2007).
