Summary
Her beskriver vi en hurtig og enkel metode til at måle celle stivhed. Det generelle princip ved denne fremgangsmåde er at måle membran deformation som reaktion på veldefineret undertryk påføres gennem en mikropipette til celleoverfladen. Denne fremgangsmåde tilvejebringer et effektivt værktøj til at studere biomekaniske egenskaber af substrat-bundne celler.
Abstract
Stigende antal undersøgelser viser, at biomekaniske egenskaberne af de enkelte celler spiller vigtige roller i flere cellulære funktioner, herunder celleproliferation, differentiering, migration og celle-celle-interaktioner. De to nøgleparametre for cellulære biomekanik er cellulære deformerbarhed eller stivhed og cellernes evne til at optage og generere kraft. Her beskriver vi en hurtig og enkel metode til at anslå celle stivhed ved måling af graden af membranens deformation som reaktion på negativt tryk fra en glasmikropipette til celleoverfladen, en teknik, der kaldes Mikropipette Aspiration eller Microaspiration.
Microaspiration udføres ved at trække en glaskapillær for at skabe en mikropipette med en meget lille spids (2-50 um diameter afhængigt af størrelsen af en celle eller en vævsprøve), som derefter forbundet med en pneumatisk tryktransducer og bragt til afslutning nærhed af en celle under et mikroskop. Nårspidsen af pipetten rører en celle, et trin med negativt tryk tilføres til pipetten ved det pneumatiske tryk transducer genererer veldefineret tryk på cellemembranen. Som reaktion på tryk, er membranen opsuget i pipetten og progressiv membran deformation eller "membran fremspring" i pipetten måles som en funktion af tiden. Det grundlæggende princip i denne eksperimentelle fremgangsmåde er, at graden af membranens deformation som svar på et defineret mekanisk kraft er en funktion af membranens stivhed. Jo stivere membranen er, desto langsommere hastigheden af membranens deformation, og jo kortere steady-state aspiration length.The teknik kan udføres på isolerede celler, både i suspension og substrat-fastgjorte, store organeller, og liposomer.
Analyse foretages ved sammenligning maksimale membran deformationer opnået under et givet tryk for forskellige cellepopulationer eller forsøgsbetingelserne. En "stivhed koefficient" er esherved forstås ved at afbilde den aspirerede længde af membran deformation som en funktion af det påførte tryk. Endvidere kan dataene analyseres yderligere at estimere Youngs modul af cellerne (E), den mest almindelige parameter til karakterisering af stivhed af materialer. Det er vigtigt at bemærke, at plasmamembraner eukaryote celler kan betragtes som en tokomponent-system, hvor membranlipiddobbeltlaget er underlied af sub-membran cytoskelet og at det er cytoskelettet, som udgør det mekaniske skelet af membranen og dominerer deformerbarhed af det cellulære konvolutten. Denne fremgangsmåde tillader derfor probing de biomekaniske egenskaber af sub-membran cytoskelettet.
Protocol
1. Pulling Glas Mikropipetter
Udstyr: Mikropipette Puller, Microforge.
Glas: Boroscillicate glaskapillarer (~ 1,5 mm ydre diameter, ~ 1,4 mm indre diameter).
- Mikropipetter trækkes ved hjælp af den samme fremgangsmåde, der anvendes til fremstilling af glasmikroelektroder til elektrofysiologi optagelser. Kort fortalt en glaskapillar opvarmet i midten, og når glasset begynder at smelte de to halvdele af den kapillære trækkes fra hinanden og frembragte to mikropipetter. Flere kommercielle aftrækkere er til rådighed til at udføre denne proces i området fra relativt simple vertikale aftrækkere, der anvender tyngdekraften til at trække de to pipetter hinanden til højt sofistikerede horisontale aftrækkere, der tilbyder flere programmerbare muligheder for at variere hastigheden og andre parametre af trækket. Begge typer af aftrækkere blev anvendt i vore forsøg.
- Kravs for geometrien af pipettespidsen: spidser pipetter anvendt i disse eksperimenter er typisk i området mellem 2-6 um udvendig diameter afhængigt af størrelsen af cellen. En anden vigtig parameter er formen på spidsen, som skal svare et cylindrisk rør (se figur 1). Dette kan opnås ved at optimere parametrene for træk og verificere formen på spidsen under mikroskopet, indtil den ønskede form opnås. Den optimale længde af pipetten skaftet afhænger af mængden af den forventede deformation: hvis deformationer er små <10 um, er det tilstrækkeligt at den cylinder-lignende del af pipetten er også forholdsvis kort (af samme størrelsesorden) for større deformationer justeres tilsvarende. I almindelighed aftager øge varme og / eller stigning i "pull" diameteren af spidsen. Stigningen i "pull" frembringer også en spids med en længere konus. I vores eksperimenter under anvendelse af en Sutter P-97 vandrette pipette puller programmet varoptimeret til følgende parametre: Varme af 473, Pull 22, Velocity 22, Time 200; tryk 500. Det er også muligt at skabe cylindriske tips ved at trække en meget lang skaft og derefter bryde og polering den. Detaljerede instruktioner om, hvordan man fremstille forskellige typer af pipetterne er angivet i Sutter manual.
- Microforge: Det anbefales også at fyre-polere spidsen af pipetten til at generere en glatte glasoverflade, der gør en god tætning til plasmamembranen. Dette gøres ved at bringe spidsen af pipetten til i nærheden af en opvarmet glaskugle for en meget en brøkdel af et sekund ved anvendelse af en microforge. Lignende teknik anvendes rutinemæssigt til fremstilling af mikroelektroder til elektrofysiologiske optagelser.
- Påfyldning af Mikropipette: Mikropipetter skal fyldes med en fysiologisk saltvandsopløsning, såsom PBS eller ikke-fluorescerende vækstmedier. Vigtigere løsningen bør suppleres med 30% serum, der vil give cellen membran at bevæge sig jævnt ind i pipetten. To fremgangsmåder kan anvendes til at slippe af luftbobler i spidsen af pipetten: (i) en spidsen af pipetten kan neddykkes i opløsningen først tillade væsken at fylde spidsen af kapillarkræfter efterfulgt af tilbagefyldning af pipetten fra den anden ende eller (ii) det hele pipette kan fyldes fra bagenden ved forsigtigt at banke på skaftet af pipetten for at fjerne bobler fra spidsen.
- Bemærk: Pipetter skal forberedes på dagen for forsøget.
2. Fremstilling af celler
- Podning af cellerne: Microaspiration udføres på enkelte celler, der enten holdes i suspension eller er fastgjort til substratet. At aspirere celler i suspension, er cellerne løftet fra deres substrater og pipetteret over i en flad langsgående kammer, der er monteret på omvendt mikroskop lige før forsøget. At aspirere substrat-vedhæftede celler, cellerpodes på små cover-klemkiler (-10 mm diameter), der også kan placeres i microaspiration kammeret før forsøget. Begrundelsen for at bruge en flad langsgående kammer er at tillade en mikropipette at nærme cellerne i en meget flad vinkel, så tæt på vandret som muligt. Dette gøres for at tillade membranen trukket ind i mikropipetten skal visualiseres på en enkelt fokusplanet (se figur 2).
- Visualisere cellemembran: at observere membranen fremspringet ind i pipetten, er cellemembraner farvet med et lipofilt fluorescerende farvestof, såsom dil anvendelse af en standard farvningsprotokol.
- Varmt PBS opløsning.
- Fortynd stock dil til en arbejdskoncentration (5 uM) med warmed PBS-opløsning.
- Sonikeres i 5 min at bryde farvning af aggregater.
- Spin ned i 5 minutter og tage supernatanten.
- Vask cellerne i PBS 3 gange, 5 minutter hver.
- Cellerne inkuberes med farvestoffet, såning i 30 minutter i en 37 ° C inkubator.
- Vask cellerne med PBS 3 gange i 5 min hver.
- Bemærk: Det er muligt at erstatte dil farvning af membranen med visualisering af sub-membran cytoskelet, som også bliver trukket sammen med membranen ind i pipetten. Det skal tages i betragtning, dog, at forstyrrende cytoskelettet kan ændre de biomekaniske egenskaber i cellen. Endvidere, når der udføres microaspiration forsøg med substrat-vedhæftede celler, anbefales det at anvende 3D imaging at anslå længden af membranen fremspring ind i pipetten, der er anbragt i en vinkel til brændplanet af cellerne.
3. Microaspiration og Image Acquisition
Udstyr: Inverted fluorescerensmikroskop, helst med 3D dekonvolution kapaciteter (Zeiss Axiovert 200M med computerstyret Z-akse bevægelse af objectives eller en tilsvarende), videokamera tilsluttet en computer (AxioCam MRM eller tilsvarende), tryktransducer (BioTek eller tilsvarende), Vibrationsfri station (TMD eller tilsvarende), mikromanipulator (Narishige, Sutter, Burleigh eller tilsvarende manipulatorer kan være mekanisk, hydraulisk eller piezoelektrisk). Det er også vigtigt at understrege, at microaspiration kan udføres under anvendelse af et mikroskop uden 3D-funktioner til at estimere stivheden af celler i suspension, såsom røde blodlegemer 1,2 eller neutrofiler 3, isolerede organeller, såsom kerner 4 eller kunstige liposomer 5.
Image Acquisition software: Zeiss AxioVision eller tilsvarende.
- Montere cellerne i et microaspiration kammer, som beskrevet ovenfor, på et omvendt fluorescerende mikroskop. Placere cellerne vælge en celle for et eksperiment og anbringes i midten af synsfeltet. Det er vigtigt at perforeretrm disse eksperimenter i en vibrationsfri miljø, navnlig for de forsøg med substrat-vedhæftede celler, fordi minutter vibrationer, som typisk forekommer på bænke og regelmæssige tabeller er sandsynligvis fuldstændig kompromittere oprettelsen af forseglingen, bryde spidsen af mikropipette eller resultere i betydelige ændringer i positionen af spidsen, som vil forvrænge analysen af resultaterne.
- Anbring en mikropipette fyldt med PBS / media w / serum opløsning i en pipette, der er tilsluttet en effekttransducer gennem fleksible rør med diameteren justeret til stikket fra pipetten holder til en tæt pasning. I begyndelsen af hvert forsøg trykket i pipetten ækvilibreres til det atmosfæriske tryk. Pipetten er monteret på en mikromanipulator, som tillader præcis kontrol af pipetten bevægelser i en mikrometer. Anbring en pipette i en flad vinkel til bunden af kammeret og bringe spidsen af pipetten til midten af synsfeltet. The skaft af pipetten, en cylindrisk del af pipettespidsen, hvori membranen er opsuget, er rettet ind vandret til brændplanet ved (1) at positionere pipetten i den overfladiske vinkel muligt (10-15 °) og (2) ved bøjning af skaftet af pipetten mod bunden af kammeret. Idet skaftet er meget tynd det er fleksibelt nok til at glide på bunden af kammeret, mens nærmer en celle, som vist skematisk i figur 1.. Langsomt nedbringe mikropipetten til siden af en enkelt celle ved hjælp løbet manipulator indtil nær fokusplanet for cellen. Så ved hjælp af en fin manipulator bevæge mikropipetten til kanten af cellen, indtil spidsen af pipetten netop rører membranen. Tage et billede til at observere positionen af pipetten. Gode tætninger opstår, når hele spidsen af pipetten er i fuld kontakt med celleoverfladen og kontakten er stabil. Der er ingen stærk objektivt kriterium, men om hvor god forseglingen er excEPT for den visuelle undersøgelse.
- Påfør et skridt af undertryk ved hjælp af transduceren og vedligeholde den, indtil membran projektion er stabiliseret. Mængden af tryk, der behøves for at aspirere membranen ind i pipetten varierer afhængigt af celletype og specifikke eksperimentelle betingelser. I vores eksperimenter, er indledende deformation er normalt, når der påføres tryk i området mellem -2 til -15 mm Hg. Når trykket påføres er membranen gradvist deformeret ind i pipetten, indtil det stabiliseres ved vis længde, en proces der tager typisk 2-3 min. I dette tidsrum er billeder af membranen deformation erhvervet hvert 30. sek at spore progressionen af membranen, der trækkes ind i pipetten.
- Forøge trykket til det næste niveau i 2-5 mm Hg trin og gentage hele proceduren, indtil membran fremspring frigøres fra cellen og bevæger sig ind i pipetten, på hvilket tidspunkt forsøget afbrydes.
For at kvantificere graden af membranens deformation, er den aspirerede længde (L) målt fra spidsen af pipetten til toppunktet af periferien af membranen fremspring. Det er vigtigt at bemærke, at et større pipette vil anvende større kraft på cellemembranen ved samme trykniveau. For at redegøre for variationen i diameter mellem pipetterne, derfor er det aspirerede længde normaliseret for pipetten diameter (D) målt for hvert eksperiment.
De data kan analyseres yderligere under anvendelse af en standard lineære viskoelastiske halvrum model af endotelcelle, som beskrevet i de tidligere undersøgelser 6,7. Specifikt blev de elasticitetsmodul for de celler, estimeret under anvendelse af ligningen:
hvor E er Youngs modul, a er den indreradius af pipetten, Ap er trykforskellen, L er den tilsvarende aspirerede længde, og φ (η) er en væg fungerer beregnet ved hjælp af kraft-modellen, som beskrevet af Theret et al 7. Det er vigtigt at bemærke, at flere modeller har været anvendt til at analysere microaspiration data herunder en finite element model, der antager, at en celle er en deformerbar kugle med isotrope og homogen materialeegenskaber og væskedråbe modeller, der antager, at celler danner en sfærisk form, kan deformere kontinuerligt, og inddrive efter frigivelse, som beskrevet i adskillige fremragende anmeldelser: 8-10. Microaspiration kan også bruges til at undersøge andre biomekaniske parametre for celler og væv, såsom cellulære viskoelastiske egenskaber, kortikal spændinger og bidrag til de forskellige strukturelle elementer til celler og væv biomekanik (se anmeldelser anført ovenfor for mere information).
5. RepræsentantResultater
I tidligere undersøgelser blev mikropipette aspiration udført enten på liposomer 5 eller på celler, der ikke var bundet til substratet 2,11-13. I vore undersøgelser er der imidlertid cellerne opretholdes typisk fastgjort til substratet for at undgå ændringer i cytoskelet-struktur, der kan forekomme, når cellerne løsnes 14-16. For at validere anvendelse af microaspiration teknik til substrat-vedhæftede celler, testede vi, om afbrydelse af F-actin resulterer i fald i cellen stivhed af bovine aortiske endotheliale celler (BAECs), bestemt ved denne fremgangsmåde. Figur 3 viser, at som forventet Dette er tilfældet. Specifikt Figur 3A viser en typisk række af fluorescerende billeder af en endotel membran undergår progressiv deformation som reaktion på negativt tryk påføres gennem en mikropipette. Som forventet er membranen gradvist aspireret ind i pipetten og aspirated længden forøges som en funktion af påført tryk. Den tid-kurser af deformation viser, at afbrydelse af F-actin øger de aspirerede længder af fremskrivninger under alle trykforhold (figur 3B) 14.
Under anvendelse af denne metode opdagede vi, at celle stivhed øges, når cellulære membraner tømt for cholesterol henviser cholesterol berigelse havde ingen effekt 14. Figur 4 viser et cholesterol-beriget celle, en kontrol-celle, og et cholesterol-udtømte celler efter at have nået maksimal aspiration længder på -15 mm Hg (4A). Fremskrivningerne typisk begyndt at udvikle på-10mmHg og tidsmæssige forløb af membran deformation kunne måles for de negative pres fra -10, -15 og -20 mm Hg (4B). Anvendelse af tryk over-25mmHg resulterede i frigørelse af den opsugede fremspring danner en særskilt vesikel. Trykket niveau, der resulterede i membran detachement var similar under forskellige kolesterol betingelser. Denne observation var yderst uventet, fordi tidligere undersøgelser viste, at i membran lipiddobbeltlag en forøgelse af membran-cholesterol øger stivheden af membranen 5,17. Vore yderligere undersøgelser bekræftede disse observationer ved hjælp af flere uafhængige tilgange, herunder Atomic Force Mikroskopi 18,19 og Force Traction Microscopy 20.
Figur 1. Skematisk sidebillede af en optagelse pipette. Pipetten trækkes at generere et cylindrisk skaft ved spidsen (set fra siden). Mikropipette parametre: D = 2a = indvendig diameter og ED = 2b = udvendig diameter.
Figur 2. Mikropipette nærmer sig en substrat-tilknyttet celle (A) skematisk sidebillede. (B) Bright kontrast billede af en mikropipette shank røre en typisk formet celle anvendt i aspiration eksperimenter, (C) Fluorescerende billede af den samme celle mærket med DiIC 18. Den mikropipette er stadig til stede, men er usynlig (Fra 14).
Figur 3. Validering af målecelle stivhed i substrat-vedhæftede celler, der bruger microaspiration. A: Billeder af progressiv membran deformation af BAECs under kontrol betingelser og efter udsættelse for latrunculin Pipetten er usynlig på billederne, fordi det ikke fluorescerer.. Cellerne blev eksponeret for 2 uM latrunculin A i 10 minutter, hvilket drastisk reduceret mængden af F-actin, som målt ved rhodamin-phalloidin fluorescens (ikke vist), men har ingen signifikant virkning på cellen form. I en latrunculin-behandlede celle er der en udtynding af membranen i midten af den opsugede fremspring, men fremspringet er stadig fastgjort til cAlen. B. Virkning af latrunculin A på tidsforløbene af membran deformation, hvor L er indsugning længden af membranen fremspring og D er diameteren af pipetten for kontrolceller (n = 14) og celler udsat for 2 uM latrunculin A i 10 minutter (n = 5). Cellerne blev aspireret med -10 mm Hg (ruder), -15 mm Hg (firkanter) og -20 mm Hg (trekanter). (Fra 14).
Figur 4. Virkning af cellulære cholesterolniveauer på membran deformation af BAECs. . En typisk billeder af membranen deformation af cholesterol-beriget, cholesterol-depleterede og kontrolceller (kontrol celler blev udsat for MβCD: MβCD-cholesterol blanding på 1:1, som ikke havde nogen effekt på niveauet af frit cholesterol i cellerne (se inset). De viste billeder viser den maksimale deformation på -15 mm Hg. Pilen angiver positionen af det aspirerede fremspring. Baren er 30 um. B. Gennemsnitlig time-kurser af aspirerede længder til de tre eksperimentelle cellepopulationer. C. Maksimale aspirerede længder afbildet som en funktion af det påførte tryk. Den maksimale normaliserede længde i udtømte celler var signifikant lavere end for kontrolceller til tryk på -15 mm Hg og -20 mm Hg (p <0,05). (Fra 14).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Microaspiration tilvejebringer en enkel og yderst reproducerbar metode til at estimere celle stivhed / deformerbarhed ved påtrykning af negativt tryk til en cellemembran og måling membran deformerbarhed som reaktion på veldefineret tryk. Den blev først udviklet af Mitchison og Swann (1954) til at karakterisere de elastiske egenskaber af soepindsvin æg til at give indsigt i mekanismerne i celledeling 21 og derefter at se på de mekaniske egenskaber i røde blodlegemer 1. Denne metode er blevet anvendt i flere undersøgelser for at vurdere de biomekaniske egenskaber i forskellige celletyper (f.eks 2,3,12,13). Vores seneste undersøgelser udvidet denne metode til at estimere stivheden af substrat-vedhæftede celler ved at kombinere microaspiration med 3D billeddannelse 14,15,22. Membrane stivhed og elasticitet giver kritisk information om cellefænotype, og hvordan cellerne reagerer på et dynamisk miljø, især til en række mekanisk fingerpegs, som genereres af hæmodynamiske kræfter i blodstrømmen eller ved at ændre de viskoelastiske egenskaber af den ekstracellulære matrix. Faktisk har tidligere undersøgelser vist, at celle stivhed øges som reaktion på fluid forskydningsspænding 13,23 og som en funktion af stivheden af substratet 16,24. Ændringer i celle stivhed forventes at få stor indflydelse på celle mechanosensitivity og mechanotransduction. Specifikt har vi for nyligt vist, at en forøgelse af endotel-stivhed letter deres følsomhed til at flyde 25. Vi har også vist, at endotel afstivning er forbundet med en stigning i deres angiogen potentielle 22. Endvidere et fald i membran stivhed og viskositet karakteriserer proliferative senfase ovariecancerceller indikerer, at disse egenskaber kan hjælpe med at differentiere tidligt stadium versus en aggressiv maligne fænotype 26.
Målecelle stivhed også kan providE-dur indsigt i strukturen og organisationen af cytoskelettet. En vigtig faktor celle stivhed er den sub-membran cytoskelet, især F-actin 6,14. Ændringer i celle-stivhed kan også afspejle cytoskeletal omflytning som respons på forskellige signaleringsbegivenheder, herunder aktivering af Rho-GTPaser 27, en hovedmekanisme, at parret mellem membranen og cytoskelettet 28. Endvidere kan ændringer i celle stivhed påvises, selv når ingen tydelige ændringer i strukturen af cytoskelettet net overholdes 14 antyder, at denne fremgangsmåde er mere følsom over for små ændringer i cytoskelettet struktur end visualisering af nettene.
Med hensyn til alternative tilgange, giver microaspiration et nyttigt og billigt alternativ til Atomic Force Microscopy (AFM), der typisk bruges til at måle celle stivhed 29,30. I modsætning til AFM, som måler de lokale membrane stivhed, microaspiration giver et globalt mål for deformerbarhed af en celle. Andre metoder til at estimere cellulære biomekaniske egenskaber omfatter forskellige perle / partikel tilgange, såsom magnetisk vride cytometri 31-33, partikel sporing 34,35, samt flere andre metoder, såsom cytoindenter, en metode, der er noget der ligner AFM 36 og optisk pincet 37. Mens en detaljeret komparativ analyse af disse teknikker er uden for rammerne af dette manuskript, er de vigtigste forskelle mellem dem og microaspiration er følgende: (i) Magnetic vride cytometri indebærer anvendelse af en ydre kraft til en perle fastgjort til cellerne overflade for at forårsage lokal membran deformation på stedet, hvor vulsten er fastgjort hvilket er mest vigtigt at bestemme styrken-induceret stivhed respons 31, (ii) Particle sporing kan anvendes til flere formål, såsom estimere den kraft, der cellerne udøver på substsats (Traction Force Microscopy) 34 eller anslå stivheden af de interne "dybe" lag af cellen ved at analysere bevægelsen af kuglerne eller organeller inde i cellen 35. I modsætning hertil er optiske tweezesrs bruges til at trække membran nanorør (bindsler) at estimere cortical spænding og membran-cytoskelet adhæsion 37. En alternativ metode til at trække membran bindsler er at bruge AFM, en metode, der både har væsentlige ligheder og forskelle i forhold til optisk pincet 18,38. Fordelen ved de fleste af disse metoder er, at de kan give detaljerede geografisk information om de biomekaniske egenskaber i de enkelte celler. Imidlertid er alle disse teknikker kræver enten meget dyrt udstyr eller sofistikerede og ikke lettilgængelige softwarepakker. Styrken af microaspiration på den anden side er, at det er en god som andre metoder at give kvantitative resultater og skelne mellem specifikke mekaniske models af cellen uden behov for højt specialiseret udstyr eller software. Sammenfattende, selv om der er flere tilgange til vurdering af de biomekaniske egenskaber af celler og væv microaspiration fortsat en nyttig og kraftig metode til at undersøge cellulære biomekanik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sutter pipette puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| Microforge | Narishige | MF-830 | |
| Inverted Fluorescent Microscope | Zeiss | Axiovert 200M | The microscope should be preferably equipped with 3D/deconvolution capabilities. |
| Videocamera | Zeiss | AxioCam MRm | |
| Image Acquisition sotware | Zeiss | AxioVision | |
| Pneumatic Pressure Transducer | BioTek | DPM-1B | DPM1B Pneumatic Transducer Tester can now be found by FLUKE. |
| Pipette glass | Richland | Customized glass | Pipettes were customized with a 1.2 inner diameter and 1.6 outer diameter. |
| DiI Dye | Invitrogen | D282 | Dissolves well in DMSO |
References
- Rand, R. P., Burton, A. C. Mechanical properties of the red cell membrane. I. Membrane stiffness and intracellular pressure. Biophys. J. 4, 115-135 (1964).
- Discher, D. E., Mohandas, N., Evans, E. A. Molecular maps of red cell deformation: hidden elasticity and in situ connectivity. Science. 266, 1032-1035 (1994).
- Schmid-Schönbein, G. W., Sung, K. L., Tözeren, H., Skalak, R., Chien, S. Passive mechanical properties of human leukocytes. Biophys. J. 36, 243-256 (1981).
- Guilak, F., Tedrow, J. R., Burgkart, R. Viscoelastic properties of the cell nucleus. Biochem. Biophys. Re.s Commun. 269, 781-786 (2000).
- Needham, D., Nunn, R. S. Elastic deformation and failure of lipid bilayer membranes containing cholesterol. Biophys. J. 58, 997-1009 (1990).
- Sato, M., Theret, D. P., Wheeler, L. T., Ohshima, N., Nerem, R. M. Application of the micropipette technique to the measurement of cultured porcine aortic endothelial cell viscoelastic properties. Journal of Biomechanical Engineering. 112, 263-268 (1990).
- Theret, D. P., Levesque, M. J., Sato, F., Nerem, R. M., Wheeler, L. T. The application of a homogeneous half-space model in the analysis of endothelial cell micropipette measurements. J. of Biomechanical Engineering. 110, 190-199 (1988).
- Hochmuth, R. M. Micropipette aspiration of living cells. J. Biomech. 33, 15-22 (2000).
- Lim, C. T., Zhou, E. H., Quek, S. T. Mechanical models for living cells--a review. Journal of Biomechanics. 39, 195 (2006).
- Zhao, R., Wyss, K., Simmons, C. A. Comparison of analytical and inverse finite element approaches to estimate cell viscoelastic properties by micropipette aspiration. Journal of Biomechanics. 42, 2768 (2009).
- Chien, S., Sung, K. L., Skalak, R., Usami, S., Tozeren, A. Theoretical and experimental studies on viscoelastic properties of erythrocyte membrane. Biophys. J. 24, 463-487 (1978).
- Evans, E., Kuhan, B. Passive material behavior of granulocytes based on large deformation and recovery after deformation tests. Blood. 64, 1028-1035 (1984).
- Sato, M., Levesque, M. J., Nerem, R. M. Micropipette aspiration of cultured bovine aortic endothelial cells exposed to shear stress. Arteriosclerosis. 7, 276-286 (1987).
- Byfield, F., Aranda-Aspinoza, H., Romanenko, V. G., Rothblat, G. H., Levitan, I. Cholesterol depletion increases membrane stiffness of aortic endothelial cells. Biophys. J. 87, 3336-3343 (2004).
- Byfield, F. J., Hoffman, B. D., Romanenko, V. G., Fang, Y., Crocker, J. C., Levitan, I. Evidence for the role of cell stiffness in modulation of volume-regulated anion channels. Acta. Physiologica. 187, 285-294 (2006).
- Byfield, F. J., Reen, R. K., Shentu, T. -P., Levitan, I., Gooch, K. J. Endothelial actin and cell stiffness is modulated by substrate stiffness in 2D and 3D. Journal of Biomechanics. 42, 1114 (2009).
- Evans, E., Needham, D. Physical properties of surfactant bilayer membranes: thermal transitions, elasticity, rigidity, cohesion and colloidal interactions. Journal of Physical Chemistry. 91, 4219-4228 (1987).
- Sun, M., Northup, N., Marga, F., Huber, T., Byfield, F. J., Levitan, I., Forgacs, G. The effect of cellular cholesterol on membrane-cytoskeleton adhesion. J. Cell. Sci. 120, 2223-2231 (2007).
- Shentu, T. P., Titushkin, I., Singh, D. K., Gooch, K. J., Subbaiah, P. V., Cho, M., Levitan, I. oxLDL-induced decrease in lipid order of membrane domains is inversely correlated with endothelial stiffness and network formation. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 299, 218-229 (2010).
- Norman, L. L., Oetama, R. J., Dembo, M., Byfield, F., Hammer, D. A., Levitan, I., Aranda-Espinoza, H. Modification of Cellular Cholesterol Content Affects Traction Force, Adhesion and Cell Spreading. Cell Mol. Bioeng. 3, 151-162 (2010).
- Mitchinson, J. M., Swann, M. M. The Mechanical Properties of the Cell Surface: I. The Cell Elastimeter. J. of Experimental Biology. 31, 443-460 (1954).
- Byfield, F. J., Tikku, S., Rothblat, G. H., Gooch, K. J., Levitan, I. OxLDL increases endothelial stiffness, force generation, and network formation. J. Lipid Res. 47, 715-723 (2006).
- Ohashi, T., Ishii, Y., Ishikawa, Y., Matsumoto, T., Sato, M. Experimental and numerical analyses of local mechanical properties measured by atomic force microscopy for sheared endothelial cells. Biomed. Mater. Eng. 12, 319-327 (2002).
- Solon, J., Levental, I., Sengupta, K., Georges, P. C., Janmey, P. A. Fibroblast adaptation and stiffness matching to soft elastic substrates. Biophysical Journal. 93, 4453 (2007).
- Kowalsky, G. B., Byfield, F. J., Levitan, I. oxLDL facilitates flow-induced realignment of aortic endothelial cells. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 295, 332-340 (2008).
- Ketene, A. N., Schmelz, E. M., Roberts, P. C., Agah, M. The effects of cancer progression on the viscoelasticity of ovarian cell cytoskeleton structures. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. , Forthcoming (2011).
- Kole, T. P., Tseng, Y., Huang, L., Katz, J. L., Wirtz, D. Rho kinase regulates the intracellular micromechanical response of adherent cells to rho activation. Mol. Biol. Cell. 15, 3475-3484 (2004).
- Hall, A. Rho GTPases and the Actin Cytoskeleton. Science. 279, 509-514 (1998).
- Okajima, T. Atomic Force Microscopy for the Examination of Single Cell Rheology. In. Methods Mol. Biol. 736, 303-329 (2011).
- Wang, N., Butler, J. P., Ingber, D. E. Mechanotransduction across the cell surface and through the cytoskeleton. Science. 260, 1124-1127 (1993).
- Fabry, B., Maksym, G. N., Butler, J. P., Glogauer, M., Navajas, D., Fredberg, J. J. Scaling the microrheology of living cells. Physical Review Letters. 87, 148102 (2001).
- Park, C. Y., Tambe, D., Alencar, A. M., Trepat, X., Zhou, E. H., Millet, E., Butler, J. P., Fredberg, J. J. Mapping the cytoskeletal prestress. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 298, C1245-C1252 (2010).
- Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. Traction force microscopy of migrating normal and H-ras transformed 3T3 fibroblasts. Biophys. J. 80, 1744-1757 (2001).
- Wirtz, D. Particle-tracking microrheology of living cells: principles and applications. Annu. Rev. Biophys. 38, 301-326 (2009).
- Shin, D., Athanasiou, K. Cytoindentation for obtaining cell biomechanical properties. J. Orthop. Res. 17, 880-890 (1999).
- Ou-Yang, H. D., Wei, M. T. Complex fluids: probing mechanical properties of biological systems with optical tweezers. Annu. Rev. Phys. Chem. 61, 421-440 (2010).
- Hosu, B. G., Sun, M., Marga, F., Grandbois, M., Forgacs, G. Eukaryotic membrane tethers revisited using magnetic tweezers. Phys. Biol. 4, 67-78 (2007).
