Summary
Aquí se describe un método sencillo y rápido para medir la rigidez de la célula. El principio general de este enfoque consiste en medir la deformación de la membrana en respuesta a la bien definida la presión negativa aplicada a través de una micropipeta a la superficie celular. Este método proporciona una poderosa herramienta para estudiar las propiedades biomecánicas de los adjuntos sustrato células.
Abstract
Creciente número de estudios muestran que las propiedades biomecánicas de las células individuales desempeñan un papel importante en varias funciones celulares, incluyendo la proliferación celular, la diferenciación, la migración y las interacciones célula-célula. Los dos parámetros clave de la biomecánica celulares son deformabilidad celular o la rigidez y la capacidad de las células para contraerse y generar fuerza. Aquí se describe un método rápido y simple para estimar la rigidez celular mediante la medición del grado de deformación de la membrana en respuesta a la presión negativa aplicada por una micropipeta de vidrio a la superficie celular, una técnica que se denomina aspiración Micropipetas o microaspiración.
Microaspiración se realiza tirando de un capilar de vidrio para crear una micropipeta con una punta muy pequeña (2-50 m de diámetro, dependiendo del tamaño de una célula o una muestra de tejido), que luego se conecta a un transductor de presión neumática y llevado a una estrecha vecindad de una célula bajo un microscopio. Cuando elpunta de la pipeta toque una célula, un paso de presión negativa se aplica a la pipeta por el transductor de presión neumática generar presión bien definida en la membrana celular. En respuesta a la presión, la membrana se aspira en la membrana de pipeta y deformación progresiva o "proyección membrana" en la pipeta se mide como una función del tiempo. El principio básico de este enfoque experimental es que el grado de deformación de la membrana en respuesta a una fuerza mecánica definida es una función de la rigidez de la membrana. El más rígida la membrana es, menor es la velocidad de deformación de membrana y la más corta es la técnica de aspiración de estado estacionario longitud.El se puede realizar en células aisladas, tanto en suspensión como adjuntos sustrato, orgánulos grandes, y liposomas.
El análisis se realiza mediante la comparación de las deformaciones máximas de membrana obtenidos en virtud de una presión dada para diferentes poblaciones de células o condiciones experimentales. A "coeficiente de rigidez" es esestimada por el trazado de la longitud de la membrana aspirada de deformación como una función de la presión aplicada. Además, los datos pueden ser analizados para estimar el módulo de Young de las células (E), el parámetro más común para caracterizar la rigidez de los materiales. Es importante señalar que las membranas plasmáticas de las células eucarióticas pueden ser vistos como un sistema bi-componente cuando se underlied bicapa lipídica de la membrana por el citoesqueleto de sub-membrana y que es el citoesqueleto que constituye el andamiaje mecánico de la membrana y domina la deformabilidad de la envoltura celular. Este enfoque, por lo tanto, permite inspeccionar las propiedades biomecánicas del citoesqueleto sub-membrana.
Protocol
1. Tirando Micropipetas de vidrio
Equipamiento: Micropipetas Puller, Microforge.
Vidrio: Boroscillicate capilares de vidrio (~ 1,5 mm de diámetro externo, ~ 1,4 mm de diámetro interno).
- Micropipetas se extraen utilizando el mismo enfoque básico que se utiliza para preparar microelectrodos de vidrio para las grabaciones de electrofisiología. Brevemente, un capilar de vidrio se calienta en el medio y cuando el vidrio comienza a fundirse las dos mitades del capilar se separan generando dos micropipetas. Múltiples extractores comerciales están disponibles para llevar a cabo este proceso van desde extractores verticales relativamente simples que utilizan la gravedad para tirar de las dos pipetas aparte a la altamente sofisticados extractores horizontales que ofrecen múltiples opciones programables para variar la velocidad y otros parámetros de la atracción. Ambos tipos de extractores se usaron en nuestros experimentos.
- Requisitos para la geometría de la punta de la pipeta: Las puntas de las pipetas utilizadas en estos experimentos suelen oscilar entre 2 a 6 m de diámetro externo en función del tamaño de la célula. Otro parámetro importante es la forma de la punta, la cual debe ser aproximadamente un tubo cilíndrico (ver Figura 1). Esto se puede conseguir mediante la optimización de los parámetros de la tracción y la verificación de la forma de la punta bajo el microscopio hasta que la forma deseada. La longitud óptima de la espiga de pipeta depende de la cantidad de deformación esperado: si las deformaciones son pequeñas <10 micras, es suficiente que la parte en forma de cilindro de la pipeta es también relativamente corto (del mismo orden de magnitud), para mayor deformaciones ajustar en consecuencia. En general, al aumentar el calor y / o aumento de la "extracción" disminuye el diámetro de la punta. El aumento de la "atracción" también genera una punta con una puesta a punto más. En nuestros experimentos, utilizando un Sutter P-97 horizontal pipeta extractor, el programa fueoptimizado para los siguientes parámetros: Calor de 473, tire de 22; Velocity 22, Tiempo de presión 200; 500. También es posible crear puntas cilíndricas tirando de un mango muy largo y después de última hora y pulirla. Las instrucciones detalladas de cómo preparar diferentes tipos de las pipetas se indican en el manual de Sutter.
- Microforge: También se recomienda para disparar-pulir la punta de la pipeta para generar una superficie lisa de vidrio que hace un buen sellado a la membrana plasmática. Esto se realiza llevando la punta de la pipeta en la vecindad de una bola de vidrio calentada por un muy una fracción de segundo mediante un microforge. Técnica similar se utiliza rutinariamente para la preparación de microelectrodos para registros electrofisiológicos.
- Llenado de la micropipeta: Micropipetas debe ser llenado con una solución salina fisiológica, tal como PBS o no fluorescentes medio de crecimiento. Es importante destacar que la solución debe ser suplementado con 30% de suero que permitirá la mem célulabrana se mueva suavemente en la pipeta. Dos enfoques se pueden utilizar para deshacerse de las burbujas de aire en la punta de la pipeta de: (i) una punta de la pipeta puede sumergirse en la solución primera para permitir que el líquido a llenar la punta por las fuerzas capilares seguido por el relleno de la pipeta desde el otro extremo o (ii) la pipeta entera puede ser llenado desde el extremo posterior golpeando suavemente sobre el vástago de la pipeta para eliminar las burbujas de la punta.
- Nota: Las pipetas tienen que estar preparados en el día del experimento.
2. Preparación de las células
- Siembra de las células: microaspiración se realiza en células individuales que están o bien se mantiene en suspensión o se unen al sustrato. Para aspirar las células en suspensión, las células se levantan de sus sustratos y se pipeteó en una cámara poco profunda longitudinal que está montada en el microscopio invertido justo antes del experimento. Para aspirar las células del sustrato adjuntos, célulasSe siembran en pequeñas cubres (~ 10 mm de diámetro) que también se puede colocar en la cámara de microaspiración antes del experimento. La razón para utilizar una cámara longitudinal superficial es permitir una micropipeta para acercarse a las células en un ángulo muy bajo, como cerca de la horizontal como sea posible. Esto se hace para permitir que la membrana se detuvo en la micropipeta para ser visualizada en un solo plano de enfoque (véase la figura 2).
- Visualización de membrana celular: Para observar la proyección membrana en la pipeta, las membranas celulares se tiñen con un colorante lipofílico fluorescente, tal como Dil usando un protocolo de tinción estándar.
- Warm solución de PBS.
- Diluir la DII acciones a una concentración de trabajo (5 mM) con la solución de PBS caliente.
- Someter a ultrasonidos durante 5 minutos para romper los agregados de tinte.
- Centrifugue durante 5 minutos y tomar sobrenadante.
- Lavar las células con PBS 3 veces, 5 minutos cada uno.
- Se incuban las células con el tinte de modoción durante 30 minutos en una incubadora a 37 ° C.
- Lavar las células con PBS 3 veces durante 5 min cada uno.
- Nota: Es posible sustituir tinción DII de la membrana con la visualización del citoesqueleto de sub-membrana que también está siendo tirado junto con la membrana en la pipeta. Hay que tener en la cuenta, sin embargo, que las interrupciones en el citoesqueleto puede alterar las propiedades biomecánicas de la célula. Por otra parte, cuando se realizan experimentos con células microaspiración sustrato adjuntos, se recomienda utilizar imágenes 3D para estimar la longitud de la proyección de la membrana en la pipeta que se coloca en un ángulo con el plano focal de las células.
3. Microaspiración y adquisición de imágenes
Equipo: Microscopio fluorescente invertida, preferiblemente con capacidades deconvolución 3D (Zeiss Axiovert 200M con el ordenador controlado Z-eje de movimiento de la objetividades o un equivalente), cámara de vídeo conectada a un ordenador (AxioCam MRM o su equivalente), transductor de presión (BioTek o su equivalente), sin vibraciones estación (TMD o su equivalente), Micromanipulador (Narishige, Sutter, Burleigh o equivalente; manipuladores puede ser mecánico, hidráulico o piezoeléctrico). También es importante destacar que la microaspiración se puede realizar usando un microscopio sin capacidades 3D para estimar la rigidez de las células en suspensión, tales como sangre roja 1,2 células o neutrófilos 3, orgánulos aislados, tales como los núcleos 4 o liposomas artificiales 5.
Imagen de software de adquisición: Zeiss AxioVision o equivalente.
- Montar las células en una cámara de microaspiración, como se describió anteriormente, en un microscopio de fluorescencia invertido. Colocar las células de elegir una celda para un experimento y lo coloca en el centro del campo visual. Es importante perform estos experimentos en un entorno libre de vibraciones, en particular para los experimentos con células adjuntas sustrato porque las vibraciones minutos que típicamente ocurren en bancos y mesas regulares puedan comprometer totalmente la creación del sello, romper la punta de la micropipeta o resultado en cambios significativos en la posición de la punta que se sesgar el análisis de los resultados.
- Colocar una micropipeta llena con PBS / media w / solución de suero en un soporte de pipetas conectado a un transductor de potencia mediante un tubo flexible con el diámetro ajustado al conector del soporte de pipetas para un ajuste apretado. En el comienzo de cada experimento la presión en la pipeta se equilibra con la presión atmosférica. La pipeta está montada en un micromanipulador que permite un control preciso de los movimientos de la pipeta en un rango de micras. Coloque una pipeta en un ángulo bajo de la parte inferior de la cámara y llevar la punta de la pipeta en el centro del campo visual. The vástago de la pipeta, por una parte cilíndrica de la punta de la pipeta en la que se aspira la membrana, está alineado horizontalmente con el plano focal por (1) el posicionamiento de la pipeta en el ángulo más superficial posible (10-15 °) y por (2) flexionar el vástago de la pipeta contra el fondo de la cámara. Debido a que el vástago es muy delgado que es lo suficientemente flexible como para deslizar sobre la parte inferior de la cámara mientras se aproxima a una célula, como se muestra esquemáticamente en la figura 1. Lentamente bajar la micropipeta al lado de una sola célula usando el manipulador curso hasta cerca del plano de enfoque para la célula. Entonces, usando un manipulador fino mover la micropipeta hasta el borde de la celda hasta que la punta de la pipeta toque ligeramente la membrana. Tome una imagen para observar la posición de la pipeta. Buenos sellos se crean cuando la punta del conjunto de la pipeta esté en contacto completo con la superficie de la célula y el contacto es estable. No existe un criterio objetivo fuerte, sin embargo, acerca de lo bueno que el sello es excEPT para el examen visual.
- Aplicar un paso de presión negativa usando el transductor y mantenerlo hasta proyección membrana se estabiliza. La cantidad de presión necesaria para aspirar la membrana a la pipeta varía dependiendo del tipo de célula y condiciones experimentales específicas. En nuestros experimentos, la deformación inicial que se observa normalmente cuando se aplica presión en el intervalo entre -2 a 15 mm Hg. Cuando se aplica la presión, la membrana se deforma gradualmente en la pipeta hasta que se estabiliza a cierta longitud, un proceso que suele tardar 2-3 min. Durante este tiempo, las imágenes de deformación membrana se adquieren cada 30 segundos para realizar un seguimiento de la progresión de la membrana que se tira en la pipeta.
- Aumentar la presión para el siguiente nivel en pasos 2-5 mm Hg y repetir todo el procedimiento hasta que la proyección de membrana se separa de la celda y se mueve dentro de la pipeta, en cuyo punto se detuvo el experimento.
Para cuantificar el grado de deformación de membrana, la longitud de aspirado (L) se mide desde la punta de la pipeta al vértice de la circunferencia de la proyección membrana. Es importante señalar, sin embargo, que una pipeta más grande se aplique más fuerza sobre la membrana celular en el mismo nivel de presión. Para tener en cuenta la variabilidad entre los diámetros de las pipetas, por lo tanto, la longitud de aspirado está normalizado para el diámetro de pipeta (D) medido para cada experimento.
Los datos pueden ser analizados utilizando un estándar de viscoelástica lineal media modelo en espacio de la célula endotelial, como se ha descrito en los estudios anteriores 6,7. Específicamente, el módulo elástico de las células se estimó usando la ecuación:
donde E es el módulo de Young, a es el interiorradio de la pipeta, Ap es la diferencia de presión, L es la longitud correspondiente aspirado, y φ (η) es una pared funcionar calculado utilizando el modelo de fuerza, tal como se describe por Theret et al 7. Es importante señalar que varios modelos han sido utilizados para analizar los datos microaspiración incluyendo un modelo de elementos finitos que se supone que una célula es una esfera deformable con propiedades de material isótropo y homogéneo y modelos de líquido de la gota, que asumen que las células forman una forma esférica, puede deformarse continuamente, y recuperar después de la liberación, como se describe en varias revisiones excelentes: 8-10. Microaspiración también se puede utilizar para investigar otros parámetros biomecánicos de células y tejidos, tales como las propiedades viscoelásticas celulares, tensión cortical y la contribución de los diferentes elementos estructurales a la biomecánica de células y tejidos (véase las revisiones mencionadas anteriormente para obtener más información).
5. RepresentanteResultados
En estudios anteriores, la aspiración de micropipeta se realizó ya sea en liposomas 5 o en las células que no estaban unidas al sustrato 2,11-13. En nuestros estudios, sin embargo, las células se mantienen típicamente unida al sustrato para evitar cambios en la estructura del citoesqueleto que pueden ocurrir cuando las células separar 14-16. Para validar el uso de la técnica para la microaspiración adjuntos sustrato-células, hemos probado si la muestra interrupción de los resultados de F-actina en la disminución de la rigidez celular de las células endoteliales aórticas bovinas (BAECs), según se estimó por este enfoque. Figura 3 que, como se esperaba , este es realmente el caso. Específicamente, la Figura 3A muestra una típica serie de imágenes fluorescentes de una membrana endotelial experimentar deformación progresiva en respuesta a la presión negativa aplicada a través de una micropipeta. Como era de esperar, la membrana es gradualmente aspirado dentro de la pipeta y el aspiratlongitud ed aumenta como una función de la presión aplicada. Los cursos de tiempo de la serie deformación que la interrupción de F-actina aumenta significativamente las longitudes de aspirados de las proyecciones en todas las condiciones de presión (Figura 3B) 14.
Usando este enfoque, hemos descubierto que la rigidez de la célula aumenta cuando se agotan las membranas celulares de colesterol mientras que el enriquecimiento colesterol no tuvo ningún efecto 14. Figura 4 muestra una célula de colesterol enriquecido, una célula de control, y una célula de colesterol-agotada después de alcanzar longitudes máximas de aspiración en -15 mm Hg (4A). Las proyecciones suelen empezar a desarrollarse a-10mmHg y los tiempos de ciclos de deformación membrana se puede medir por las presiones negativas de -10, -15 y -20 mm Hg (4B). La aplicación de presiones por encima de 25 mmHg-resultó en la separación de la proyección aspirada formando una vesícula separado. El nivel de presión que causó el desprendimiento de membrana fue similar bajo diferentes condiciones de colesterol. Esta observación fue sumamente inesperado ya que estudios previos mostraron que en bicapas de lípidos de membrana un aumento en colesterol de la membrana aumenta la rigidez de la membrana de 5,17. Nuestros estudios confirman estas observaciones utilizando varios métodos independientes, incluyendo Microscopía de Fuerza Atómica 18,19 y Microscopía de Fuerza de tracción 20.
Figura 1. Vista lateral esquemática de una pipeta de grabación. La pipeta se tira para generar un vástago cilíndrico en la punta (vista lateral). Parámetros micropipeta: D = 2a = diámetro interno y 2b = ED = diámetro externo.
Figura 2. Micropipeta se aproxima a una celda sustrato de conexión (A) vista lateral esquemática;. (B) Imagen de contraste brillante de un s micropipetaHank tocar una célula típicamente en forma de utilizarse en los experimentos de aspiración; (C) Imagen de fluorescencia de la misma célula marcada con DIIC 18. La micropipeta todavía está presente pero es invisible (De 14).
Figura 3. La validación de la medición de la rigidez de células en adjuntas sustrato células utilizando microaspiración. A: imágenes de deformación progresiva de la membrana BAECs bajo condiciones de control y después de la exposición a latrunculin la pipeta es invisible en las imágenes, ya que no fluoresce.. Las células se expusieron a 2 mM latrunculina A durante 10 min, lo que reduce drásticamente la cantidad de F-actina, medido por fluorescencia de rodamina-faloidina (no se muestra), pero no tuvo ningún efecto significativo sobre la forma de la célula. En una célula latrunculin tratada, existe un adelgazamiento de la membrana en el medio de la proyección aspirado pero el saliente está todavía unido a la cells. B. Efecto de la latrunculina A en los cursos de tiempo de deformación membrana donde L es aspirado longitud de la proyección de membrana y D es el diámetro de la pipeta para las células de control (n = 14) y las células expuestas a 2 latrunculin mu M A durante 10 min (n = 5). Las células se aspiraron con -10 mm Hg (diamantes), -15 mm Hg (cuadrados) y -20 mm Hg (triángulos). (De 14).
Figura 4. Efecto de los niveles de colesterol en la membrana celular de deformación de BAECs. A. Imágenes típicas de deformación de la membrana de colesterol enriquecido, colesterol empobrecido y control de las células (células de control fueron expuestas a MβCD: MβCD-colesterol mezcla en proporción de 1:1 que no tuvo efecto sobre el nivel de colesterol libre en las células (véase recuadro). Las imágenes mostradas representan la deformación máxima a -15 mm Hg. La flecha indica la posición de la proyección aspirado. La barra es de 30 m. B. Promedio de tiempo de ciclos de longitudes de aspiración para las tres poblaciones de células experimentales. C. Máximas longitudes aspirados gráficamente como una función de la presión aplicada. La longitud máxima normalizada en células agotadas fue significativamente menor que la de las células de control para presiones de -15 mm Hg y -20 mm Hg (P <0,05). (De 14).
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Discussion
Microaspiración proporciona un método simple y altamente reproducible para estimar la rigidez de células / deformabilidad mediante la aplicación de presión negativa a una membrana celular y la medición de la deformabilidad de la membrana en respuesta a la presión bien definida. Fue desarrollado por primera vez por Mitchison y Swann (1954) para caracterizar las propiedades elásticas de los huevos de erizo de mar para proporcionar información sobre los mecanismos de la división celular 21 y luego de ver las propiedades mecánicas de las células rojas de la sangre 1. Este método se ha utilizado en varios estudios para evaluar las propiedades biomecánicas de los diversos tipos de células (por ejemplo, 2,3,12,13). Nuestros estudios recientes extendido este método para estimar la rigidez del sustrato de células conectadas mediante la combinación de microaspiración con imágenes en 3D 14,15,22. La rigidez y la elasticidad de la membrana proporcionar información crítica sobre el fenotipo celular y cómo las células responden a un entorno dinámico, en particular a una variedad de pista mecánicos que se generan por las fuerzas hemodinámicas del flujo sanguíneo o cambiando las propiedades viscoelásticas de la matriz extracelular. De hecho, estudios anteriores han demostrado que la célula aumenta la rigidez en respuesta a la tensión de cizallamiento de fluido 13,23 y como una función de la rigidez del sustrato 16,24. Los cambios en la rigidez de la célula se espera que tengan un impacto importante en mechanosensitivity celular y mecanotransducción. Específicamente, hemos demostrado recientemente que un aumento de la rigidez endotelial facilita su sensibilidad a fluir 25. También hemos demostrado que la rigidez endotelial se asocia con un aumento en su 22 potencial angiogénico. Además, una disminución en la rigidez de la membrana y la viscosidad caracterizar proliferativas última etapa de células de cáncer de ovario que indican que estas propiedades pueden ayudar a diferenciar la fase temprana frente a un fenotipo agresivo maligno 26.
Rigidez Célula de medida también puede Provide ideas importantes en la estructura y la organización del citoesqueleto. Un factor clave en la determinación de la rigidez de la célula es el citoesqueleto sub-membrana, particularmente F-actina 6,14. Cambios en la rigidez de células también puede reflejar citoesqueleto reordenación en respuesta a diferentes eventos de señalización, tales como la activación de Rho GTPasas-27, un importante mecanismo que par entre la membrana y el citoesqueleto 28. Además, los cambios en la rigidez de la célula se puede detectar incluso cuando no hay cambios obvios en la estructura de las redes del citoesqueleto se observan 14 lo que sugiere que este enfoque es más sensible a los cambios sutiles en la estructura del citoesqueleto que la visualización de las redes.
En términos de enfoques alternativos, microaspiración ofrece una alternativa útil y barata de Microscopía de Fuerza Atómica (AFM) que se utiliza típicamente para medir la rigidez celular 29,30. En contraste con AFM que mide membra localesrigidez ne, microaspiración proporciona una medida global de la deformabilidad de una célula. Otros métodos para estimar celulares propiedades biomecánicas incluyen diversos enfoques de talón / partícula, tales como la citometría de torsión magnético 31-33, 34,35 rastreo de partículas, así como varios otros enfoques, tales como cytoindenter, un método que es algo similar a la AFM 36 y pinzas ópticas 37. Mientras que el análisis comparativo detallado de estas técnicas está más allá del alcance de este manuscrito, las principales diferencias entre ellos y microaspiración son los siguientes: (i) la citometría de torsión magnética implica la aplicación de una fuerza externa a un cordón unido a la superficie de las células para provocar la deformación local de la membrana en el sitio donde el talón se adjunta que es más importante para determinar la respuesta de rigidización fuerza inducida por 31, (ii) el rastreo de partículas se puede utilizar para diferentes propósitos, tales como la estimación de la fuerza que ejercen sobre las células de la substtasa (Microscopía de Fuerza de tracción) 34 o estimar la rigidez de los internos "profundas" capas de la célula mediante el análisis del movimiento de las perlas o los orgánulos dentro de la célula 35. En contraste, tweezesrs ópticas se utilizan para tirar de la membrana de nanotubos (correas) para estimar la tensión y la membrana cortical del citoesqueleto-adhesión 37. Un método alternativo para tirar de los amarres de membrana es utilizar el AFM, un método que tiene similitudes y diferencias importantes en comparación con las pinzas ópticas 18,38. La ventaja de la mayoría de estos métodos es que pueden proporcionar información detallada espacial de las propiedades biomecánicas de las células individuales. Sin embargo, todas estas técnicas requieren o bien un equipo muy costoso o paquetes de software sofisticado y no están fácilmente disponibles. La fuerza de la microaspiración, por otra parte, es que es una buena como otros métodos de proporcionar resultados cuantitativos y diferenciar entre modelo mecánico específicos de la célula sin el requisito del equipo altamente especializado o software. En resumen, si bien existen múltiples enfoques para evaluar las propiedades biomecánicas de las células y tejidos, microaspiración sigue siendo un enfoque útil y poderosa para investigar la biomecánica celulares.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sutter pipette puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| Microforge | Narishige | MF-830 | |
| Inverted Fluorescent Microscope | Zeiss | Axiovert 200M | The microscope should be preferably equipped with 3D/deconvolution capabilities. |
| Videocamera | Zeiss | AxioCam MRm | |
| Image Acquisition sotware | Zeiss | AxioVision | |
| Pneumatic Pressure Transducer | BioTek | DPM-1B | DPM1B Pneumatic Transducer Tester can now be found by FLUKE. |
| Pipette glass | Richland | Customized glass | Pipettes were customized with a 1.2 inner diameter and 1.6 outer diameter. |
| DiI Dye | Invitrogen | D282 | Dissolves well in DMSO |
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