Summary
Spectral karyotypering (SKY) är en avancerad cytogenetik teknik för att identifiera genetiska och kromosomavvikelser. Denna teknik utnyttjar prober kromosom målning, som tillåter klassificering av alla kromosomer. SKY kan också identifiera komplexa kromosomförändringar och brister segregation hos möss och människor med olika sjukdomar, däribland polycystisk njursjukdom.
Abstract
Konventionell metod att identifiera och sekretessbelägga individuella kromosomer beror på det unika banding mönster av varje kromosom i en specifik art kan som analyseras 1, 2. Denna klassiska ränder teknik är dock inte tillförlitlig att identifiera komplexa kromosomförändringar såsom de som förknippas med cancer. För att övervinna begränsningarna i ränder tekniken är Spectral karyotypering (SKY) infördes för att ge mycket tillförlitlig information om kromosomavvikelser.
SKY är en flerfärgad fluorescens in-situ-hybridisering (FISH) teknik för att detektera metafaskromosomer med spektral mikroskop 3, 4. SKY har visat sig vara ett värdefullt verktyg för cytogenetisk analys av ett brett spektrum av kromosomavvikelser i samband med ett stort antal genetiska sjukdomar och maligniteter 5, 6. SKY involverar användningen av multicolor fluorescensmärkt-märkta DNA-prober beredda från de degenererade oligonucleotide primrar genom PCR. Sålunda, har varje kromosom en unik spektral färg efter in-situ-hybridisering med sonder, vilka är differentiellt märkta med en blandning av fluorescerande färgämnen (Rodamin, Texas Red, Cy5, FITC och Cy5.5). De sönder som används för Sky bestå av upp till 55 kromosom specifika sönder 7-10.
Förfarandet för Sky involverar flera steg (Figur 1). SKY kräver tillgänglighet av celler med hög mitotiska indexet från normal-eller sjuk vävnad eller blod. Kromosomerna av en enda cell från antingen en färsk isolerad primär cell eller en cellinje är spridda på ett glas objektglas. Denna kromosom spreaden är märkt med en annorlunda kombination av fluorescerande färgämnen specifika för varje kromosom. För sond detektion och image förvärv, består den spektrala bildgivande system av Sagnac-interferometer och en CCD-kamera. Detta möjliggör mätning av det synliga ljuset som avges från provet och att få en spektral bild tillbakam enskilda kromosomer. HiSKY ger den programvara som används för att analysera resultaten av tagna bilder, en enkel identifiering av kromosom avvikelser. Slutresultatet är en metafas och en karyotyp klassificering bild, i vilken varje par av kromosomer har en distinkt färg (Figur 2). Detta möjliggör enkel identifiering av kromosom identiteter och flyttningar. För mer information, besök Applied Spectral Imaging webbplats ( http://www.spectral-imaging.com/ ).
SKY användes nyligen för en identifiering av defekter kromosomsegregering och abnormiteter kromosom hos människor och möss med autosomal dominant polycystisk njursjukdom (ADPKD), en genetisk sjukdom som kännetecknas av dysfunktion i primär cilia 11-13. Med hjälp av denna teknik visade vi närvaron av onormala kromosom segregation och kromosomala defekter i ADPKD patienter och modeller mus 14. Ytterligare analyser använder SKY inte bara möjligt för oss att identifiera kromosomala antal och identitet, men också att noggrant detektera mycket komplexa kromosomförändringar såsom kromosom deletioner och flyttningar (figur 2).
Protocol
1. Cell förbehandling och metafas förberedelser
- Cellerna odlas i Dulbeccos Modifikation av Eagles Medium (DMEM) innehållande 10-15% fetalt bovint serum (FBS) och 1% penicillin / streptomycin vid 37 ° C med 5% CO-2 inkubator, tills de når 70-80% konfluens.
- Behandla cellerna som fått kolcemid-lösning vid 0,05 | ig / ml under 30-60 min.
- Samla in den medium som innehåller eventuella flytande-celler i 50-ml sterila falcon centrifugrören. Skölj de celler på plattan med sterile1X-PBS. Efter att ha inkubera med steril trypsin under 1-2 min, skörd och samla in de kvarvarande cellerna in i den samma rör.
- Snurra rören vid 1000 rpm under 5 min, aspirera den överstående lämnande 0,5 ml och lossa pellet genom snärta med finger bara.
- Beroende på den pelleten storlek, tillsätt 5-10 ml av hypoton lösning av 0,56% KCl i dH 2 O och inkubera suspensionen vid 37 ° C under 30-45 min.
- Tillsätt en droppe av metanol / ättiksyra(3:1 vol / vol) per ml av hypoton cellsuspension och invertera röret försiktigt för blandning.
- Centrifugera vid 1200 rpm under 5 min och samla in pelleten som steg 1,4, tillsätt sedan 5 ml av färsk metanol / ättiksyra (3:1 vol / vol) fixativ-lösning droppvis medan snärta den pelleten kontinuerligt. Denna procedur är kritisk så att de metafas-spreadarna inte kommer att infångas i de cellernas klumpar som skulle äventyra experimentet.
- Centrifugera återigen vid 1200 rpm under 5 min och tillsätt 5-10 ml av is-kall metanol / ättiksyra fixativ längs väggen av röret. I detta skede, om så det behövs, kan de celler att lagras i fixativ lösning i en åtdragna och förseglades röret vid -20 ° C under kort sikt eller -80 ° C för lång sikt (år) för framtida användning.
- Rena bilder i absolut etanol, sedan doppa bilden i dH 2 O för approximately10X för att bilda ett hölje av vatten på ytan av bilden. Placera bilden på en glasplatta och drop 15-20 pl cellsuspension (från steg 1,8) Från 10 "ovanför den objektglaset. Placera objektglaset i ett vattenbad inställd vid 65-70 ° C under 1-2 min och låt dem torka.
- Kontrollera bilden under ett ljusmikroskop 10X och 40X torra mål gör att det finns metafaskromosomer och sprider jämnt fördelade. Kontrollera om cytoplasman närvaro omger kromosomerna. Om cytoplasman är närvarande fortsätta med slide förbehandling (pepsin matsmältning), om ingen cytoplasma är närvarande och kromosomerna har god morfologi, då finns det inget behov av bild förbehandling.
2. Skjut förbehandling (pepsin behandling)
- Applicera 120 pl 1:200 RNas lösning (20 mg / ml) löst i 2X-SSC på en 24 mm x 60 mm mikroskop täckglas och invertera metafas bilden nedåt på täckglas sedan försiktigt vändas upp metafas bilden uppåt och inkubera vid 37 ° C under 45 min.
- Ta försiktigt bort täckglas utan att repa glaset och tvätta i 2X-SSC buffert i ett Coplin var 5 min under 15 minmed skakning.
- Tillsätt 5-15 | il av pepsin stamlösning (100 mg / ml i dH 2 O-) till en ren bägare och tillsätt sedan 100 ml förvärmd (37 ° C), 0,01 M HCI. Det är viktigt att den pepsin tillsätts in i en ren bägare 1:a och inte direkt in i den HCl-lösning, annars skulle det inte lösas upp i lösning. Inkubera den objektglaset i en coplinkärlet innehållande den HCl-/ pepsinet-lösning vid 37 ° C under 3-5 minuter. Det här steg är mycket kritisk som alltför mycket digerering kommer att orsaka de kromosomerna som skall overdigested och för lite digerering kommer att lämna den cytoplasman osmält som kan leda till icke-specifik bindning av sonden och interferera med den hybridiseringen signalen.
- Tvätta den objektglaset i en coplinkärlet innehållande 100 ml 1X-PBS under 5 minuter två gånger vid rumstemperatur.
- Tvätta den objektglaset i en coplinkärlet innehållande 100 ml 1X-PBS/MgCl 2 för 5 min vid rumstemperatur (50 ml av 1 M MgCl 2 i 950 ml av 1X-PBS).
- Placera objektglaset i ett coplinkärlet containing. 100 ml 1% formaldehyd under 10 min vid rumstemperatur (1,7 ml av 37% formaldehyd i 100 ml av 1X-PBS/MgCl 2).
- Tvätta den objektglaset i en coplinkärlet innehållande 100 ml 1X-PBS under 5 min.
- Observera bilden under ett ljusmikroskop 40X torr lins för att se till att bilderna smälts korrekt och ingen cytoplasma är närvarande och kromosomen morfologin bevaras. Välj ett område för hybridisering med en diamant penna.
3. Kromosom och sond denaturering och hybridisering
- Förbereda färsk denaturerande-lösning (70% formamid/2X SSC-, pH 7,0) och Förvärm till 70-80 ° C i en coplinkärlet placerades i ett vattenbad Lägg ut den objektglaset i den coplinkärlet innehållande den denaturerande lösningen i ett vattenbad vid 70 ° C under muskromosomer och 80 ° C under humana kromosomer för 30s-1,5 min.
- Placera omedelbart objektglaset i iskall 70% etanol i 3 minuter följt av 80% och 100% etanol i 3 minuter vardera och lufttorka. Undersök bildenför kromosom morfologi. Bra kromosom morfologi betecknas av mörka kromosomer och inte "fas-ljus" eller halo kromosomer.
- Till uppvärmningen av SkyPaint sonden (LUFTRUMMET målarfärg-kit; injektionsflaska # 1) vid 37 ° C med skakning under 20 min, vortex-och centrifugera kortvarigt vid 1000 varv per minut under i några sekunder.
- Denaturera den sonden i en termocykler programmerad för en två-steg cykel vid 85 ° C under 5 min cykel följt av 37 ° C under 60 min för att tillåta märkt-prob DNA för preannealing.
- Applicera 10 pl av det denaturerade sonden på det område av hybridisering och täck med ett 22 mm x 40 mm täckglas att se till att inte fånga luftbubblor. Försegla de kanterna på den täckglas med gummi cement och inkubera i en befuktad kammare vid 37 ° C under 48-72 timmar.
4. Fluorescerande sond detektion
- Ta bort täckglas försiktigt och placera bilden i ett Coplin innehåller förvärmd (45 ° C) tvättlösning I (nygjord 50% formamid i 2X SSC). Tvätta 5 minutertre gånger vid 45 ° C i ett skakvattenbad vid 45 varv per minut
- Tvätta den diabild i tvättning lösning II (1X SSC) vid 45 ° C under 5 min två gånger med skakning.
- Tvätta den objektglaset i tvättlösning III (4X SSC/0.1% Tween 20) under 5 min vid 45 ° C med skakning.
- Tillämpa 80 il av blockerande reagens (LUFTRUMMET målarfärg-kit; injektionsflaska # 2), placera en täckglas och inkubera vid 37 ° C under 30 min.
- Avlägsna den diabilden och tillåta fluiden att dränera. Applicera 80 pl Cy5 färgning reagens (Koncentrerad antikroppsdetektion CAD set, flaska # 3), tillämpa ett täckglas och inkubera vid 37 ° C i 40 minuter.
- Tvätta den objektglaset med sköljlösningen III vid 45 ° C under 5 min tre gånger med skakning.
- Applicera 80 pl Cy5.5 färgning reagens (Koncentrerad antikroppsdetektion CAD set, flaska # 4), placera en täckglas och inkubera vid 37 ° C i 40 minuter.
- Tvätta den objektglaset med sköljlösningen III vid 45 ° C under 5 min tre gånger med skakning.
- Luta den diabilden och tillåta fluiden att dränera. Applicera 20 pl av anti-fade DAPI reagens (SKY färg kit, flaska # 5) och placera en 24 mm x 60 mm mikroskop täckglas. Ta försiktigt bort luftbubblor som kan ha bildats. Objektglasen kan avbildas omedelbart eller lagras vid 4 ° C i mörker för inget längre tid än 1 vecka.
5. Bild och analys
- Bild förvärv åstadkommes genom att som tittar på metafas-objektglasen som använder en Olympus mikroskop utrustat med en 60X oljeimmersion lins, en Spectral kub (beställnings-som planläggs trippel-bandet pass filtret), en DAPI-filter och en Sagnac-interferometer modul med en CCD-kamera.
- Spektrala-karyotypes utfördes med hjälp av Sky View mjukvara (Applied spektrala avbildning version 1,62) efter bruksanvisningen.
- Efter att ha analyserat bilder kan kromosomer ses som färgbilder (med särskilda fluorescerande färger), pseudo färgbilder (med färger för klassificering) och inverterade DAPI bilder (specifik ränder mönster).
En fullständig SKY proceduren tar vanligtvis ungefär en vecka tid (figur 1). Detta inkluderar bild förvärv och analys förutsatt att metafas cellerna finns i tillräcklig försörjning. Karyotypering analys avslöjar normalt mus-karyotyp (40, XY-) av celler från möss av vildtyp (Figur 2a). I motsats, celler från PKD1 - visar musen (PKD musmodell) en betydande ökning av antalet kromosomer och strukturella avvikelser, som kromosom deletioner (kromosom # 8) och flyttningar (kromosomer # 11 och 19) (figur 2b) - /. Vi analyserade också vaskulära vävnader från ADPKD patienterna. En enkel undersökning genom att räkna kromosomala siffrorna visade att icke-ADPKD och några ADPKD vaskulära prover hade normala kromosomala antal 23 par (figur 2c). I allmänhet är dock observerade vi misslyckas kromosomal segregation, vilket resulterar i 46 par kromosomer i ADPKD prover i stället för 23 par (figur 2d).
Klura 1. SKY protokollet flödesschema. Flödesschema av SKY protokollet visar steg för att slutföra ett experiment med utgångspunkt från cellen förbehandling och förberedelser metafas till bild och analys. En ungefärlig en vecka tidslinje presenteras på vänster med steg-för-steg-anvisningar för varje dag.
Siffra 2. Spectral karyotypering på odödliga muscellinjer och nyligen isolerade humana primära celler. Färg och inverterade DAPI bilder av enskilda kromosomer visas innan kromosomala sortering. Efter sorteringen är kromosomer presenteras i "klassificeringen" tabellen. A) Sky bild av en metafasspridning från vildtyp möss innehåller normal karyotyp (40, XY).) B PKD1 - / -. mus visar onormalt kromosom nummer (68 istället för 40) och avvikelser kromosom som kromosom deletioner (kromosom # 8) och flyttningar kromosom (kromosom # 11 och 19) c) SKY bild av en metafasspridning från kärlvävnad av en icke-ADPKD patienten har normal karyotyp (46, XX). d) Sky bild av en metafasspridning från kärlvävnaden en ADPKD patientens innehåller onormalt karyotyp (92, XXXX). Delar av uppgifterna har tidigare rapporterats och återanvändas med tillstånd 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Spectral karyotypering (SKY) är en cytogenetik teknik som används för att studera genetiska och kromosomala kompositioner. Denna teknik tar fördel av prober kromosom målning, och detekteringen av dessa sönder är förvärvats genom en Sagnac-interferometer. Den kompletta SKY tar vanligen cirka en vecka och det innebär flera viktiga steg (figur 1). SKY använder ett standardprotokoll, som först beskrevs av Padilla-Nash et al 3. Protokollet har sedan dess anpassats genom olika cytogenetik laboratorier, inklusive vår.
Bland de viktigaste stegen i protokollet, är en god kvalitet i metafas förberedelser oerhört viktigt att ha en lyckad SKY analys. Till exempel, om kromosomerna har för mycket cytoplasma eller om de objektglasen är för gamla, kunde av kvaliteten på de bilderna komma att äventyras. Som framgår av vår film klipp, kan innehållet i cytoplasman lätt identifieras med hjälp av en hög upplösning på differentialinterferens kontrast mikroskopi teknik. Som tillägg, är tillgängligheten av aktivt delande celler en förutsättning för LUFTRUMMET analys; det här inlägget kan övervinnas genom behandling med kolcemid för en längre tid eller en tillsats av andra tillväxtfaktorer vare de cellerna. Den totala andelen framgångsrika SKY är till stor del beroende av den kompetens och erfarenhet hos användaren.
SKY erbjuder ett kraftfullt och pålitligt verktyg för kromosomanalys, inklusive strukturella förändringar i ett enda kromosom. Förutom cellulär polyploidi erbjuder SKY en möjlighet att studera kromosom infogningar, borttagningar och dubbelarbete och flyttningar. Till exempel ger SKY identifiering av nya och dolda kromosomavvikelser och identifiering av komplexa omdisponeringar under utvecklingen av cancer och progression 15. Dessutom har SKY använts på ett forskningsområde inom jämförande cytogenetik, som studerar kromosomala omflyttningar under evolutionen 4. Med användning av SKY Tekniken, Vårt laboratorium blir de första att identifiera kromosomavvikelser hos möss och människor med polycystisk njursjukdom (figur 2). Det råder ingen tvekan om att Sky kommer vara till nytta i många andra kromosomala associerade sjukdomar. I själva verket föreslår vi att Sky också skulle vara användbar i många cilier-relaterade patogenes, där cilier har visat att reglera celldelning 14.
Eftersom mus och råtta är viktiga djurmodeller för att studera mekanismen för en sjukdom och att utföra en funktionell bedömning in vivo, utveckling av mus och råtta prober för SKY analys har gjort rutin karyotypering av mus och råtta kromosomer. För närvarande är SKY därför begränsad till kromosomala studier i människa, mus och råtta. Men eftersom fler forskningslaboratorier använda andra arter för att studera genomiska kompositioner kan man förutse att fler kromosom målning prober för olika organismer snart kommer att finnas kommersiellt tillgänglig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Brian Muntean, Shao Lo, Maki Takahashi och Blair Mell för deras tekniskt bistånd. Detta arbete stöddes av utmärkelser från NIH (DK080640) och University of Toledo & ProMedica translationell forskning stimuleras Award till Dr Surya Nauli.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Cellgro | 10-013-CV | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30088-03 | |
| Penecillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SV30010 | |
| Colcemid | Roche Group | 10 295 892 001 | 10 μg/ml |
| HCl | Fisher Scientific | A144-500 | |
| KCl | Fisher Scientific | S77375-1 | |
| Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30256-01 | |
| SKY paint probe kit (Human) | Applied Spectral Imaging | SKY000028 | |
| SKY paint probe kit (Mouse) | Applied Spectral Imaging | SKY000030 | |
| Concentrated antibody detection kit | Applied Spectral Imaging | SKY000033 | |
| Trypsin | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30236.01 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A433P-4 | |
| Acetic acid | Fisher Scientific | A38-212 | |
| RNase A | Roche Group | 10 109 169 001 | |
| Pepsin | Sigma-Aldrich | P6887-5G | |
| MgCl2 | Fluka | 63069-500ML | |
| 37% Formaldehyde | Mallinckrodt Baker Inc. | 2106-02 | |
| 20X SSC | Promega Corp. | V4261 | |
| Formamide | Fluka | 47671 | prepare just before use |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Microscope glass slides | Fisher Scientific | 12-549 | |
| Microscope cover glass 24x60mm | VWR international | 16004-312 | |
| Rubber cement | Elmer’s | ||
| Hybridization/ humidifiedchamber/Tray | Simport | M920-2 | put wet paper towels at the bottom |
| Thermocycler | Eppendorf | Epgradient S | |
| Shaking platform/Orbital shaker | Bellco Glass | ||
| Shaking/water bath | Precision Scientific | ||
| DAPI filter cube | Chroma Technology Corp. | ||
| SKY filter cube | Chroma Technology Corp. | ||
| SpectraCube | Applied Spectral Imaging | ||
| Inverted cell culture microscope | Nikon Instruments | Nikon Eclipse TS100 | |
| Fluorescence microscope | Olympus Corporation | IX70 | 60X oil |
References
- Caspersson, T., Farber, S., Foley, G. E., Kudynowski, J., Modest, E. J., Simonsson, E., Wagh, U., Zech, L. Chemical differentiation along metaphase chromosomes. Experimental Cell Research. 49, 219-222 (1968).
- Seabright, M. A rapid banding technique for human chromosomes. Lancet. 2, 971-972 (1971).
- Padilla-Nash, H. M., Barenboim-Stapleton, L., Difilippantonio, M. J., Ried, T. Spectral karyotyping analysis of human and mouse chromosomes. Nature Protocols. 1, 3129-3142 (2006).
- Schrock, E., Zschieschang, P., O'Brien, P., Helmrich, A., Hardt, T., Matthaei, A., Stout-Weider, K. Spectral karyotyping of human, mouse, rat and ape chromosomes--applications for genetic diagnostics and research. Cytogenetic and Genome Research. 114, 199-221 (2006).
- Padilla-Nash, H. M., Heselmeyer-Haddad, K., Wangsa, D., Zhang, H., Ghadimi, B. M., Macville, M., Augustus, M., Schrock, E., Hilgenfeld, E., Ried, T. Jumping translocations are common in solid tumor cell lines and result in recurrent fusions of whole chromosome arms. Genes, Chromosomes & Cancer. 30, 349-363 (2001).
- Veldman, T., Vignon, C., Schrock, E., Rowley, J. D., Ried, T. Hidden chromosome abnormalities in haematological malignancies detected by multicolour spectral karyotyping. Nature Genetics. 15, 406-410 (1997).
- Karpf, A. R., Matsui, S. Genetic disruption of cytosine DNA methyltransferase enzymes induces chromosomal instability in human cancer cells. Cancer Research. 65, 8635-8639 (2005).
- Matsui, S., Faitar, S. L., Rossi, M. R., Cowell, J. K. Application of spectral karyotyping to the analysis of the human chromosome complement of interspecies somatic cell hybrids. Cancer Genetics and Cytogenetics. 142, 30-35 (2003).
- Nestor, A. L., Hollopeter, S. L., Matsui, S. I., Allison, D. A model for genetic complementation controlling the chromosomal abnormalities and loss of heterozygosity formation in cancer. Cytogenetic and Genome Research. 116, 235-247 (2007).
- Ried, T., Liyanage, M., du Manoir, S., Heselmeyer, K., Auer, K., Macville, M., Schrock, E. Tumor cytogenetics revisited: comparative genomic hybridization and spectral karyotyping. Journal of Molecular Medicine (Berlin, Germany). 75, 801-814 (1997).
- AbouAlaiwi, W. A., Takahashi, M., Mell, B. R., Jones, T. J., Ratnam, S., Kolb, R. J., Nauli, S. M. Ciliary polycystin-2 is a mechanosensitive calcium channel involved in nitric oxide signaling cascades. Circulation Research. 104, 860-869 (2009).
- Nauli, S. M., Alenghat, F. J., Luo, Y., Williams, E., Vassilev, P., Li, X., Elia, A. E., Lu, W., Brown, E. M., Quinn, S. J., Ingber, D. E., Zhou, J. Polycystins 1 and 2 mediate mechanosensation in the primary cilium of kidney cells. Nature Genetics. 33, 129-137 (2003).
- Nauli, S. M., Kawanabe, Y., Kaminski, J. J., Pearce, W. J., Ingber, D. E., Zhou, J. Endothelial cilia are fluid shear sensors that regulate calcium signaling and nitric oxide production through polycystin-1. Circulation. 117, 1161-1171 (2008).
- AbouAlaiwi, W. A., Ratnam, S., Booth, R. L., Shah, J. V., Nauli, S. M. Endothelial cells from humans and mice with polycystic kidney disease are characterized by polyploidy and chromosome segregation defects through survivin down-regulation. Human Molecular Genetics. 20, 354-367 (2011).
- Padilla-Nash, H. M., Nash, W. G., Padilla, G. M., Roberson, K. M., Robertson, C. N., Macville, M., Schrock, E., Ried, T. Molecular cytogenetic analysis of the bladder carcinoma cell line BK-10 by spectral karyotyping. Genes, Chromosomes & Cancer. 25, 53-59 (1999).
