Summary
Här beskriver vi en snabb och enkel metod för att mäta cell styvhet. Den allmänna principen i denna strategi är att mäta membran deformation som svar på väldefinierade undertryck appliceras via en mikropipett till cellytan. Denna metod ger ett kraftfullt verktyg för att studera biomekaniska egenskaper hos substrat-anslutna celler.
Abstract
Växande antal studier visar att biomekaniska egenskaper hos enskilda celler spelar viktiga roller i flera cellulära funktioner, inklusive cellproliferation, differentiering, migration och cell-cell interaktioner. De två viktigaste parametrarna för cellulära biomekanik är cellulära deformerbarhet eller styvhet och förmåga hos cellerna att ta upp och skapa kraft. Här beskriver vi en snabb och enkel metod för att uppskatta cell styvhet genom att mäta graden av membranets deformation som svar på undertryck som tillämpas av ett glas mikropipett till cellytan, en teknik som kallas Mikropipett aspiration eller Microaspiration.
Microaspiration utförs genom att dra en glaskapillär att skapa en mikropipett med en mycket liten spets (2-50 | im diameter beroende på storleken av en cell eller ett vävnadsprov), som sedan ansluts till en pneumatisk tryckomvandlare och bringas till ett nära närhet av en cell under ett mikroskop. Närpipettspetsen nuddar en cell, ett steg med negativt tryck appliceras på pipetten av den pneumatiska tryckgivaren genererar väldefinierad tryck på cellmembranet. Som svar på tryck, är membranet aspireras in i pipetten och progressiva membran deformation eller "membran utsprång" in i pipetten mäts som en funktion av tiden. Den grundläggande principen för detta experimentella tillvägagångssätt är att graden av membranets deformation i gensvar till en definierad mekanisk kraft är en funktion av membranets styvhet. Den styvare membranet är, desto långsammare hastigheten av membranets deformation och den kortare steady-state aspiration length.The teknik kan utföras på isolerade celler, både i suspension och substrat-anslutna, stora organeller, och liposomer.
Analys utförs genom att jämföra maximala membran deformationer som uppnåtts under ett givet tryck för olika cellpopulationer eller experimentella förhållanden. En "styvhet koefficient" är estimated genom plottning den insugna längd membranets deformation som en funktion av det applicerade trycket. Vidare kan data analyseras ytterligare för att uppskatta den Youngs modul av cellerna (E), den vanligaste parametern för att karaktärisera styvhet av material. Det är viktigt att notera att plasmamembran av eukaryota celler kan ses som en tvåkomponents system där membran lipiddubbelskikt är underlied av sub-membran cytoskelettet och att det är cytoskelettet som utgör den mekaniska ställningen hos membranet och dominerar deformerbarheten av den cellulära höljet. Detta tillvägagångssätt tillåter därför sondera biomekaniska egenskaperna hos sub-membranet cytoskelettet.
Protocol
1. Pulling Glass Mikropipetter
Utrustning: Mikropipett Avdragare, Microforge.
Glas: Boroscillicate glaskapillärer (~ 1,5 mm ytterdiameter, ~ 1,4 mm innerdiameter).
- Mikropipetter dras med samma grundsyn som används för att förbereda glasmikroelektroder för elektrofysiologi inspelningar. Kortfattat är en glaskapillär upphettas i mitten och när glaset börjar smälta de två halvorna av kapillären dras isär genererar två mikropipetter. Flera kommersiella avdragare är tillgängliga för att utföra denna process som sträcker sig från relativt enkla vertikala avdragare som använder tyngdkraften för att dra de två pipetter isär till högt sofistikerade horisontella avdragare som erbjuder flera programmerbara alternativ för att variera hastigheten och andra parametrar av pull. Båda typerna av avdragare användes i våra experiment.
- Kravs för geometrin hos pipettspetsen: Spetsarna på pipetterna som används i dessa experiment sträcker sig typiskt mellan 2 till 6 ^ m yttre diameter, beroende på storleken av cellen. En annan viktig parameter är formen hos spetsen, vilket skall ligga ett cylindriskt rör (se figur 1). Detta kan uppnås genom att optimera parametrarna i den pådragbara och kontrollera formen på spetsen under mikroskop tills den önskade formen erhålles. Den optimala längden av pipetten skaftet beror på mängden av förväntad deformation: om deformationerna är små <10 | im, är det tillräckligt att cylinder-liknande delen av pipetten är också relativt kort (samma storleksordning), för större deformationer justera. I allmänhet, ökar värmen och / eller ökning av "pull" minskar diametern av spetsen. Ökningen i "pull" skapar också en spets med en längre kona. I våra experiment, med användning av en Sutter P-97 horisontell pipett avdragare, var programmetoptimerad för följande parametrar: värme 473, Pull 22, Velocity 22, Tid 200, Pressure 500. Det är också möjligt att skapa cylindriska tips genom att dra en mycket lång skaft och sedan bryta och torkar den. Detaljerade instruktioner om hur du förbereder olika typer av pipetterna ges i Sutter manualen.
- Microforge: Det rekommenderas också att avfyra-polera pipettspetsen att generera en jämn glasyta som gör en bra tätning till plasmamembranet. Detta görs genom att spetsen av pipetten till närheten av en uppvärmd glaskula för en mycket en bråkdel av en sekund med användning av en microforge. Liknande teknik används rutinmässigt för framställning av mikroelektroder för elektrofysiologiska inspelningar.
- Påfyllning av Mikropipett: Mikropipetter bör fyllas med en fysiologisk saltlösning, såsom PBS eller icke-fluorescerande material tillväxt. Viktigt lösningen bör kompletteras med 30% serum som gör det möjligt för cellen medlemmarbrane att röra sig mjukt in i pipetten. Två metoder kan användas för att bli av luftbubblor i pipettspetsen: (i) en spets hos pipetten kan sänkas ned i lösningen först låta vätskan fylla spetsen av de kapillärkrafter följt av återfyllning pipetten från den andra änden eller (ii) hela pipetten kan fyllas från den bakre änden genom att försiktigt knacka på skaftet av pipetten att avlägsna bubblor från spetsen.
- Obs: Pipetter måste vara beredd på dagen för experimentet.
2. Framställning av celler
- Ympning av cellerna: Microaspiration utförs på enskilda celler som antingen upprätthålls i suspension eller är fästa till substratet. Att aspirera celler i suspension, är celler lyfts från sina substrat och pipetterades in i en grund longitudinell kammare som är monterad på den inverterat mikroskop precis innan experimentet. Att aspirera substrat-vidhäftade celler, cellerympas på små täckglas (~ 10 mm i diameter) som även kan placeras i microaspiration kammaren före experimentet. Den logiska grunden för att använda en grund longitudinell kammare är att låta en mikropipett att närma cellerna i en mycket flack vinkel, så nära horisontellt som möjligt. Detta görs för att tillåta membranet dras in i mikropipett för att visualiseras på en enda plan av fokus (se figur 2).
- Visualisering cellmembran: att observera membranet utsprånget in i pipetten, är cellulära membran färgas med en lipofil fluorescerande färgämne, såsom Dii med en vanlig färgningsprotokollet.
- Varm PBS-lösning.
- Späd beståndet Dil till en fungerande koncentration (5 pM) med den uppvärmda PBS-lösning.
- Sonikera 5 min för att bryta dye aggregat.
- Centrifugera ner under 5 min och ta supernatanten.
- Tvätta cellerna i PBS 3 gånger, 5 min vardera.
- Inkubera cellerna med färgämnet såföroreningarna under 30 min i en 37 ° C inkubator.
- Tvätta cellerna med PBS 3 gånger under 5 min vardera.
- Obs: Det är möjligt att ersätta Dii färgning av membranet med visualisering sub-membran cytoskelettet som också dras tillsammans med membranet in i pipetten. Det måste tas i beaktande, dock att störande cytoskelettet kan förändra de biomekaniska egenskaperna hos cellen. Dessutom, när man utför microaspiration experiment med substrat vidhäftade celler, rekommenderas det att använda 3D-röntgen för att uppskatta längden av membran projektion in i pipetten som är placerad vid en vinkel till fokalplanet av cellerna.
3. Microaspiration och Image Acquisition
Utrustning: Inverterad fluorescensmikroskop, helst med 3D dekonvolution funktioner (Zeiss Axiovert 200M med datorstyrd Z-axel rörelse objectives eller motsvarande), videokamera ansluten till en dator (AxioCam MRM eller motsvarande), tryckgivare (BioTek eller motsvarande), Vibrationsfri station (TMD eller motsvarande), mikromanipulator (Narishige, Sutter, Burleigh eller motsvarande; manipulatorer kan vara mekanisk, hydraulisk eller piezoelektrisk). Det är också viktigt att betona att microaspiration kan utföras med ett mikroskop utan 3D-kapacitet för att uppskatta styvhet celler i suspension, såsom röda blodkroppar 1,2 eller neutrofiler 3, isolerade organeller såsom kärnor 4 eller konstgjorda liposomer 5.
Bild förvärv programvara: Zeiss AxioVision eller motsvarande.
- Montera cellerna in i en microaspiration kammare, såsom beskrivits ovan, på ett inverterat fluorescensmikroskop. Placera de celler välja en cell för ett experiment och placera den i mitten av synfältet. Det är viktigt att perform dessa experiment i en vibrationsfri miljö, särskilt för experimenten med substrat-anslutna celler eftersom minut vibrationer som normalt kan förekomma på bänkar och regelbundna bord sannolikt att helt äventyra skapandet av tätningen bryta spetsen av mikropipett eller resultera i betydande förskjutningar i positionen av spetsen som kommer skeva analysen av resultaten.
- Placera en mikropipett fylld med PBS / media w / serumlösning i en pipett hållare ansluten till en ström omvandlare med flexibla slangar med diametern justeras till connecter av pipetten hållare för en tät passning. I början av varje experiment trycket i pipetten jämviktas till atmosfärstrycket. Pipetten är monterad på en mikromanipulator som medger finreglering av pipetten rörelserna i ett mikron. Placera en pipett med en flack vinkel till botten av kammaren och föra spetsen av pipetten till mitten av synfältet. The skaft av pipetten, en cylindrisk del av pipettspetsen i vilken membranet aspireras, är inriktad horisontellt till fokalplanet genom (1) placering av pipetten i det grundaste vinkeln möjlig (10-15 °) och (2) genom böjning skaftet av pipetten mot bottnen av kammaren. Eftersom skaftet är mycket tunn är det tillräckligt flexibelt för att glida på botten av kammaren medan närmar en cell, såsom visas schematiskt i figur 1. Långsamt sänka mikropipetten till sidan av en enda cell med kursen manipulatorn tills nära fokalplanet för cellen. Därefter, med användning av en fin manipulator flytta mikropipett till kanten av cellen tills spetsen av pipetten nuddar membranet. Ta en bild för att observera positionen för pipetten. Goda tätningar skapas när hela pipettspetsen är i full kontakt med cellytan och kontakten är stabil. Det finns inga starka objektivt kriterium, men hur bra tätningen är ex momsEPT för visuell undersökning.
- Applicera ett steg undertryck med hjälp av givaren och upprätthålla det till dess membran projektion har stabiliserats. Den mängd tryck som behövs för att suga membranet in i pipetten varierar beroende på celltyp och specifika experimentella betingelser. I våra experiment, är initiala deformationen typiskt observeras vid applicering av tryck i intervallet mellan -2 till-15mm Hg. När trycket anbringas, är membranet successivt deformeras in i pipetten tills den stabiliseras vid viss längd, en process som normalt tar 2-3 min. Under denna tid, är bilder av membranets deformation förvärvat varje 30 sek för att spåra utvecklingen av membranet som dras in i pipetten.
- Öka trycket till nästa nivå i 2-5 mm Hg steg och upprepa hela proceduren tills membran projektion lossnar från cellen och flyttar in i pipetten, varvid försöket avbryts.
För att kvantifiera graden av membranets deformation, den insugna längden (L) mätt från spetsen av pipetten till vertex av omkretsen av membranet utsprånget. Det är viktigt att notera, emellertid, att en större pipett gäller mer kraft på cellmembranet på samma trycknivå. För att ta hänsyn till variationer mellan diametrarna hos pipetterna därför den insugna längden normaliserad för pipettens diametern (D) mätt för varje experiment.
Uppgifterna kan analyseras ytterligare med användning av en vanlig linjära viskoelastiska halv-utrymme modell av endotelcell, såsom beskrivs i de tidigare studierna 6,7. Specifikt elasticitetsmodulen hos de celler som beräknas med hjälp av ekvationen:
där E är elasticitetsmodulen, är en inreradie av pipetten, är Ap tryckskillnaden, L är den motsvarande aspirerad längd, och φ (η) är en vägg fungerar beräknas med kraften modellen, såsom beskrivs av Theret et al, 7. Det är viktigt att notera att flera modeller har använts för att analysera microaspiration data inklusive en finita element modell som utgår från att en cell är en deformerbar sfär med isotropa och homogen materialegenskaper och flytande modeller droppe, som utgår från att cellerna bildar en sfärisk form, kan deformeras kontinuerligt och återhämta vid avlastning, som beskrivs i flera utmärkta recensioner: 8-10. Microaspiration kan också användas för att undersöka andra biomekaniska parametrar av celler och vävnader, såsom cellulära viskoelastiska egenskaper, kortikal spänning och bidrag av olika strukturella element till cell och vävnad biomekanik (se recensioner som anges ovan för mer information).
5. RepresentantResultat
I tidigare studier har mikropipett aspiration utförs antingen på liposomer 5 eller celler som inte var knutna till underlaget 2,11-13. I våra studier, emellertid, cellerna typiskt bibehållas fäst till substratet för att undvika förändringar i cytoskelett strukturen som är sannolika att inträffa när celler lossnar 14-16. För att validera användningen av microaspiration teknik för substrat-anslutna celler, testade vi om störningar av F-aktin resulterar i minskade i cell styvhet aortaendotelceller från nötkreatur (BAECs), som uppskattas av denna strategi. Figur 3 visar att, som väntat detta är fallet. Närmare bestämt visar figur 3A en typisk serie av fluorescerande bilder av en endotelial membran genomgår progressiv deformering som svar på negativt tryck anbringas genom en mikropipett. Som förväntat, är membranet successivt aspireras in i pipetten och aspirated längd ökar som en funktion av pålagt tryck. Den tid kurser deformationen visar att avbrott i F-aktin avsevärt ökar aspirerade längder prognoserna under alla tryckförhållanden (Figur 3B) 14.
Med användning av detta tillvägagångssätt, upptäckte vi att cellen styvhet ökar när cellmembran utarmas av kolesterol medan kolesterol anrikning hade någon effekt 14. Figur 4 visar en kolesterol-anrikad cell, en kontroll cell och en kolesterol-utarmad cellen efter att ha nått maximal aspiration längder på -15 mm Hg (4A). Prognoserna började vanligtvis utvecklas på-10mmHg och tiden kurser membran deformation kan mätas för de negativa trycket från -10, -15 och -20 mm Hg (4B). Tillämpning av tryck över-25mmHg resulterade i avlossning av aspirerade projektion bildar en separat vesikel. Trycknivån som resulterade i membran avskildhet var Similär under olika betingelser kolesterol. Denna observation var mycket oväntat eftersom tidigare studier visade att i dubbelskikt membranlipid en ökning i membran kolesterol ökar styvheten hos membranet 5,17. Vår fortsatta studier bekräftade dessa observationer med flera oberoende metoder, bland annat atomkraftsmikroskopi 18,19 och Force Traction mikroskopi 20.
Figur 1. Schematisk sidovy av en inspelning pipett. Pipetten dras att generera ett cylindriskt skaft vid spetsen (sidovy). Mikropipett parametrar: D = 2a = innerdiameter och ED = 2b = ytterdiameter.
Figur 2. Mikropipett närmar sig en substrat-bunden cell (A) Schematisk sidovy;. (B) Bright kontrast bild av en mikropipett shärva vidröra en typiskt formad cell som används i experiment aspiration, (C) Lysrör bild av samma cell märkt med DiIC 18. Den mikropipett är fortfarande närvarande men är osynlig (Från 14).
Figur 3. Validering av mätcell styvhet i substrat-vidhäftade celler med microaspiration. A: Bilder av progressiv membran deformering av BAECs under kontrollförhållanden och efter exponering för latrunculin Pipetten är osynlig på bilderna eftersom det inte fluorescerar.. Cellerna exponerades för 2 iM latrunculin A under 10 min, vilket dramatiskt minskat mängden F-aktin, såsom mätt av rodamin-falloidin fluorescens (ej visad) men hade ingen signifikant effekt på cellform. I en latrunculin-behandlad cell finns en förtunning av membranet i mitten av det insugna projicering utan utsprånget är fortfarande fäst till calnar. B. Effekt av latrunculin A på tidsförloppen för membranets deformation där L är aspirerade membranets längd utsprånget och D är diametern av pipetten för kontrollceller (n = 14) och celler exponerade för 2 iM latrunculin A under 10 min (n = 5). Cellerna sögs med -10 mm Hg (diamanter), -15 mm Hg (kvadrater) och -20 mm Hg (trianglar). (Från 14.)
Figur 4. Effekt av cellulära kolesterolnivåer på membran deformation av BAECs. . En typisk bilder av membran deformering av kolesterol-berikade, kolesterol-utarmat och celler kontroll (kontroll celler utsattes för MβCD: MβCD-kolesterol blandning vid förhållandet 1:1 som inte hade någon effekt på nivån av fritt kolesterol i cellerna (se infälld). Bildarna visar den maximala deformation vid -15 mm Hg. Pilen indikerar positionen av det insugna utsprånget. Baren är 30 nm. B. Genomsnittlig tid-kurser aspirerade längder för de tre experimentella cellpopulationer. C. Maximala längder aspirerade plottad som en funktion av det applicerade trycket. Den maximala normaliserade längd i utarmade celler var signifikant lägre än den för kontrollceller för tryck -15 mm Hg och -20 mm Hg (P <0,05). (Från 14.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Microaspiration ger en enkel och mycket reproducerbar metod för att uppskatta celler styvhet / deformerbarhet genom tillförande av undertryck till ett cellmembran och mäta membran deformerbarhet som svar på väl definierade tryck. Det utvecklades först av Mitchison och Swann (1954) för att karakterisera de elastiska egenskaperna hos sjöborre ägg för att ge insikter i mekanismerna för celldelning 21 och sedan titta på de mekaniska egenskaperna i röda blodkroppar 1. Denna metod har använts i flera studier för att bedöma de biomekaniska egenskaperna hos olika celltyper (t.ex. 2,3,12,13). Våra senaste undersökningar utvidgades denna metod för att uppskatta styvheten av substrat-anslutna celler genom att kombinera microaspiration med 3D avbildning 14,15,22. Membran styvhet och elasticitet ger viktig information om cellfenotyp och hur celler svarar på en dynamisk miljö, särskilt till en mängd mekanisk ledtrådar som genereras av hemodynamiska krafter blodflödet eller genom att ändra de viskoelastiska egenskaperna hos den extracellulära matrisen. I själva verket har tidigare studier visat att cell styvhet ökar i gensvar på fluidum skjuvspänning 13,23 och som en funktion av styvheten hos substratet 16,24. Förändringar i cell styvhet väntas få en stor inverkan på celler mechanosensitivity och mechanotransduction. Specifikt har vi visat nyligen att en ökning av endotel styvhet underlättar deras känslighet att flöda 25. Vi har också visat att endotel förstyvning är förknippad med en ökning i deras angiogena potentiell 22. Dessutom en minskning membran styvhet och viskositet kännetecknar proliferativa slutskedet äggstockscancer celler indikerar att dessa egenskaper kan hjälpa skilja tidigt jämfört med en aggressiv malign fenotyp 26.
Mätcell stelhet kan också providE-dur insikter i struktur och organisation cytoskelettet. En viktig faktor cell styvhet är sub-membran cytoskelettet, särskilt F-aktin 6,14. Förändringar i cell styvhet kan också återspegla cytoskelett nytt arrangemang som svar på olika signalsystem händelser, såsom aktivering av Rho-GTPaser 27, en stor mekanism som par mellan membranet och cytoskelettet 28. Dessutom kan förändringar i cellernas styvhet detekteras även när inga uppenbara förändringar i strukturen av cytoskelettet nätverken observeras 14 tyder på att detta tillvägagångssätt är mer känslig för subtila förändringar i cytoskelettet struktur än visualisering av näten.
När det gäller alternativa metoder, ger microaspiration ett användbart och billigt alternativ till atomkraftsmikroskopi (AFM) som normalt används för att mäta cell styvhet 29,30. I motsats till AFM som mäter lokalt Membrane styvhet, ger microaspiration en övergripande mått på deformerbarhet en cell. Andra metoder för att skatta cellulära biomekaniska egenskaper inkluderar olika pärla / partikel metoder, såsom magnetisk vridning cytometri 31-33, partikel spårning 34,35, liksom flera andra metoder, till exempel cytoindenter, en metod som är något liknande AFM 36 och optiska pincett 37. Medan detaljerad jämförande analys av dessa tekniker är utanför ramen för detta manuskript, de viktigaste skillnaderna mellan dem och microaspiration är följande: (i) Magnetisk vridning cytometri innebär att tillämpa en extern kraft till en pärla fäst vid cellerna yta för att lokala membran deformation på den plats där kulan är fäst som är viktigast för att bestämma kraft-inducerade hårdnande svar 31, (ii) Particle spårning kan användas för flera olika ändamål, såsom att bedöma den kraft som celler utövar på substhastighet (dragkraft Microscopy) 34 eller uppskatta styvheten hos de interna "djupa" skikt i cellen genom att analysera rörelsen hos kulorna eller organeller inuti cellen 35. I motsats, är optiska tweezesrs används för att dra membran nanorör (tjuder) för att uppskatta kortikal spänning och membran-cytoskelettet vidhäftning 37. En alternativ metod för att dra membran tjuder är att använda AFM, en metod som har både betydande likheter och skillnader jämfört med optisk pincett 18,38. Fördelen med de flesta av dessa metoder är att de kan ge detaljerad rumslig information om biomekaniska egenskaperna hos de enskilda cellerna. Men alla dessa tekniker kräver antingen mycket dyr utrustning eller sofistikerade och inte lätt tillgängliga programvarupaket. Styrkan av microaspiration, å andra sidan, är att det är en bra som andra metoder till att ge kvantitativa resultat och differentiering bland specifik mekanisk modells av cellen utan krav på högt specialiserad utrustning eller programvara. Sammanfattningsvis, medan det finns flera metoder för att bedöma biomekaniska egenskaper hos celler och vävnader, är microaspiration en användbar och kraftfull metod för att undersöka cellulära biomekanik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sutter pipette puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| Microforge | Narishige | MF-830 | |
| Inverted Fluorescent Microscope | Zeiss | Axiovert 200M | The microscope should be preferably equipped with 3D/deconvolution capabilities. |
| Videocamera | Zeiss | AxioCam MRm | |
| Image Acquisition sotware | Zeiss | AxioVision | |
| Pneumatic Pressure Transducer | BioTek | DPM-1B | DPM1B Pneumatic Transducer Tester can now be found by FLUKE. |
| Pipette glass | Richland | Customized glass | Pipettes were customized with a 1.2 inner diameter and 1.6 outer diameter. |
| DiI Dye | Invitrogen | D282 | Dissolves well in DMSO |
References
- Rand, R. P., Burton, A. C. Mechanical properties of the red cell membrane. I. Membrane stiffness and intracellular pressure. Biophys. J. 4, 115-135 (1964).
- Discher, D. E., Mohandas, N., Evans, E. A. Molecular maps of red cell deformation: hidden elasticity and in situ connectivity. Science. 266, 1032-1035 (1994).
- Schmid-Schönbein, G. W., Sung, K. L., Tözeren, H., Skalak, R., Chien, S. Passive mechanical properties of human leukocytes. Biophys. J. 36, 243-256 (1981).
- Guilak, F., Tedrow, J. R., Burgkart, R. Viscoelastic properties of the cell nucleus. Biochem. Biophys. Re.s Commun. 269, 781-786 (2000).
- Needham, D., Nunn, R. S. Elastic deformation and failure of lipid bilayer membranes containing cholesterol. Biophys. J. 58, 997-1009 (1990).
- Sato, M., Theret, D. P., Wheeler, L. T., Ohshima, N., Nerem, R. M. Application of the micropipette technique to the measurement of cultured porcine aortic endothelial cell viscoelastic properties. Journal of Biomechanical Engineering. 112, 263-268 (1990).
- Theret, D. P., Levesque, M. J., Sato, F., Nerem, R. M., Wheeler, L. T. The application of a homogeneous half-space model in the analysis of endothelial cell micropipette measurements. J. of Biomechanical Engineering. 110, 190-199 (1988).
- Hochmuth, R. M. Micropipette aspiration of living cells. J. Biomech. 33, 15-22 (2000).
- Lim, C. T., Zhou, E. H., Quek, S. T. Mechanical models for living cells--a review. Journal of Biomechanics. 39, 195 (2006).
- Zhao, R., Wyss, K., Simmons, C. A. Comparison of analytical and inverse finite element approaches to estimate cell viscoelastic properties by micropipette aspiration. Journal of Biomechanics. 42, 2768 (2009).
- Chien, S., Sung, K. L., Skalak, R., Usami, S., Tozeren, A. Theoretical and experimental studies on viscoelastic properties of erythrocyte membrane. Biophys. J. 24, 463-487 (1978).
- Evans, E., Kuhan, B. Passive material behavior of granulocytes based on large deformation and recovery after deformation tests. Blood. 64, 1028-1035 (1984).
- Sato, M., Levesque, M. J., Nerem, R. M. Micropipette aspiration of cultured bovine aortic endothelial cells exposed to shear stress. Arteriosclerosis. 7, 276-286 (1987).
- Byfield, F., Aranda-Aspinoza, H., Romanenko, V. G., Rothblat, G. H., Levitan, I. Cholesterol depletion increases membrane stiffness of aortic endothelial cells. Biophys. J. 87, 3336-3343 (2004).
- Byfield, F. J., Hoffman, B. D., Romanenko, V. G., Fang, Y., Crocker, J. C., Levitan, I. Evidence for the role of cell stiffness in modulation of volume-regulated anion channels. Acta. Physiologica. 187, 285-294 (2006).
- Byfield, F. J., Reen, R. K., Shentu, T. -P., Levitan, I., Gooch, K. J. Endothelial actin and cell stiffness is modulated by substrate stiffness in 2D and 3D. Journal of Biomechanics. 42, 1114 (2009).
- Evans, E., Needham, D. Physical properties of surfactant bilayer membranes: thermal transitions, elasticity, rigidity, cohesion and colloidal interactions. Journal of Physical Chemistry. 91, 4219-4228 (1987).
- Sun, M., Northup, N., Marga, F., Huber, T., Byfield, F. J., Levitan, I., Forgacs, G. The effect of cellular cholesterol on membrane-cytoskeleton adhesion. J. Cell. Sci. 120, 2223-2231 (2007).
- Shentu, T. P., Titushkin, I., Singh, D. K., Gooch, K. J., Subbaiah, P. V., Cho, M., Levitan, I. oxLDL-induced decrease in lipid order of membrane domains is inversely correlated with endothelial stiffness and network formation. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 299, 218-229 (2010).
- Norman, L. L., Oetama, R. J., Dembo, M., Byfield, F., Hammer, D. A., Levitan, I., Aranda-Espinoza, H. Modification of Cellular Cholesterol Content Affects Traction Force, Adhesion and Cell Spreading. Cell Mol. Bioeng. 3, 151-162 (2010).
- Mitchinson, J. M., Swann, M. M. The Mechanical Properties of the Cell Surface: I. The Cell Elastimeter. J. of Experimental Biology. 31, 443-460 (1954).
- Byfield, F. J., Tikku, S., Rothblat, G. H., Gooch, K. J., Levitan, I. OxLDL increases endothelial stiffness, force generation, and network formation. J. Lipid Res. 47, 715-723 (2006).
- Ohashi, T., Ishii, Y., Ishikawa, Y., Matsumoto, T., Sato, M. Experimental and numerical analyses of local mechanical properties measured by atomic force microscopy for sheared endothelial cells. Biomed. Mater. Eng. 12, 319-327 (2002).
- Solon, J., Levental, I., Sengupta, K., Georges, P. C., Janmey, P. A. Fibroblast adaptation and stiffness matching to soft elastic substrates. Biophysical Journal. 93, 4453 (2007).
- Kowalsky, G. B., Byfield, F. J., Levitan, I. oxLDL facilitates flow-induced realignment of aortic endothelial cells. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 295, 332-340 (2008).
- Ketene, A. N., Schmelz, E. M., Roberts, P. C., Agah, M. The effects of cancer progression on the viscoelasticity of ovarian cell cytoskeleton structures. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. , Forthcoming (2011).
- Kole, T. P., Tseng, Y., Huang, L., Katz, J. L., Wirtz, D. Rho kinase regulates the intracellular micromechanical response of adherent cells to rho activation. Mol. Biol. Cell. 15, 3475-3484 (2004).
- Hall, A. Rho GTPases and the Actin Cytoskeleton. Science. 279, 509-514 (1998).
- Okajima, T. Atomic Force Microscopy for the Examination of Single Cell Rheology. In. Methods Mol. Biol. 736, 303-329 (2011).
- Wang, N., Butler, J. P., Ingber, D. E. Mechanotransduction across the cell surface and through the cytoskeleton. Science. 260, 1124-1127 (1993).
- Fabry, B., Maksym, G. N., Butler, J. P., Glogauer, M., Navajas, D., Fredberg, J. J. Scaling the microrheology of living cells. Physical Review Letters. 87, 148102 (2001).
- Park, C. Y., Tambe, D., Alencar, A. M., Trepat, X., Zhou, E. H., Millet, E., Butler, J. P., Fredberg, J. J. Mapping the cytoskeletal prestress. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 298, C1245-C1252 (2010).
- Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. Traction force microscopy of migrating normal and H-ras transformed 3T3 fibroblasts. Biophys. J. 80, 1744-1757 (2001).
- Wirtz, D. Particle-tracking microrheology of living cells: principles and applications. Annu. Rev. Biophys. 38, 301-326 (2009).
- Shin, D., Athanasiou, K. Cytoindentation for obtaining cell biomechanical properties. J. Orthop. Res. 17, 880-890 (1999).
- Ou-Yang, H. D., Wei, M. T. Complex fluids: probing mechanical properties of biological systems with optical tweezers. Annu. Rev. Phys. Chem. 61, 421-440 (2010).
- Hosu, B. G., Sun, M., Marga, F., Grandbois, M., Forgacs, G. Eukaryotic membrane tethers revisited using magnetic tweezers. Phys. Biol. 4, 67-78 (2007).
